一种禽偏肺病毒和h9亚型禽流感病毒二联疫苗的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种禽偏肺病毒和H9亚型禽流感病毒二联疫苗，包含有抗原和疫苗佐剂，其中抗原是保藏编号为CCTCC NO:V201517的H9亚型禽流感病毒株和氨基酸序列为SEQ ID NO:1的禽偏肺病毒F蛋白。本发明将H9亚型禽流感病毒QDY株与禽偏肺病毒F蛋白抗原液按比例混合后，加油佐剂混合乳化制成疫苗。本发明制备的疫苗能提高免疫后的抗体水平，提高免疫后抗体的整齐度，保证了疫苗的免疫效果，此疫苗具有高效、安全性好的优点。CCTCC NO: M 201609720160309
【专利说明】
一种禽偏肺病毒和H9亚型禽流感病毒二联疫苗
技术领域
[00011本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种禽偏肺病毒和H9亚型禽流感病 毒二联疫苗。
【背景技术】
[0002] 禽偏肺病毒属于副黏病毒肺病毒属，基因组为不分节段的单股负链RNA，可引起火 鸡发生呼吸道疾病，称为火鸡鼻气管炎;感染鸡后引起病毒性气囊炎，鼻气管炎和肿头综合 征，产蛋下降。20世纪70年代末，禽偏肺病毒引起的疾病首次在南非报道，随后在北美、南 美、中东、远东都有发生。1989年美国首次分离到此病毒。在分离此病毒的同时，往往可分离 到波氏杆菌、巴氏杆菌、假单胞杆菌、鼻气管炎鸟疫杆菌、粪产碱杆菌等。禽偏肺病毒能使气 管纤毛的活动受到抑制，气管中的灰尘向外排出困难，灰尘中所带的大量细菌很容易发生 继发感染，侵害呼吸道。病原禽偏肺病毒可分为三个型:A型感染火鸡，B型感染肉鸡，C型只 在美国存在，A和B两型有交叉保护作用，与C型无交叉保护作用。随着我国禽业养殖规模的 不断扩大，因禽偏肺病毒感染导致的继发感染也日益严重，对养禽业的危害非常严重，唯一 有效办法是通过接种疫苗来预防鸡群的发病。目前国内外对禽偏肺病毒疫苗的研究大多集 中在灭活疫苗的研制。
[0003] H9亚型禽流感属于低致病性疫病，但与其他病原特别混合感染能够提高其致病 力，引起产蛋量严重下降和死亡率显著提高，给养禽业带来严重的危害。已有的禽流感(H9 亚型)疫苗已在临床广泛使用，但存在抗体水平较低和抗体整齐度方面的问题，从而影响到 疫苗的防治效果。但目前市场上并没有有效的预防禽偏肺病毒和H9亚型禽流感的二联疫 苗。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种禽偏肺病毒和H9亚型禽流感病毒二联疫苗，从而弥补现 有技术的不足。
[0005] 本发明的禽偏肺病毒和H9亚型禽流感病毒二联疫苗，包含有抗原和疫苗佐剂，其 中抗原是保藏编号为CCTCC N0:V201517的H9亚型禽流感病毒株和禽偏肺病毒F蛋白；
[0006] 所述的禽偏肺病毒F蛋白，包含有：
[0007] 1)氨基酸序列为SEQ ID N0:1的蛋白，
[0008] 2)在1)的蛋白上取代、缺失、添加一个或几个氨基酸，且具有1)中蛋白功能的蛋 白；
[0009] 编码上述F蛋白的基因，其核苷酸序列为SEQ ID N0:2;
[0010] 所述的禽偏肺病毒F蛋白由巴斯德毕赤酵母X33_F(Pichia pastoris X33-F)，已 于2016年3月9日保藏于武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO :M 2016097〇
[0011] 上述疫苗中的Η9亚型禽流感病毒和禽偏肺病毒F蛋白经过甲醛溶液灭活；
[0012] 上述的疫苗中H9亚型禽流感病毒的含量不低于106'QEID5Q/0.3ml;禽偏肺病毒F蛋 白的含量不低于50yg/0.3ml。
[0013] 本发明将H9亚型禽流感病毒QDY株与禽偏肺病毒F蛋白抗原液按比例混合后，加油 佐剂混合乳化制成疫苗。本发明制备的疫苗能提高免疫后的抗体水平，提高免疫后抗体的 整齐度，保证了疫苗的免疫效果，此疫苗具有高效、安全性好的优点。
【具体实施方式】
[0014]
【附图说明】
[0015] 图1:本发明实施例1的F基因 PCR扩增鉴定图；
[0016]图2:本发明F基因的核苷酸序列比对图；
[0017] 图3:本发明F蛋白的氨基酸序列比对图；
[0018] 图4:本发明实施例高效表达载体的酶切鉴定图；
[0019] 图5:本发明实施例重组菌株X33-F的PCR鉴定图；
[0020] 图6:本发明实施例重组菌发酵诱导表达产物的SDS-PAGE电泳检定图。
【具体实施方式】
[0021]下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细的说明。
[0022]实施例1:F蛋白的扩增及序列分析
[0023] 2010年在山东省多个种鸡场出现了肿头综合症的症状，而发病鸡群之前已经注射 了已有的禽肺病毒疫苗，推测感染的病毒发生了变异；因此从发病个体中进行禽肺病毒的 筛选。最终筛选出了 一株禽肺病毒SHS/A3。
[0024]为验证筛选的病毒的抗原性，使用了包含筛选毒株SHS/A3在内的5个不同来源的 病毒株作为抗原制备疫苗，免疫SPF鸡后用SHS/A3株病毒液进行攻毒实验，结果表明相比于 其它禽肺病毒疫苗;其本身制备的疫苗具有更好的免疫效果(P<〇.05);因此确定其发生了 遗传上的变异。
[0025] 1、扩增B型禽偏肺病毒SHS/A3株(APV)F基因
[0026] 根据NCBI中发表的F基因序列，设计并合成了引物，引物的序列信息如下：
[0027] primerl：57-GGGATGTACCTCAAACTGCTACTAAT-37 ；
[0028] primer2:5'-TCAACTGATGTAGCCCATGTTGC-3' 〇
[0029] 2、PCR扩增F基因克隆与序列测定
[0030] 提取SHS/A3株的核酸作为模板，用引物primerl和primer2进行PCR扩增目的片段， 经序列测定（图1为B型禽偏肺病毒F蛋白基因 PCR的扩增鉴定图），结果核苷酸序列为SEQ ID N0:2;其编码的氨基酸序列为SEQ ID N0:1。与NCBI中已公布的B型禽偏肺病毒的F基因进行 核苷酸序列比对分析，结果同源性在95.1 %~99.2% (图2为SHS/A3株F基因的核苷酸序列 比对图）；推导的氨基酸序列同源性为95.0%~97.4% (图3为SHS/A3株F蛋白的氨基酸序列 比对图）。结果表明，分离的SHS/A3株为新的B型禽偏肺病毒，含有新的F基因。
[0031] 3、设计并合成B型禽偏肺病毒(APV)F基因
[0032] 根据SHS/A3株F基因的序列测定结果，设计合成一对引物，引物的序列信息如下：
[0033] primerS^7 -GGGGGTACCATGTACTTGAAGTTGCAATTG-37 ；
[0034] primer4:5'-GCGGCCGCTCAACTGATGTAACCCATGT-3' 〇
[0035] 以合成的核苷酸序列为SEQ ID N0:2的F基因为模板，用引物primer3和primer4进 行PCR扩增，目的片段产物回收连接pMD18-T载体，转化和筛选阳性克隆pMD18-T-F。
[0036] 实施例2 :F蛋白的重组表达
[0037] 1.重组B型禽偏肺病毒F蛋白的制备方法
[0038] 包括以下步骤:a.构建表达载体;b.构建表达菌株;c.重组F蛋白的诱导和提取纯 化。
[0039] a.构建表达载体：
[0040] 将阳性克隆质粒pMD18-T-F和表达载体pPICZa载体分别用ΚρηΙ和Notl双酶切产物 经1.2%琼脂糖凝胶电泳后，用DNA凝胶回收试剂盒回收，分别获得约1.6kb和3.3kb片段，在 16°C定向连接构建pPICZa-F表达载体（图4是本发明实施例高效表达载体的酶切鉴定图）； 测序验证序列和读码框无误后，将质粒线性化后，电转化入毕赤酵母感受态细胞。
[0041 ] b.构建表达菌株：
[0042]电转化后，F基因重组到毕赤酵母基因组中，构建毕赤酵母表达菌株X33-F(已于 2016年3月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2016097;图5);
[0043] c.重组F蛋白的诱导和提取纯化：
[0044]诱导表达，挑取含X33-F的单克隆菌落接种于BMGY液体培养基，30°C振荡培养过 夜，离心收集菌体，用适量的BMMY悬浮后，加入终浓度0.5 %甲醇，30°C诱导96小时。4°C， 9000rpm离心5min，保留上清液，加入30 %的硫酸铵沉淀后，12000rpm离心5min收集蛋白沉 淀，用PBS重溶蛋白。加入蛋白电泳上样缓冲液，沸水煮8分钟后，用12%的分离胶进行SDS-PAGE鉴定。（图6中1、2、3为F蛋白表达产物沉淀，Μ为分子量标准蛋白质。）
[0045]实施例3:制苗用抗原的制备
[0046] 1.制苗用禽流感病毒液的制备将保藏编号为CCTCC N0:V201517的Η9亚型禽流感 病毒QDY株，经尿囊腔接种10~11日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml，36°C~37°C孵育，每日照胚2次， 取24小时后死亡的鸡胚，至96小时无论死亡与否全部收获，置4~8°C冷却12~24小时，收获 鸡胚液，混合于无菌容器中，置2~8°C保存。收获后的病毒液测定病毒含量，每0.1ml病毒含 量不低于l〇 8'QEID50;
[0047] 2.灭活将检验合格的毒液置于灭菌容器内，加入10%福尔马林溶液至终浓度为 0.2%，37°C灭活18小时；
[0048] 3.制苗用B型禽偏肺病毒F蛋白的制备将生产B型禽腺病毒融合蛋白的毕赤酵母 表达菌株X33-F株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC Μ 2016097。
[0049] 3.1制苗用菌液的制备将菌种接种于含博莱霉素的YPD液体培养基中，30°C振荡 培养16~18小时。然后划线接种于加有博莱霉素的YH)固体培养基，选取典型菌落2~3个混 合于少量YPD液体培养基中，置30°C摇床中振荡培养18小时，定量分装，经纯粹检验后，作为 一级种子。取一级种子接种于BMGY液体培养基中，30 °C振荡培养16~18小时，经镜检后，置2 ~8°C保存，作为二级种子。
[0050] 3.2制苗用蛋白的制备按发酵罐容积60 % (V/V)加入BMGY不完全液体培养基，同 时按培养基ο. 1 % (V/ν)加入消泡剂，通入高温蒸汽灭菌30分钟，待培养基温度降至32°C，加 入YNB和生物素，接种3.1中制备的B型禽偏肺病毒F蛋白生产用二级种子液，发酵罐参数设 置分别为搅拌速度800r/min，温度30 °C，维持DO值(溶氧量)在20%。培养24小时后的菌液补 加甲醇，甲醇的补加速度为2ml/h/L诱导表达培养，按照以上发酵控制参数及工艺诱导表达 120小时；发酵培养菌液经管式离心机10000r/min离心30分钟，收获的上清，加入硫酸铵沉 淀蛋白后，按12000r/min离心30分钟收获沉淀，加入适量的生理盐水溶解蛋白沉淀。
[0051] 4.灭活将蛋白液置于灭活瓶内，计量加入10%甲醛溶液，随加随摇，使其充分混 合，甲醛溶液的最终浓度为0.1 %。加甲醛溶液后倒入另一灭活瓶中，以避免瓶口附近粘附 的病毒未能接触灭活剂。37°C灭活16小时后取出，置2~8°C保存。
[0052] 5.半成品检验
[0053] (1)无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验。
[0054] (2)病毒含量测定将病毒液用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10-5、10- 6、10-7、 10-8、10-95个稀释度，分别尿囊腔接种10~11日龄SPF鸡胚，每胚0. lml，同时设接种生理盐 水对照5枚，每胚0.2ml。置36~37°C继续孵育，每日照胚2次，观察96小时。测定每个鸡胚尿 囊液的血凝效价，血凝效价不小于2 4，判为感染并计算EID50。
[0055] (3)蛋白含量测定按Bradford法检测蛋白含量。
[0056] (4)灭活检验将灭活后的病毒液尿囊腔接种10~11日龄SPF鸡胚10枚，每胚 0.2ml，置36~37°C继续孵育，连续观察96小时。测定每个鸡胚尿囊液的血凝效价，血凝效价 不小于2 4,判为感染并计算EID50。
[0057] 实施例4:疫苗制备和检验
[0058] ( - )疫苗制备
[0059] 经过检验合格后的半成品抗原进行疫苗制备（以下配制中各液体成分按体积比 计)。
[0060] 1.油相制备取兽用白油95份，硬脂酸铝1份，置于油相制备罐中加热至80°C后，再 加司本一80 5份，至温度达到115°C时，维持30min，冷却后备用。
[0061] 2.水相制备将灭活的H9亚型禽流感病毒液使用生理盐水稀释至不低于2 X lO^EIDso/O.lml。将灭活的禽偏肺病毒F蛋白使用生理盐水稀释至不低于100yg/0.1ml。分 别取灭活的H9亚型禽流感病毒液和禽偏肺病毒F蛋白液各1份，混合配成制苗用抗原液。取 灭菌后的5份吐温-80,加入配液罐中，同时加入制苗用抗原液95份，搅拌20~30min，使吐 温-80完全溶解。
[0062] 3.乳化取油相2份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水 相1份，以l〇〇〇〇r/min，乳化5分钟。乳化后，取10ml，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水 相应不超过0.5ml。
[0063] (二)疫苗成品检验
[0064] 1.性状
[0065] 外观疫苗应为乳白色乳剂，无杂质并且外包装应合格。
[0066] 剂型为油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外，均应不 扩散。
[0067] 稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相 应不超过0.5ml。
[0068] 黏度按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。
[0069] 2.装量检查按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。
[0070] 3.无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。
[0071] 4.安全检验用7日龄SPF鸡10只，每只颈部皮下注射疫苗1.0ml，同时设对照5只， 在相同的条件下饲养，连续观察14日，记录试验鸡采食、饮水及临床情况。应不出现由疫苗 引起的任何局部和全身不良反应。
[0072] 5.效力检验
[0073]用21日龄SPF鸡20只，每只颈部皮下注射二联疫苗，0.3ml/只，另取20只同日龄鸡 不免疫作对照，免后28日，攻毒。
[0074] 5.1对H9亚型禽流感的攻毒保护于免疫后28日，免疫组和对照组各取10只，攻毒6 株各地方分离株，10倍稀释后每只静脉注射〇. lml。结果表明，二联灭活疫苗能抵御各地方 分离毒的攻击(参见表1)。
[0075]表1对地方流行毒株的攻毒保护 [0076]
[0077] 5.2B型禽偏肺病毒攻毒保护试验于免疫后28日，点眼攻毒B型禽偏肺病毒液， 0.1ml/只，病毒含量为106'5TCID5Q/0.1ml。攻毒后连续观察7天，于攻毒后第5天采集鼻拭子， 分离病毒。结果表明，用B型禽偏肺病毒F蛋白亚单位疫苗免疫鸡群能够抵抗病毒的攻击，不 出现临床症状，病毒分离均为阴性。对照组，出现轻微的临床症状，9/10病毒分离阳性。 [0078]而且，使用SHS/A3株病毒进行攻毒试验，结果表明本发明制备的疫苗的免疫效果 好于其它类型的禽偏肺病毒F蛋白疫苗，本发明制备的亚单位疫苗攻毒后有90%保护，而同 类产品的保护率为60%。以上结果表明使用氨基酸序列为SEQ ID NO: 1的禽偏肺病毒F蛋白 制成的疫苗对用SHS/A3株的免疫效果好于同类产品，发病率远低于其市售疫苗(p<0.05)。 可能的原因是由于F蛋白的遗传变异导致的。
【主权项】
1. 一种禽偏肺病毒和H9亚型禽流感病毒二联疫苗，其特征在于，所述的二联疫苗包含 有抗原和疫苗佐剂，其中抗原是保藏编号为CCTCC N0:V201517的H9亚型禽流感病毒株和禽 偏肺病毒F蛋白。2. 如权利要求1所述的二联疫苗，其特征在于，所述的禽偏肺病毒F蛋白包含有： 1) 氨基酸序列为SEQ ID N0:1的蛋白， 2) 在1)的蛋白上取代、缺失、添加一个或几个氨基酸，且具有1)中蛋白功能的蛋白。3. 如权利要求2所述的二联疫苗，其特征在于，所述的F蛋白，其编码基因的核苷酸序列 为SEQ ID N0:2。4. 如权利要求1或2所述的二联疫苗，其特征在于，所述的禽偏肺病毒F蛋白是由保藏编 号为CCTCC Μ 2016097的X33-F菌株重组表达生产的。5. 如权利要求1所述的二联疫苗，其特征在于，所述的Η9亚型禽流感病毒和禽偏肺病毒 F蛋白经过甲醛溶液灭活。6. 如权利要求1所述的二联疫苗，其特征在于，所述的Η9亚型禽流感病毒的含量不低于 106· QEID5Q/0.3ml;禽偏肺病毒F蛋白的含量不低于50yg/0.3ml。
【文档编号】A61K39/145GK105833263SQ201610236341
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年4月14日
【发明人】刘新文, 王秀丽, 邹敏, 郭伟伟, 宫晓, 王龙, 邹桂荣
【申请人】青岛易邦生物工程有限公司