一种具有光热效应的聚吡咯纳米颗粒及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明属于纳米工程与细胞生物学交叉领域，涉及一种具有光热效应的聚吡咯纳米颗粒及其制备方法和应用；所述的纳米颗粒具有在近红外线照射情况下发热的特性，可用于制备治疗血管炎症反应及血管平滑肌细胞增生导致的血管狭窄的药物制剂。本发明基于纳米颗粒及近红外激光的光热治疗在体外对慢性炎症细胞的杀灭作用，进一步进行小鼠血管慢性炎症及动脉狭窄模型中的应用试验，结果显示，所述的纳米颗粒可通过局部置入至动脉慢性炎症发生部位，并结合近红外线局部照射达到抑制局部慢性炎症从而抑制腔内治疗后再狭窄的发生以及用于MRI评估其对腔内治疗再狭窄的作用。
【专利说明】
一种具有光热效应的聚吡咯纳米颗粒及其制备方法和应用
技术领域
[0001]本发明属于纳米工程与细胞生物学交叉领域，涉及一种具有光热效应的聚吡咯纳米颗粒及其制备方法和应用；所述的纳米颗粒具有在近红外线照射情况下发热的特性，可用于制备治疗血管炎症反应及血管平滑肌细胞增生导致的血管狭窄的药物制剂。
【背景技术】
[0002]随着进入老龄化的社会，动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)所致的心、脑血管损伤严重影响和威胁人类健康，心、脑血管疾病已成为人类致死的第一大原因；因此，防治AS及血管损伤始终是该领域研究的重点和难点。目前已知，脂质在动脉内膜下沉积、粥样硬化斑块进展，造成血管腔高度狭窄、组织缺血缺氧，最终引发急性心脑血管事件。当前，临床治疗严重的动脉粥样硬化及其并发症，通常以手术及血管腔内治疗为主，而腔内治疗由于其创伤小、时间短、患者承受痛苦小等优点成为更受欢迎的治疗选择。然而，实践显示，在腔内治疗过程中无论是球囊扩张或是支架植入，均会对血管造成一定的损伤，由于短期或长期机械应力的作用导致长期的炎症反应及血管平滑肌细胞增生，仍有较高几率发生支架植入术后再狭窄(in-stentrestenosis, ISR)，ISR的进一步处理包括支架再植入及手术治疗，但长期效果仍欠佳。研究显示，现有技术中的载药支架(drug-elutingstent, DES)在一定程度上降低了 ISR的发生，但仍有约12%的患者发生再狭窄，且目前缺乏有效治疗手段。关于ISR的发病机理学说众多，多数学者认为，各种因素引起的慢性炎症细胞浸润及平滑肌细胞的增生导致了血管中膜及内膜的过度增生，并最终引起血管官腔的狭窄已经远端的缺血症状。
[0003]光热治疗是近年来临床治疗方案中的一种新的干预方案，目前主要应用于肿瘤治疗的研究；该方案中利用光吸收材料将光能转变为热能，使蛋白质和DNA发生热变性，从而造成肿瘤细胞的死亡。该方案与放疗、化疗以及手术相比较其对组织的创伤小，因此具有较良好的应用前景。
[0004]通常，良好的光热材料需具备以下两个基本特征:(I)在近红外激光(nearinfraredlaser, NIR)治疗窗(λ = 700-1300nm)中具有良好的光吸收效应并；(2)良好的光热转换效能。目前用于光热治疗中的大部分纳米颗粒均为无机物质，包括金纳米棒、铜纳米材料、碳纳米材料及Pdnanosheets等，上述无机物质存在如下缺陷:无法生物降解且可在体内长期存留，从而造成预料之外的临床不良反应等。
[0005]鉴于此，本申请的发明人拟提供一种具有光热效应的聚吡咯纳米颗粒及其制备方法和应用；尤其用于制备治疗血管炎症反应及血管平滑肌细胞增生导致的血管狭窄的药物制剂等。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种具有光热效应的聚吡咯纳米颗粒。
[0007]本发明的另一目的是提供所述的聚吡咯纳米颗粒在制备治疗血管炎症反应及血管平滑肌细胞增生导致的血管狭窄的药物制剂中的用途。
[0008]本发明基于纳米颗粒及近红外激光的光热治疗在体外对慢性炎症细胞的杀灭作用，进一步进行小鼠血管慢性炎症及动脉狭窄模型中的应用试验，结果显示，所述的纳米颗粒可通过局部置入至动脉慢性炎症发生部位，并结合近红外线局部照射达到抑制局部慢性炎症从而抑制腔内治疗后再狭窄的发生以及用于MRI评估其对腔内治疗再狭窄的作用。
[0009]具体的，本发明提供了具有光热效应的纳米颗粒，其特征在于，采用微乳化法合成制得聚吡咯纳米颗粒(PPy纳米颗粒)；通过下述方法制备:
[0010]将0.5gPVA (?1kDa)溶解于1mL去离子水，再向反应混合物中加入0.63g氯化高铁并搅拌30min，最后，将69 μ L聚吡咯单体滴加入反应混合物；经过24h的聚合反应，通过分子量截断10kDa的超滤滤器去除额外的PVA，制得PPy纳米颗粒；所述聚吡咯纳米颗粒的大小为50-100nm、平均约60nm。
[0011]本发明采用近红外线进行照射聚吡咯纳米颗粒(PPy纳米颗粒)的实验，并采用免疫荧光及HE染色鉴定其对血管慢性炎症及内膜增厚的抑制作用；其实验包括下述步骤:
[0012](I)合成PPy纳米颗粒和功能检测
[0013]首先，将0.5gPVA(?1kDa)溶解于1mL去离子水，再向反应混合物中加入0.63g氯化高铁并搅拌30min，最后，将69 μ L聚吡咯单体滴加入反应混合物；经过24h的聚合反应，通过分子量截断10kDa的超滤滤器去除额外的PVA，制得PPy纳米颗粒；所述PPy纳米颗粒的尺寸及形态通过高分辨率透射电镜检测；用ShimadZuUV-2550UV-visible-NIR分光光度计用适应比色皿测定其紫外光吸收波谱，光通道1cm，并应用915nm近红外激光进行照射，检测其光热效应；
[0014](2)巨噬细胞体外对所述PPy纳米颗粒的吞噬及功能检测
[0015]将扩增后的Ana-1小鼠巨噬细胞与所述PPy纳米颗粒共同孵育12h后，收集细胞行透射电子显微镜检测巨噬细胞对PPy纳米颗粒的吞噬作用；并进行不同浓度下(0，20，40及80 μΜ)CCK-8细胞活力检测试验，检测不同浓度的PPy纳米颗粒对细胞的毒性效应并寻找最佳孵育浓度；同时对应用40 μ M PPy纳米颗粒浓度孵育的细胞进行不同强度(0，0.35，
0.69及1.38W/cm2)915nm近红外激光照射5min后进行细胞活力检测，找出最佳近红外线光照强度；
[0016](3)制备动脉慢性炎症及狭窄小鼠模型，并进行光热治疗试验
[0017]将6月龄的ApoE小鼠的右侧颈总动脉暴露，将娃胶管(内径0.38mm，外径0.50mm)置于其外周，2w后取材通过对巨噬细胞特异标志物MAC387进行染色，验证是否成功建立动脉炎症模型；通过局部注射所述PPy纳米颗粒100 μ L,并对套管颈总动脉进行近红外线照射，2w后取材验证局部炎症的改善情况，同时对血管壁增厚程度与对照组进行比较，检测基于PPy纳米颗粒的光热治疗在治疗血管慢性炎症的效果；
[0018](4)检测所述PPy纳米颗粒的生物毒性
[0019]取材前收集小鼠血液进行肝功能(总胆红素、谷丙转氨酶及谷草转氨酶)及肾功能(血肌酐)的检测；并取心、肝、脾、肺、肾及肠进行HE染色检测PPy纳米颗粒在生物体应用的安全性。
[0020]本发明实验方法中，步骤(I)中纳米分子为聚吡咯纳米颗粒，颗粒大小为50_100nm，平均约 60nm ；
[0021]本发明实验方法中，步骤⑵所述的Ana-1细胞为小鼠巨噬细胞系，MAC387染色为阳性；纳米分子探针对巨噬细胞的体外标记浓度为0-80 μ M，最佳的孵育浓度为40 μ Μ，孵育时间为12h，标记的细胞量为0-1 X 10s;纳米分子探针对巨噬细胞的体外最佳NIR照射强度为0-1.38ff/cm2,最佳的照射强度为0.69W/cm2，照射时间为5min ；CalceinAM/PI染色检测活死细胞数，流式细胞学分析检测细胞凋亡情况；
[0022]本发明实验方法中，步骤(3)通过观察血管形态，病进行免疫荧光染色检测炎症动脉中MAC387的表达情况；并进行血管HE染色，观察中膜及内膜厚度变化。
[0023]本发明实验方法中，步骤(4)通过观察体内重要器官的形态，并进行肝肾功能的检测确定PPy纳米颗粒在体内应用的安全性。
[0024]本发明提供了具有光热效应的聚吡咯纳米颗粒，其属于有机物，可在机体内被分解代谢排出体外，从而不会对生物体造成长期的危险；所述纳米颗粒光稳定性良好，且具有极高的光热转化效应；将所述聚吡咯纳米颗粒联合NIR激光照应用于动脉炎症及动脉狭窄动物模型试验，结果显示，所述的纳米颗粒可通过局部注射至动脉慢性炎症发生部位，并结合近红外线局部照射达到抑制局部慢性炎症从而抑制血管腔内治疗后再狭窄的发生。本发明为应用光热效应治疗血管慢性炎症损伤及预防动脉狭窄提供了新思路及实验依据。
【附图说明】
[0025]图1显示了 PPy纳米颗粒的合成及其性能检测结果。
[0026]图2显示了 Ana-1巨噬细胞的培养及鉴定结果，
[0027]图3显示了 Ana-1巨噬细胞吞噬PPy纳米颗粒及TEM检测结果，
[0028]图4显示了 PPy纳米颗粒及NIR照射对Ana-1巨噬细胞的毒性作用。
[0029]图5显示了 ApoE小鼠血管慢性炎症模型的制备。
[0030]图6显示了体内光热干预过程。
[0031]图7显示了光热干预能抑制血管炎症反应及内膜增厚。
【具体实施方式】
[0032]实施例1
[0033]采用近红外线进行照射聚吡咯纳米颗粒(PPy纳米颗粒)，并采用免疫荧光及HE染色鉴定其对血管慢性炎症及内膜增厚的抑制作用；包括下述步骤:
[0034](I)合成PPy纳米颗粒和功能检测
[0035]首先，将0.5gPVA (?1kDa)溶解于1mL去离子水，再向反应混合物中加入0.63g氯化高铁并搅拌30min，最后，将69 μ L聚吡咯单体滴加入反应混合物；经过24h的聚合反应，通过分子量截断10kDa的超滤滤器去除额外的PVA，制得PPy纳米颗粒；所述PPy纳米颗粒的尺寸及形态通过高分辨率透射电镜检测；应用ShimadZuUV-2550UV-visible-NIR分光光度计用适应比色皿测定其紫外光吸收波谱，光通道1cm，并应用915nm近红外激光进行照射，检测其光热效应；
[0036](2)巨噬细胞体外对所述PPy纳米颗粒的吞噬及功能检测
[0037]将扩增后的Ana-1小鼠巨噬细胞与所述PPy纳米颗粒共同孵育12h后，收集细胞行透射电子显微镜检测巨噬细胞对PPy纳米颗粒的吞噬作用；并进行不同浓度下(0，20，40及80 μM)CCK-8细胞活力检测试验，检测不同浓度的PPy纳米颗粒对细胞的毒性效应并寻找最佳孵育浓度；同时对应用40 μ M PPy纳米颗粒浓度孵育的细胞进行不同强度(0，0.35，
0.69及1.38W/cm2)915nm近红外激光照射5min后进行细胞活力检测，得到最佳近红外线光照强度；
[0038](3)制备动脉慢性炎症及狭窄小鼠模型及光热干预
[0039]将6月龄的ApoE小鼠的右侧颈总动脉暴露，将娃胶管(内径0.38mm，外径0.50mm)置于其外周，2w后取材通过对巨噬细胞特异标志物MAC387进行染色，验证是否成功建立动脉炎症模型；通过局部注射所述PPy纳米颗粒100 μ L,并对套管颈总动脉进行近红外线照射，2w后取材验证局部炎症的改善情况，同时对血管壁增厚程度与对照组进行比较，检测基于PPy纳米颗粒的光热治疗在治疗血管慢性炎症的效果；
[0040](4)检测所述PPy纳米颗粒的生物毒性
[0041]取材前收集小鼠血液进行肝功能(总胆红素、谷丙转氨酶及谷草转氨酶)及肾功能(血肌酐)的检测；并取心、肝、脾、肺、肾及肠进行HE染色检测PPy纳米颗粒在生物体应用的安全性。
[0042]上述步骤(I)中纳米分子为聚吡咯纳米颗粒，颗粒大小为50_100nm，平均约60nm ；
[0043]上述步骤(2)所述的Ana-1细胞为小鼠巨噬细胞系，MAC387染色为阳性；纳米分子探针对巨噬细胞的体外标记浓度为0-80 μ Μ，最佳的孵育浓度为40 μ Μ，孵育时间为12h，标记的细胞量为0-1 X 10s;纳米分子探针对巨噬细胞的体外最佳NIR照射强度为0-1.38W/cm2,最佳的照射强度为0.69W/cm2，照射时间为5min ；CalceinAM/PI染色检测活死细胞数，流式细胞学分析检测细胞凋亡情况；
[0044]上述步骤(3)通过观察血管形态，病进行免疫荧光染色检测炎症动脉中MAC387的表达情况；并进行血管HE染色，观察中膜及内膜厚度变化。
[0045]上述步骤(4)通过观察体内重要器官的形态，并进行肝肾功能的检测确定PPy纳米颗粒在体内应用的安全性。
[0046]试验结果显示，本发明所述的聚吡咯纳米颗粒属于有机物，可在机体内被分解代谢排出体外，从而不会对生物体造成长期的危险；所述纳米颗粒光稳定性良好，且具有极高的光热转化效应；所述的纳米颗粒置入实验动物动脉慢性炎症发生部位，并结合近红外线局部照射能达到抑制局部慢性炎症进一步抑制血管腔内治疗后再狭窄的发生。
【主权项】
1.一种具有光热效应的聚吡咯纳米颗粒，其特征在于，采用微乳化法合成制得聚吡咯纳米颗粒(PPy纳米颗粒)；通过下述方法制备: 将0.5gPVA(?1kDa)溶解于1mL去离子水，再向反应混合物中加入0.63g氯化高铁并搅拌30min，最后，将69 μ L聚吡咯单体滴加入反应混合物；经过24h的聚合反应，通过分子量截断10kDa的超滤滤器去除额外的PVA，制得PPy纳米颗粒。2.按权利要求1所述的具有光热效应的聚吡咯纳米颗粒，其特征在于，所述聚吡咯纳米颗粒的大小为50_100nm、平均60nm。3.权利要求1所述的具有光热效应的聚吡咯纳米颗粒在制备治疗血管炎症反应导致的血管狭窄的制剂中的用途。4.权利要求1所述的具有光热效应的聚吡咯纳米颗粒在制备治疗血管平滑肌细胞增生导致的血管狭窄的制剂中的用途。5.按权利要求3或4所述的用途，其特征在于，所述的聚吡咯纳米颗粒结合近红外线局部照射进行干预，抑制局部慢性炎症，进而抑制血管腔内治疗后再狭窄。
【文档编号】A61P9/14GK105833269SQ201510017314
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2015年1月13日
【发明人】陆信武, 彭智猷, 秦金保, 叶开创, 袁福康, 杨心蕊, 黄丽佳, 蒋米尔
【申请人】上海交通大学医学院附属第九人民医院