乌司他丁在制备防治颗粒病药物中的应用
【专利摘要】本发明公开了乌司他丁在制备防治颗粒病药物中的应用。本发明了探讨乌司他丁在鼠股骨骨溶解模型中对骨水泥颗粒诱导的炎性骨溶解的抑制作用，证实其在预防“颗粒病”中应用的潜在价值。
【专利说明】
乌司他丁在制备防治颗粒病药物中的应用
技术领域
[0001] 本发明属于制药技术领域，具体涉及乌司他丁在制备防治"颗粒病"药物中的应 用。
【背景技术】
[0002] 人工关节置换术(artificial joint replacement，AJR)是目前用来治疗类风湿 性关节炎、创伤性关节炎及其它晚期关节疾患最成功的骨科手术治疗方法之一。然而，由磨 肩诱导产生的假体周围骨溶解(peri-prosthetic osteolysis,ΡΡΟ)和继发性无菌性假体 松动(aseptic loosening，AL)，是造成AJR术失败和再次翻修的最常见的原因。
[0003] 由William Harris最先提出专业名称"颗粒病"，用来强调由假体产生的磨肩颗粒 在诱发宿主反应中的重要作用。"颗粒病"的概念是指纳米级的假体颗粒激发假体周围组织 细胞(如巨噬细胞、成骨细胞、成纤维细胞、淋巴细胞、自然杀伤细胞等)对促炎症因子的大 量释放（包括TNF-α、IL-6、IL-Ιβ和多种基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases， MMPs))及交互级联炎症反应的发生，从而导致破骨细胞(osteoclast，0C)的骨吸收作用和 成骨细胞(osteoblast，0B)的成骨作用之间失衡，最终引发ΡΡ0和AL的发生。但其发生机制 目前仍然存在争论。一项来自挪威关节外科中心对超过20000例行关节置换术患者的研究 结果显示，经全身应用抗生素或使用抗生素骨水泥的患者，术后可降低约50%的AL发生率。 由此可见，来源于细菌的免疫激活分子（pathogenassociated molecular patterns， PAMPs)可能促进了 ΡΡ0和AL的发生，而研究最成功的PAMPs应是由革兰阴性杆菌产生的内毒 素(脂多糖，lip〇P〇lysaCCharide，LPS)。大量体内外研究表明，粘附内毒素可增强骨科磨肩 颗粒诱导的炎性反应及骨溶解效应。近来也有研究表明，去除内毒素的磨损颗粒并不能诱 导巨噬细胞产生炎性反应，而粘附内毒素的磨损颗粒却能产生大量的炎性因子。此外，部分 缺乏临床感染症状的患者，在关节翻修时所获得的假体及周围组织中可发现PAMPs甚或炎 性假瘤的存在。细菌性PAMPs可能来源于全身性血液播散或假体本身的途径。以上结果提示 内毒素可能在ΡΡ0和AL过程中扮演着重要角色。
[0004] 迄今为止，对磨肩诱导的ΡΡ0和AL的治疗策略主要集中在对炎症反应的抑制及靶 向0C的研究上，NF-ΚΒ激活途径也是研究最热的信号通道。然而，目前包括二磷酸盐类、四环 素类、红霉素类及TNF-α拮抗剂等药物治疗，结果表明在人类治疗上无效，而且对机体组织 器官均产生不良影响。尽管0B也是磨肩诱导炎症反应的主要细胞之一，但目前尚欠缺靶向 干预0B成骨作用的研究报道，考虑到0B在磨肩诱导的假体周围骨溶解发病机制中的重要作 用，其可能成为治疗此类疾病潜在的靶向细胞。
[0005] 乌司他丁（Ulinastatin，urinary trypsin inhibitor,UTI)是一种天然的、经典 的多价Kunitz型广谱蛋白酶抑制剂，具有下调促炎症因子产生和抑制NF-κΒ激活的作用。作 为人体肝脏分泌的一种糖蛋白，由143个氨基酸组成，其相对分子量约为67000。除了对炎性 蛋白酶具有抑制作用外，还具有稳定溶酶体膜、抑制溶酶体酶的释放、清除氧自由基及抑制 炎症介质释放的作用。由于其具有确切的抗炎、抗肿瘤疗效且副作用少，在中国和日本等国 家，UTI已被成功并广泛用于与LPS相关炎性疾病及肿瘤抑制、侵袭转移的治疗选择。近年 来，有研究表明UTI可抑制兔退变髓核细胞中诱导型一氧化氮合酶(iN0S)、MMP-2和MMP-3的 表达，对慢性炎症引发的椎间盘退变的防治具有潜在价值。尽管目前对UTI药物作用的研究 较多，但其本身的药物作用尚未完全清楚。据我们所知，迄今为止，国内外尚无关于乌司他 丁在与LPS相关的"颗粒病"中，其可能的抗炎及抗骨溶解作用的体内研究报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供乌司他丁在制备防治"颗粒病"药物中的应用。
[0007] 本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
[0008] 乌司他丁在制备防治"颗粒病"药物中的应用。
[0009] 上述的应用，其在于所述的药物包括乌司他丁和药学上可接受的载体或者常规辅 料。
[0010] 所述的药物为药学上可接受的剂型。例如注射液。
[0011] 本发明的有益效果：
[0012] 本发明了探讨乌司他丁在大鼠股骨骨溶解模型中对骨水泥颗粒诱导的炎性骨溶 解的抑制作用，证实其在预防"颗粒病"中应用的潜在价值。
【附图说明】
[0013] 图1为各组大鼠体重变化。
[0014] 注：Control/PMMA诱导组：生理盐水，1 · 5mL/kg · d，ip;UTIi: 500U/kg · d，ip;UTI2: 5000U/kg.d，ip;共三周。
[0015] 图2为各组大鼠股骨远端松质骨Micro-CT三维图像。
[0016] 其中，A空白对照组;B PMMA诱导组;C UTI(500U/kg.d)组;D UTI(5000U/kg.d)组
[0017] 图3为各组MMP-9蛋白表达阳性细胞百分率（％ )。
[0018] 其中，A空白对照组;B PMMA诱导组;C UTI(500U/kg.d)组;D UTI(5000U/kg.d)组
[0019] 图4各组TNF-α蛋白表达阳性细胞百分率（％ )
[0020] 其中，A空白对照组;B PMMA诱导组；C UTI(500U/kg.d)组;D UTI(5000U/kg.d)组 [0021 ]图5各组IL-10蛋白表达阳性细胞百分率（％ )
[0022]其中，A空白对照组;B PMMA诱导组;C UTI(500U/kg.d)组;D UTI(5000U/kg.d)组 [0023]图6原代成骨细胞培养及碱性磷酸酶染色倒置显微镜下观察结果（X 200)
[0024] 其中，原代成骨细胞培养结果(A-D)和碱性磷酸酶染色结果(E-H);
[0025] A和E:空白对照组;B和F: PMMA诱导组;C和G: UTI (500U/kg · d)组;D和H: UTI (5000U/ kg.d)组
[0026]图7茜素红染色检测成骨细胞矿化程度倒置显微镜下观察结果（X 400)
[0027]其中，A空白对照组;B PMMA诱导组;C UTI(500U/kg.d)组;D UTI(5000U/kg.d)组 [0028]图8流式细胞仪(AnnexinV/PI法)检测各组成骨细胞凋亡率情况
[0029] 其中，A空白对照组；B PMMA诱导组；C UTIl(500U/kg.d)组；D UTI(5000U/kg.d) 组。
[0030] 图9 RT-PCR检测各组 11^-6、了陬-〇、丽？-9、1?111?2、〇8七641和0?6 1111?嫩表达水平
[0031] 其中，A为IL-6:GAPDH mRNA;B为TNF-a:GAPDH mRNA;C为MMP-9:GAroH mRNA;D为 Runx2:GAPDHmRNA;ES〇sterix:GAPDHmRNA;FS〇PG:GAPDHmRNA.
【具体实施方式】
[0032] 通过以下实验探讨乌司他丁在鼠股骨骨溶解模型中对骨水泥颗粒诱导的炎性骨 溶解的抑制作用，证实其在预防"颗粒病"中应用的潜在价值。
[0033]实验主要材料及仪器：
[0034]表1实验主要材料、试剂及来源 [0035] LUU^/j 买验万'/云：
[0038] 一、骨水泥颗粒悬液的制备：
[0039] 商业纯骨水泥(pure PMMA)颗粒购自美国Sigma公司（货号：00681;St.Louis，M0， USA)。颗粒的平均直径为6.(^111(1-1(^111)，95%的颗粒直径小于1(^111。75%酒精浸泡4811，离 心管（2000rpm速度）离心15min X 3次，吸弃上层乙醇，用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS)洗涤3次，离心后紫外线持续照射去除残留液体;将PMMA颗粒置入小 玻璃瓶中进行高压蒸汽消毒经去除内毒素处理后，用基质鲎试剂盒终点显色法检测内毒 素；用改良型α-ΜΕΜ培养基(含10 %胎牛血清，v/v)将去除内毒素的PMMA颗粒和1.5yg/mL的 内毒素(LPS，Escherichia coli，Sigma，St · Louis，M0)，在37°C共同孵育 12小时，然后经离 心去除悬浮的内毒素，即配制成粘附内毒素的PMMA颗粒悬液(浓度为0.5mg/mL);在-80°C保 存备用（用时摇匀）。
[0040] 二、鼠股骨骨溶解模型的建立及实验分组：
[00411选用成年SD大白鼠72只，雄性，体重250-300g，由上海交通大学动物实验中心提供 (来源：中科院上海实验动物中心/上海斯莱克实验动物有限公司），动物合格证号：SCXK (沪）2007-0005。随机分成4组，即空白对照组(Control组），PMMA诱导组(0 · 5mg/mL)和低浓 度UTI组(500U/kg.d)和高浓度UTI组(5000U/kg.d)，每组18只。所有大白鼠在同一条件下饲 养，喂食普通颗粒饲料。
[0042]实验动物用质量浓度为10%的水合氯醛腹腔注射麻醉(0.03mL/kg)，麻醉完成后， 将大鼠固定在动物手术台上，剃毛备皮，常规消毒，铺无菌单。于右侧髌旁内侧人路，切开皮 肤、皮下组织、深筋膜和关节囊，逐层分离显露膝关节，髌骨前外侧脱位，屈曲膝关节暴露股 骨髁，从股骨髁间窝钻孔至股骨骨髓腔，低速电钻平行股骨长轴方向于股骨髁间窝钻孔至 股骨骨髓腔钻一骨隧道(直径1.5mm，深度为15mm)。于空白对照组骨隧道内注射生理盐水 100μΜ在PMMA诱导组、低浓度UTI组和高浓度UTI组骨隧道内分别植入PMMA颗粒悬液(浓度 为0.5mg/mL)100yL，然后骨蜡封闭骨隧道，术后伤口以庆大霉素冲洗，逐层缝合。术后给予 青霉素2万U/100g肌注，每日1次，连续3d。每日予以PVP碘伤口消毒，连续3d。术后于低浓度 UTI组和高浓度UTI组分别予腹腔内注射乌司他丁 500U/kg. d或5000U/kg. d，连续给药3周。 [0043]三、血清学骨代谢标志物检测：
[0044] 造模3周后，各组大鼠用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉(0.03mL/kg)，麻醉下于下 腔静脉取血100mL，3 000r/min，4°C离心20min，分离血清，置-20°C冰箱冷藏待测。血清试验 前充分混匀，根据酶联免疫法(ELISA)测定说明书(上海蓝基生物科技有限公司）步骤操作， 测得大鼠血清中骨形态蛋白-2 (BMP-2)、I型胶原交联C端肽(CTX-1)及TRACP5b的含量。
[0045] 四、Micro-CT扫描股骨远端进行三维重建及参数分析
[0046] 造模3周后处死各组大鼠，解剖右侧股骨，剔净周围软组织，用浸透生理盐水的纱 布包好，置于_20°C冰箱内保存待测。在相同条件下各组右侧股骨远端骨组织行Micro-CT扫 描，进行骨计量学分析和三维形态重建。分析参数包括骨密度（bone mineral density， BMD)、骨小梁数量(trabecular number，Tb.N)、骨小梁间隙（trabecular spacing，Tb. Sp)、 结构模型指数（structure model index，SMI)及骨容积/总容积（bone volume/total volume,BV/TV,% )〇
[0047] 五、采用免疫组化SP法检测股骨远端骨组织中MMP-9、IL_10和TNF-α表达的阳性细 胞百分数
[0048] 分别于造模1周、2周和3周后，取各组大鼠6只，用质量浓度为10%的水合氯醛腹腔 注射麻醉(〇.〇3mL/kg)，麻醉完成后处死，解剖右侧股骨，剔净周围软组织后取股骨远端骨 组织，以MMP-9、IL-10和TNF-α为抗原进行免疫组织化学检测。组织的前期处理同组织形态 学分析，通过固定、脱钙，并进行石蜡包埋与组织切片。二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水。用质量 百分比为3%的过氧化氢处理20min，以灭活其内源性过氧化物酶。在柠檬酸盐缓冲液(pH = 6.0)中用微波处理（10min，700W)以修复抗原。用PBS和羊血清封闭非特异性结合位点 (30min，室温)后，再用抗PCNA小鼠单克隆抗体（1:50PBS，Sigma公司，美国）或抗VEGF小鼠单 克隆抗体（1:50PBS，Sigma公司，美国）作为一抗过夜孵育。以辣根过氧化物酶标记山羊抗小 鼠抗体(Millipore公司，美国）室温孵育lh。二氨基联苯胺显色，冲洗、复染。对免疫组织化 学结果进行定量分析。
[0049] 六、原代成骨细胞提取及培养
[0050] 造模3周后处死各组大鼠，无菌条件下取出各组大鼠左侧股骨，剔除股骨远端结缔 组织，置于培养皿中，剪成0.5mm X 0.5mm大小碎块，加入质量浓度为0.25 %的胰蛋白酶3ml 于孵箱中孵育20min，弃上清，加人lg/LI型胶原酶6ml，置于孵箱中孵育90min，200目滤网过 滤后1000r/min离心5min，弃上清，加入体积分数为10%的胎牛血清(FCS)，100U/mL青霉素， 100mg/L链霉素的DMEM培养液重悬，接种至25cm2培养瓶，于37°C，体积分数为5%的C02培养 箱培养，48h后换液，以后隔日换一次。当密度达80 %时以1:2传代，用差速贴壁法进行纯化。 各组取第三代成骨细胞，Control组为空白对照组;PMMA组以0.3mg/mL浓度的PMMA进行诱 导;低浓度和高度度的UTI组分别予以500U/mL和5000U/mL的UTI进行预处理;各组细胞均以 无血清培养基培养。72h后在倒置显微镜下观察各组细胞学形态（X 200)。
[0051 ]七、碱性磷酸酶(ALP)染色检测成骨细胞分化情况
[0052] 采用Gomori钙钴法进行ALP染色，具体步骤参照说明书。吸净培养液后用lOmLPBS 清洗2次，4°C95 %乙醇固定10min。吸除乙醇后用蒸馏水清洗，加入孵育液[含2 %巴比妥钠 5mL(m/v)，3%β-甘油磷酸钠5mL(m/v)，2%硫酸镁lmL(m/v)，2%氯化^lOmUm/v)，蒸馏水 10mL]，PH值为9.2~9.4，37 °C孵育5h。吸除染色剂，lOmLPBS清洗2次，室温下自然干燥过夜。 倒置显微镜下拍照观察，采用Image ProPlus软件测定各组培养3d、5d和7d后图像中的阳性 细胞染色面积(表示为阳性染色面积与总面积百分比），并进行定量分析。
[0053]八、茜素红染色检测成骨细胞的矿化程度
[0054]用消化液消化长成单层的成骨细胞3min。无血清α-ΜΕΜ培养液洗涤。用α-ΜΕΜ培养 液(含10 %胎牛血清）吹散成细胞悬液，计数后以1 X 1〇4/孔接种于6孔板共2板，每孔加2mL α-ΜΕΜ培养液(含10%胎牛血清，v/v)预培养24h。随后在PMMA诱导组和UTI处理组中给予矿 化培养基（即用型，PromoCell，妙通，上海)培养，5mLa-MEM中含有50ug/mL抗坏血酸和10mM 甘油磷酸钠，同时添加〇. 5mL共培养上清液（由破骨细胞与牛骨磨片共培养后获得），对照 组加2mLa-MEM培养基(含10%胎牛血清，v/v)。每2天换一次液，每次换液加入液均于换液前 相同。取尽六孔板各孔培养上清液后，培养板用PBS冲洗3次:95%乙醇固定10min:三蒸水冲 洗3次;分别于培养后14d和21d加入质量浓度为0.1 %茜素红-Tris-HCl 2mL(pH = 8.3)，37 °C，孵育30min;三蒸水冲洗数次，干燥，封片；拍照记录，并在倒置显微镜下（X 400)观察矿 化结节形成情况。
[0055]九、流式细胞仪检测成骨细胞凋亡情况
[0056] 把细胞培养液吸出至一合适离心管内，PBS洗涤贴壁细胞一次，加入适量胰酶细胞 消化液(可含有EDTA)消化细胞。室温孵育至轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时，吸除胰 酶细胞消化液。需避免胰酶的过度消化。加入步骤2A中收集的细胞培养液，稍混匀，转移到 离心管内，1000g离心5分钟，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。注意:加入步骤 2A中的细胞培养液一方面可以收集已经悬浮的发生凋亡或坏死的细胞，另一方面细胞培养 液中的血清可以有效抑制或中和残留的胰酶；残留的胰酶会消化并降解后续加入的 Annexin V-FITC导致染色失败。取5-10万重悬的细胞，1000g离心5分钟，弃上清，加入195yL Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。加入5yLAnnexin V-FITC，轻轻混匀。加入10yL碘化 丙啶染色液，轻轻混匀。室温(20-25Γ)避光孵育10-20分钟，随后置于冰浴中。可以使用铝 箱进行避光。孵育过程中可以重悬细胞2-3次以改善标记效果。分别于12h、24h和48h后进行 流式细胞仪检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。
[0057]十、半定量RT-PCR检测促炎症因子和成骨相关基因表达情况 [0058]造模3周后处死各组大鼠，无菌条件下取出各组大鼠右侧股骨，剔除股骨远端结缔 组织，置于液氮中预冷lh，随后置人研钵中，边加液氮边研磨至粉末，立即加入lmL的Trizol 试剂溶解粉末，提取RNA后逆转录成cDNA，于-40°C保存，进行聚合酶链反应时取出模板，总 反应体积20yL:内含2XTaq PCR mix 10yL，Water(nuclease_free)7yL。上、下游引物各 1μ 匕于？〇?仪中94°(：预变性5111丨11;941€305,551€305,72 1€305，进行33个循环；72°(：延伸711^11， 琼脂糖凝胶电泳，分析各组光密度。引物根据Genebank与Primer 5设计，由上海生工合成。 各基因引物序列及分子大小如下(表2)。
[0059] 表2引物序列 [0060]
「00611
[0062] -| 、统计学方法
[0063] 应用SPSS20.0统计软件（Inc,Chicago, Illinois)对所有结果数据进行处理分析， 计量资料以均数土标准差(X±S)表示，两组均数间比较采用t检验；当正态分布、方差齐性 不满足t检验要求时，则采用非参数Mann-Whitney U秩和检验，α水准值取双侧〇. 05。
[0064] 结果
[0065] -、各组大鼠体重变化，如图1所示。
[0066]结果表明：造模2周内，各组大鼠体重呈上升趋势，但各组之间体重差异无显著性。 (Ρ<0·05)(图 1)
[0067]二、血清学骨代谢指标变化(如表3)
[0068] 表3各组大鼠血清TRACP5b、ΒΜΡ-2和CTX-1含量比较(X 土 s)
[0069]
[0070] (注:与空白对照组比较，#Ρ<0·01;与PMMA诱导组比较，*Ρ<0·05;#Ρ<0·01)
[0071] 结果表明：ΡΜΜΑ组大鼠血清骨形成蛋白-2(ΒΜΡ-2)水平较空白对照组明显降低(Ρ <0.05)，但ΡΜΜΑ组大鼠血清TRACP5b水平和CTX-1水平较空白对照组明显升高(Ρ<0.05); UTI组TRACP5b水平和CTX-1水平较ΡΜΜΑ组明显降低(Ρ<0.05)，并呈剂量依赖关系；而UTI组 中ΒΜΡ-2水平较ΡΜΜΑ组明显升高(Ρ<0.05)，并呈剂量依赖关系。（表3)
[0072] 三、股骨远端Micro-CT分析结果
[0073]对四组大鼠股骨远端松质骨均进行Micro-CT检查，相关分析参数统计结果显示， 与空白对照组相比，ΡΜΜΑ诱导组中81?)、113.18￥/1'￥显著下降(？<0.05);而113.3?和3]\〇显著 增加(P<〇.〇5);UTI组与PMMA诱导组比较，81?)、113.18￥/1'￥显著升高（？<0.05)，呈剂量依 赖关系；而Tb.Sp和SMI显著降低(P<0.05)，呈剂量依赖关系(表4);在相同条件下重建股骨 远端松质骨三维图像显示，与空白对照组相比，PMMA诱导组骨小梁变疏松，连续性下降、空 隙率增加;反之，与PMMA诱导组相比，UTI组(500U/kg. d)骨小梁变致密、连续性增加、空隙率 下降，而UTI组(5000U/kg. d)组骨小梁更加致密、空隙率更小。（图2)
[0074]表4各组大鼠股骨远端松质骨Mi cro-CT分析参数(X 土 s)
[0075]
[0076] (注:与空白对照组比较，#Ρ<0·01;与PMMA诱导组比较，*Ρ<0·05;#Ρ<0·01)
[0077] 四、免疫组织化学分析结果
[0078] 造模后1周、2周和3周对各组股骨远端骨组织进行免疫组化分析，结果显示在破骨 细胞上发现有ΜΜΡ-3、TNF-α表达，而在成骨细胞上有IL-10表达。与空白对照组相比，PMMA诱 导组中MMP-3、TNF_a阳性细胞百分率显著升高(P<〇.〇5)，TNF_a在造模后2周升至最高；而 IL-10阳性细胞百分率显著降低(P<0.05)，其在造模后3周降至最低;UTI组与PMMA诱导组 比较，MMP-3、TNF-a阳性细胞百分率显著降低(P < 0.05)，呈剂量依赖关系；而IL-10阳性细 胞百分率显著升高(P<〇.〇5)，并呈剂量依赖关系（图3,4,5);
[0079] 五、成骨细胞培养及碱性磷酸酶(ALP)染色检测细胞分化情况
[0080] 原代成骨细胞培养72h后，在倒置显微镜（X 200)下观察结果显示，空白组细胞饱 满，PMMA诱导组细胞较小，UTI组较PMMA诱导组相比，细胞形态更为饱满（图6A-6D)。在倒置 显微镜（X200)下观察ALP染色结果，可见成骨细胞胞质内有浅棕色至棕黑色颗粒，数量及 深浅不一。PMMA诱导组较空白对照浅棕色至棕黑色颗粒明显减少，而UTI组与PMMA诱导组相 比，胞质内浅棕色至棕黑色颗粒显著增加。定量分析结果显示，共培养3d、5d和7d后，与空白 组相比，PMMA组中ALP染色区域所占面积百分比和ALP活性均显著降低(P < 0.05 )，呈时间依 赖关系；而与PMMA组相比，UTI(500U/kg.d)组和UTI(5000U/kg.d)组的ALP染色区域所占面 积百分比和ALP活性均均显著增加(P<0.05)，呈时间剂量依赖关系。（图6E-6H，表5)
[0081 ]表5碱性磷酸酶法检测各组各时间点ALP染色区域所占面积的变化（％，x土s)
[0082]
[0083] (注:与空白对照组比较，#Ρ<0·01;与PMMA诱导组比较，*Ρ<0·05;#Ρ<0·01)
[0084] 六、茜素红染色检测成骨细胞的矿化程度
[0085] 结果显示，各组培养14d和21d后，在倒置显微镜下观察（Χ400)见空白组有较大的 矿化结节，且染色较深，呈红褐色;PMMA组未见明显的矿化结节;而UTI (500U/kg. d)组和UTI (5000U/kg.d)组有明显矿化结节形成，但与空白对照组比较，矿化结节较小，较稀疏，且染 色较浅（图7)。
[0086]七、流式细胞仪检测成骨细胞凋亡情况
[0087]结果显示，成骨细胞培养12h后，各组细胞凋亡率之间差异性无显著性(P>0.05); 但培养24h和48h后，与空白对照组相比，PMMA诱导组成骨细胞凋亡率显著升高(P<0.01); 而UTI组与PMMA诱导组相比，成骨细胞凋亡率则显著降低(P<0.05)，呈剂量时间依赖关系。 (表6,图8)
[0088]表6流式细胞仪各组各时间点成骨细胞凋亡率的变化（％，x±s)
[00891
[0090] (注:与空白对照组比较，#Ρ<0·01;与PMMA诱导组比较，*Ρ<0·05;#Ρ<0·01)
[0091] 图8为流式细胞仪(AnnexinV/PI法)检测各组培养48h后MC3T3-E1成骨细胞凋亡率 情况；图中A-D分别为空白对照组、PMMA组、UTI (500U/kg. d)组和UTI (5000U/kg. d)组。图中 左下象限(AnnexinV-/PI-细胞)显示正常存活细胞;右下象限(AnnexinV+/PI-细胞)显示早 期凋亡细胞，膜结构仍完整;右上象限(AnnexinV+/PI+细胞）显示晚期凋亡或坏死细胞，膜 结构破坏。与空白对照组比较，PMMA组右下象限的早期凋亡细胞和右上象限的晚期凋亡细 胞显著增多;UTI(500U/kg.d)组和UTI(5000U/kg.d)组右下象限的早期凋亡细胞和右上象 限的晚期凋亡细胞较骨水泥组显著降低。
[0092] 八、RT-PCR检测促炎症因子和成骨基因表达情况
[0093] 结果显示，与空白对照组相比，共培养9d后PMMA诱导组中促炎症因子IL-6、TNF_a、 MMP-9mRNA的表达显著升高(P<0.05)，而Runx2、osterix和OPG mRNA的表达则显著降低(P <0.01);与PMMA诱导组相比，UTI组中L-6、TNF-a、MMP-9mRNA的表达显著降低，呈剂量依赖 关系(P<0.05)，而成骨基因 Runx2、osterix和OPG mRNA的表达显著升高，呈剂量依赖关系 (Ρ<0·05)(图 9A-9F，表 7)。
[0094]表 7 各组 11^-6、了陬-〇、丽?-9、1?111?2、〇8七641和0?6 1111?熟表达水平（1±8)
[0095]
[0096] (注:与空白对照组比较，#Ρ<0·01;与PMMA诱导组比较，*Ρ<0·05;#Ρ<0·01)
[0097] 结论：
[0098] (1)在骨水泥颗粒诱导的炎性骨溶解动物模型中，乌司他丁可增加炎性骨组织的 骨密度，改善骨小梁的完整性和连续性，对发生炎性骨溶解的骨组织具有一定的保护作用。
[0099] (2)乌司他丁抑制了炎性骨溶解过程中促炎症因子如TNF-a、MMP_9的释放，但促进 了成骨因子IL-10的表达。
[0100] (3)乌司他丁可显著降低血清中抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP5b)和I型胶原交联 C端肽(CTX-1)的水平，但显著升高骨形态蛋白-2 (BMP-2)的水平。
[0101] (4)乌司他丁可抑制骨水泥颗粒诱导的成骨细胞凋亡，对成骨细胞的分化、成熟及 矿化具有一定的保护作用。
[0102] (5)乌司他丁可抑制促炎症因子IL-6、TNF-a、MMP-9mRNA的表达，但显著增加成骨 相关基因如此1?2、〇8丨61^1、0?6和1^13口1]11?祖的表达，证实乌司他丁可能对成骨细胞和破 骨细胞具有双向作用。
【主权项】
1. 乌司他丁在制备防治"颗粒病"药物中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的药物包括乌司他丁和药学上可接受 的载体或者常规辅料。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的药物为药学上可接受的剂型。
【文档编号】A61K38/57GK105833258SQ201610431742
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年6月16日
【发明人】茹江英, 王艳芬, 徐海栋, 康文博, 时代, 潘晓瑾
【申请人】扬州市第人民医院, 扬州市第一人民医院