专利名称：壳聚糖微球固定化木瓜蛋白酶的制备的制作方法
发明涉及生物技术领域，尤其涉及壳聚糖微球固定化木瓜蛋白酶的制备。
甲壳素又名甲壳质、几丁质，学名为聚-2-乙酰氨基-2-脱氧-D-β-1，4-葡萄糖。甲壳素在自然界中资源十分丰富，主要来源于节肢动物、软体动物、环节动物、原生动物、腔肠动物、海藻及真菌等生物体中，每年在地球上的自然生成量就达数十亿吨之多。壳聚糖又名脱乙酰甲壳素、可溶性甲壳素，学名为聚-2-氨基-2-脱氧-D-β-1，4-葡萄糖，它是甲壳素中最重要的衍生物。近年来，壳聚糖作为固定化载体的研究引起了很多学者的重视。由于壳聚糖分子中的氨基对各种蛋白质的亲和力非常高，可以有效地应用于酶的固定化技术中。但若以天然壳聚糖为载体固定化酶，其主要缺陷是在偏酸条件下发生溶解，使固定化酶难以回收，其中大部分为粉末状，载体流速差，表面积小，限制其应用，特别是在反应器中的应用。因此目前的国内外研究主要集中在制备壳聚糖微球作为固定化酶载体，该载体具有性能优良具有耐酸耐碱性能好、吸附性能较强、单分散窄分布微球状等特性，从而克服了上述缺陷，是酶固定化的良好载体。木瓜蛋白酶(Papain，EC 3.4.22.2)是一种巯基蛋白酶，是由木瓜乳经提炼而得的一类蛋白水解酶，被广泛应用于防止啤酒冷浑浊、肉类的嫩化、糕点的膨化剂、羊毛的防缩、蛋白质水解产物的制备、牙膏、冷霜及洗涤剂等日化工业及辅助消化药物等。为了提高木瓜蛋白酶的使用效率，降低生产成本，国内外研究人员对木瓜蛋白酶的固定化进行了很多研究，建立了许多固定化方法。但研究主要集中在以尼龙、甘蔗渣纤维素、甲壳素或壳聚糖等作为酶固定化载体，采用吸附法或交联法固定化木瓜蛋白酶，由于载体形状的不规则性、固定化酶的活力回收率普遍较低(36％～51％)及固定化酶对底物的亲和力低等不足之处限制了固定化木瓜蛋白酶的应用。以壳聚糖微球为固定化酶载体，用吸附-交联法固定木瓜蛋白酶未见有报道。
本发明的目的在于进一步开发利用壳聚糖的应用价值、拓宽壳聚糖微球这一优良的酶固定化载体的应用潜力、提高木瓜蛋白酶的使用效率、降低固定化木瓜蛋白酶的生产成本、提高木瓜蛋白酶的应用价值及提供一类新型的固定化木瓜蛋白酶，即壳聚糖微球固定化木瓜蛋白酶。
本发明以壳聚糖为原料，用醋酸溶液将壳聚糖完全溶解得壳聚糖酸性溶胶，壳聚糖与醋酸溶液的比例是2～5∶45～100(重量与体积比)，然后在搅拌条件下将壳聚糖酸性溶胶滴入分散介质透平油中，壳聚糖酸性溶胶与透平油的体积比为1∶2～5，待溶胶均匀分散后，滴入不低于25％的戊二醛溶液，壳聚糖酸性溶胶与25％的戊二醛溶液的体积比是20～30∶1，搅拌10～20分钟后，再用NaOH溶液将其pH调至9～10，于60～70℃水浴保温3～5小时，静置冷却后，弃去上层油层，在下层的固形物中先加入石油醚(I)与多余的透平油互溶，又弃去上层，然后在下层固形物中加入丙酮与剩下的透平油互溶，再弃去上层，然后用无水乙醇抽洗固形物至透平油完全洗净，真空干燥、过60～100目筛，用蒸馏水抽洗除去石油醚(I)、丙酮及无水乙醇，并真空干燥，即得到固定化酶的载体一壳聚糖微球。接着将壳聚糖微球在pH7.2的磷酸缓冲液中浸泡12～24小时，抽干。将抽干后的壳聚糖微球加入浓度为1～2.5mg/mL的木瓜蛋白酶溶液中，壳聚糖微球与木瓜蛋白酶溶液的比例是0.5～1∶0.6～2(重量与体积比)，于4～40℃吸附4～24小时后，加入0.3～1.5％的戊二醛溶液，使戊二醛溶液与总溶液的最终体积比为0.2～1.0∶100，于4～40℃交联1～5小时，再用pH7.2的磷酸缓冲液洗去多余的戊二醛溶液并吸干，即制得壳聚糖微球固定化木瓜蛋白酶。
壳聚糖微球固定化木瓜蛋白酶的特性对照附图加以说明。附
图1为壳聚糖微球固定化木瓜蛋白酶的电镜照片(338×)，照片显示壳聚糖微球固定化木瓜蛋白酶是粒径范围在42～70μm的红棕色微球。附图2为给酶量对酶固定化效果的影响，该图显示在制备过程中，若恒定其它条件，当每克壳聚糖微球的给酶量为1.92mg时，固定化酶的酶活力达36.31U/g载体，固定化酶的酶活力回收率为最高，达65.35％；附图3为吸附时间对酶固定化效果的影响，从图中可以看出当吸附时间达到12小时，固定化酶的酶活力与酶活力回收率均达到最大值，分别为38.00U/g载体和65.70％；附图4为吸附温度对酶固定化效果的影响，该图显示当吸附温度为4～8℃时，固定化酶的酶活力与酶活力回收率分别为36.73U/g载体和63.45％，均达到最大值；附图5为戊二醛浓度对酶固定化效果的影响，该图显示当戊二醛溶液的最终浓度为0.5％时，固定化酶的酶活力与酶活力回收率均达到最大值，分别为38.58U/g载体和66.74％；附图6为交联时间对酶固定化效果的影响，该图显示当戊二醛交联时间为3小时，固定化酶的酶活力与酶活力回收率均达到最大值，分别为38.90U/g载体和67.25％；附图7为交联温度对酶固定化效果的影响，该图显示当戊二醛交联温度为4～8℃时，固定化酶的酶活力与酶活力回收率均达到最大值，分别为36.73U/g载体和63.45％。综上所述，在以上最佳固定化条件下制备壳聚糖微球固定化木瓜蛋白酶，其酶活力为36～39U/g载体，平均达到38.49U/g载体，酶活力回收率为62～68％，平均达到66.60％。附图8为溶液酶和固定化酶的米氏常数，图中显示壳聚糖微球固定化木瓜蛋白酶的表观米氏常数Kmapp(酪蛋白)为0.055％；附图9为溶液酶和固定化酶的最适pH值，图中显示壳聚糖微球固定化木瓜蛋白酶的最适pH为8.0；附
图10溶液酶和固定化酶的pH稳定性，图中显示壳聚糖微球固定化木瓜蛋白酶的pH稳定性在7.0左右；附
图11为溶液酶和固定化酶的热稳定性，图中显示壳聚糖微球固定化木瓜蛋白酶的热稳定性在15～35℃范围内；壳聚糖微球固定化木瓜蛋白酶的操作半衰期为25d。
本发明充分利用壳聚糖微球这一固定化酶载体的良好特性，特别是形状均一、表面积大、良好的吸附性能等，用吸附-交联法固定化木瓜蛋白酶，从而为发明壳聚糖微球固定化木瓜蛋白酶提供了良好的前提条件。本发明的特点壳聚糖微球固定化木瓜蛋白酶形状均一，表面积大；酶活力回收率平均达到66.6％；与溶液酶相比，固定化酶对底物(酪蛋白)的亲和力提高了7倍以上等。
实例壳聚糖微球的制备。称取4g壳聚糖溶于2％的醋酸溶液中，制得4％的壳聚糖酸性溶胶。在烧杯中加入透平油，搅拌下缓慢加入4％的壳聚糖酸性溶胶，搅拌15分钟，使溶胶液滴均匀分散，然后滴入25％戊二醛溶液0.25mL，搅拌10分钟后，用1mol/L的NaOH溶液将其pH调至9～10，于60～70℃水浴保温3小时，静置冷却后，弃去上层油层，再依次用石油醚(I)、丙酮、无水乙醇抽洗，真空干燥后，过筛(80目)，最后用蒸馏水抽洗，真空干燥，备用。
将壳聚糖微球在0.1mol/L pH7.2的磷酸缓冲液中浸泡24小时，抽干。称取0.5g壳聚糖微球置于试管中，加入1.6mg/mL的木瓜蛋白酶溶液0.6mL，于4～8℃吸附12小时，并不时搅动，然后滴入0.6％戊二醛溶液3mL(0.1mol/L pH8.0的硼酸缓冲液配制)，使戊二醛溶液的最终浓度达到0.5％，于4～8℃交联3小时后，用0.1mol/L pH7.2的磷酸缓冲液洗去多余的戊二醛溶液，吸干水分，即制得壳聚糖微球固定化木瓜蛋白酶。
权利要求
1．壳聚糖微球固定化木瓜蛋白酶的制备，其特征在于以壳聚糖为原料，用醋酸溶液将壳聚糖完全溶解得壳聚糖酸性溶胶，然后在搅拌条件下将壳聚糖酸性溶胶滴入分散介质透平油中，待溶胶均匀分散后，滴入不低于25％的戊二醛溶液，搅拌10～20分钟后，再用NaOH溶液将其pH调至9～10，于60～70℃水浴保温3～5小时，静置冷却后，弃去上层油层，在下层的固形物中先加入石油醚(I)与多余的透平油互溶，弃去上层，然后在下层固形物中加入丙酮与剩下的透平油互溶，弃去上层，然后用无水乙醇抽洗固形物至透平油完全洗净，真空干燥、过60～100目筛，用蒸馏水抽洗除去石油醚(I)、丙酮及无水乙醇，并真空干燥，即得到固定化酶的载体-壳聚糖微球，将壳聚糖微球在pH7.2的磷酸缓冲液中浸泡12～24小时，抽干，将抽干后的壳聚糖微球加入浓度为1～2.5mg/mL的木瓜蛋白酶溶液中，于4～40℃吸附4～24小时，加入0.3～1.5％的戊二醛溶液，使戊二醛溶液与总溶液的最终体积比为0.2～1.0∶100，于4～40℃交联，再用pH7.2的磷酸缓冲液洗去多余的戊二醛溶液并吸干，即制得壳聚糖微球固定化木瓜蛋白酶。
2．根据权利要求书1所说壳聚糖微球固定化木瓜蛋白酶的制备，其特征在于壳聚糖与醋酸溶液的比例为壳聚糖与醋酸溶液的比例是2～5∶45～100(重量与体积比)。
3．根据权利要求书1所说壳聚糖微球固定化木瓜蛋白酶的制备，其特征在于壳聚糖酸性溶胶与透平油的比例为1∶2～5(体积比)。
4．根据权利要求书1所说壳聚糖微球固定化木瓜蛋白酶的制备，其特征在于壳聚糖酸性溶胶与滴入的25％的戊二醛溶液的比例是20～30∶1(体积比)。
5．根据权利要求书1所说壳聚糖微球固定化木瓜蛋白酶的制备，其特征在于壳聚糖微球与木瓜蛋白酶溶液的比例是0.5～1∶0.6～2(重量与体积比)。
6．根据权利要求书1所说壳聚糖微球固定化木瓜蛋白酶的制备，其特征在于当木瓜蛋白酶给酶量为1.92mg/g壳聚糖微球时，固定化酶的酶活力和固定化酶的酶活力回收率为最高。
7．根据权利要求书1所说壳聚糖微球固定化木瓜蛋白酶的制备，其特征在于当戊二醛溶液的最终浓度为0.5％时，固定化酶的酶活力与酶活力回收率均达到最大值。
全文摘要
本发明是涉及壳聚糖微球固定化木瓜蛋白酶的制备。以壳聚糖为原料制备壳聚糖微球,将壳聚糖微球加入木瓜蛋白酶溶液中,经吸附－交联得到壳聚糖微球固定化酶。本发明所得的产品具有性状均一、表面积大及酶活力回收率高等特点,对开发壳聚糖及及木瓜蛋白酶具有积极意义。
文档编号C12N11/10GK1285403SQ0011735
公开日2001年2月28日 申请日期2000年8月11日 优先权日2000年8月11日
发明者李红, 徐凤彩, 王炜军 申请人:华南农业大学