一种金黄色葡萄球菌疫苗及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种金黄色葡萄球菌疫苗及其制备方法，利用辐射对金黄色葡萄球菌进行灭活处理，并加入佐剂，在使其丧失增殖活性的同时，保留其代谢活性，与热灭活和甲醛等化学灭活相比，使菌体表面的蛋白与多糖抗原得到了良好保留，可诱导全面、显著的免疫应答与免疫保护。制备方法简单、便捷，适用于金黄色葡萄球菌疫苗的大规模制备，除用于制备金葡菌疫苗外，还可作为生物威胁或新出现病原体的快速应答策略，尤其是对于免疫应答机制尚不明确的病原体，可采用此种方法迅速得到候选疫苗，缩短了研发时间，并降低研发成本。
【专利说明】
一种金黄色葡萄球菌疫苗及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及微生物疫苗领域，具体涉及一种金黄色葡萄球菌疫苗及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是人类的一种重要病原菌，引起许多 严重感染。金黄色葡萄球菌一般存在于食品中，通过传播引起人类食物中毒，也可引起肺 炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染，具有严重的危害性。对于金黄 色葡萄球菌的预防措施，目前主要为加强感染控制，使用抗生素，清除携带的金葡菌和免疫 学方法。其中免疫学方法主要是通过接种金黄色葡萄球菌疫苗，提升体内抗体抗性，增强细 胞免疫性能，是非常有效的方法。
[0003] 公开号CN103705914A的中国发明专利公开了一种四组分金葡菌疫苗，包括Mntc (锰离子转运蛋白）、SEB(肠毒素 B)突变体、HI蛋白（由α溶血素 Hla与铁离子表面决定蛋白 IsdB融合而成）以及SpA5(葡萄球菌A蛋白5)。但该疫苗未覆盖金葡菌的多糖抗原以及其他 大部分蛋白抗原。
[0004] 公开号CN101914144A的中国发明专利公开了一种金葡菌荚膜多糖和蛋白质偶联 物。以伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白为载体，与金葡菌荚膜多糖进行化学偶联，通过鞭毛蛋白的免 疫佐剂功能增强荚膜多糖的免疫原性。但该疫苗中缺乏金葡菌的蛋白抗原，且美国一种金 葡菌荚膜多糖与载体蛋白的结合疫苗经历了 3期临床试验失败，提示仅基于荚膜多糖的金 葡菌疫苗保护力不足。
[0005] 公开号CN102743747A的中国发明专利公开了由减毒的金葡菌α-溶血素抗原与一 种或多种其他细菌抗原结合形成的疫苗。但该疫苗仅针对金葡菌分泌的外毒素，难以提供 针对菌体本身的保护力。
[0006] 公开号CN101466406的中国发明专利公开了 一种包含5种组分的金葡菌疫苗，即金 葡菌5型荚膜多糖、8型荚膜多糖、336抗原、α-毒素抗原以及杀白细胞素抗原。但该疫苗仍然 存在抗原覆盖性不够的问题，且基于5型和8型荚膜多糖的金葡菌疫苗经历了 3期临床试验 失败，在此基础上仅添加3种抗原后是否能提供足够的保护力仍难以确定。
[0007] 公开号CNCN1708506A的中国发明专利公开了一种疫苗，用葡萄球菌的脱乙酰聚Ν-乙酰基葡糖胺诱导针对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌以及其他葡萄球菌的免疫反应。但 该疫苗使用一种多糖作为抗原，其免疫原性显著弱于蛋白抗原，很难提供充分的保护作用。
[0008] 公开号CN101066463A的中国发明专利公开了一种金葡菌DNA疫苗，将金葡菌FnBP (纤连蛋白结合蛋白）和TRAP蛋白的抗原决定簇融合后构建到pcDNA3.1 ( + )载体中。但该疫 苗的缺点同样在于抗原覆盖面有限，难以针对金葡菌的多糖抗原提供保护。且DNA疫苗的免 疫原性较弱仍然是一大技术瓶颈。
[0009] 公开号CN104093418A的中国发明专利公开了 一种包含多种组分的金葡菌疫苗，以 金葡菌蛋白EsxA、EsxB、Sta006、StaO 11以及α溶血素(Hla)突变体为抗原，通过加入TLR激动 剂和铝佐剂增强其免疫原性。但该疫苗的5个组分中有3个为外毒素，难以覆盖金葡菌的大 部分菌体蛋白和多糖。
[0010]综上所述，现有制备金黄色葡萄球菌的方法均是将金黄色葡萄球菌的一个单体或 多个组分结合作为抗原制备疫苗，主要采用大肠杆菌表达金葡菌的一种或多种抗原蛋白， 与佐剂吸附后即为疫苗;或是提取并纯化金葡菌的荚膜多糖，并加入表达的一种或多种金 葡菌抗原蛋白；或是表达并纯化金葡菌分泌的一种或多种外毒素作为抗原，与载体蛋白结 合以增强其免疫原性;或是将金葡菌一种或多种蛋白抗原决定簇编码序列插入质粒，构建 金葡菌DNA疫苗。但这些方法免疫原性不如全菌体疫苗，未涵盖大部分毒性蛋白，荚膜多糖 覆盖性不够，适用范围窄等问题。因此研究一种提高免疫性，荚膜多糖增强覆盖性，适用范 围广的金黄色葡萄球菌疫苗。
【发明内容】
[0011 ]为了上述的不足和缺陷，本发明提出了一种安全性高，保留抗原结构，免疫保护全 面，免疫性高，荚膜多糖覆盖性强，适用性广的金黄色葡萄球菌疫苗及其制备方法。
[0012] 为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现的：
[0013] -种金黄色葡萄球菌疫苗的制备方法，包括以下步骤：
[0014] (1)菌体培养:将金葡菌菌液接种于平板培养基上，进行菌落培养后，再将菌落接 种于含有胰蛋白胨肉汤的培养基中进行对数培养；
[0015] (2)菌体提取:将步骤(1)中所述培养后的菌液进行离心，去除培养基，得到菌体沉 淀;用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤并重悬至菌体浓度为5 X 108/ml-2 X 109/ml;
[0016] (3)菌体处理:将步骤(2)中得到的菌液置于低温环境下，用γ射线、紫外线或X射 线进行辐射处理后，进行菌体部分保留代谢活性检验和无增殖活性检验；
[0017] (4)疫苗配制:再将步骤(3)中检验合格的菌液加入佐剂，充分混合，得到金黄色葡 萄球菌疫苗；
[0018] 所述佐剂为氢氧化铝或磷酸铝溶液。
[0019] 优选的，步骤(1)所述的平板培养基为血平板，培养温度为37°C，培养时间为24h。
[0020] 优选的，步骤(1)所述对数培养为振荡培养，转速为220rpm，温度为37°C，培养时间 为16-20h。
[0021 ]优选的，步骤(2)中所述重悬后菌体浓度为1 X 109/ml。
[0022]优选的，步骤(3)中菌液采用γ射线进行辐射，所述γ射线辐射剂量为2-30kGy。
[0023] 优选的，上述所述γ射线辐射剂量为2-8kGy。
[0024] 优选的，所述步骤(4)菌体部分保留代谢活性检验合格为辐射后细菌代谢活性与 未辐射细菌的比例为20-80%。其中检验方法采用现有技术进行代谢活性检验。
[0025] 优选的，所述步骤(3)菌体无增殖活性检验方法为将辐射后的菌体置于LB琼脂平 板上，在37 °C的温度下培养24_48h，确定无菌落生长，辐射后的细菌应完全丧失增殖活性。
[0026] 优选的，所述佐剂为氢氧化铝，佐剂终浓度0.5-lmg/ml。加入增强佐剂能够提高疫 苗的免疫原性。
[0027] 上述所述用于制备疫苗的金黄色葡萄球菌可为标准株、临床分离株或商品化菌 株。
[0028] -种根据上述制备方法得到的金黄色葡萄球菌疫苗，用于预防金黄色葡萄球菌引 起的疾病，疫苗使用方式可为皮下注射、肌肉注射、口服、鼻腔滴注，优选为皮下注射。
[0029] 本发明金黄色葡萄球菌疫苗及其制备方法，收集处于对数生长期的金黄色葡萄球 菌菌体，对其进行适当剂量的辐射处理，加入佐剂即得到金黄色葡萄球菌疫苗。通过辐射处 理金黄色葡萄球菌，使其丧失增殖活性，不能继续生长，保留了其抗原结构，可诱导针对菌 体大部分蛋白与多糖的免疫应答，从而提供全面的免疫保护。辐射后保留了代谢活性，对于 诱导特异性的CTL细胞免疫同样具有重要作用，其安全性与蛋白疫苗及DNA疫苗一样具有保 障，而福射对菌体蛋白与多糖抗原影响很小，而蛋白疫苗和DNA疫苗往往不能有效诱导细胞 免疫。与热灭活和化学试剂灭活相比，辐射灭活对细菌表面蛋白及多糖抗原的破坏较小，使 细菌的免疫原性得到了良好保留。动物实验表明，经过辐射灭活的金黄色葡萄球菌在小鼠 中可诱导针对金黄色葡萄球菌攻击的保护作用，降低小鼠死亡率。目前未见通过辐射灭菌 制备金黄色葡萄球菌全菌体疫苗的相关报道。
[0030] 本发明金黄色葡萄球菌疫苗及其制备方法，与现有技术相比，其有益效果在于：
[0031] (1)本发明利用辐射对金黄色葡萄球菌进行灭活处理，在使其丧失增殖活性的同 时，保留其代谢活性，与热灭活和甲醛等化学灭活相比，使菌体表面的蛋白与多糖抗原得到 了良好保留，可诱导全面、显著的免疫应答与免疫保护。
[0032] (2)本发明采用辐射处理金黄色葡萄球菌，保留其代谢活性，病原体代谢活性在诱 导保护性应答中发挥积极作用，同热灭活或化学灭活疫苗相比，辐射灭活对细菌表面蛋白 及多糖抗原的破坏较小，使细菌的免疫原性得到了良好保留；同时加入佐剂，提高疫苗的抗 病性能。
[0033] (3)本发明制备方法简单、便捷，适用于金黄色葡萄球菌疫苗的大规模制备，除用 于制备金葡菌疫苗外，还可作为生物威胁或新出现病原体的快速应答策略，尤其是对于免 疫应答机制尚不明确的病原体，可采用此种方法迅速得到候选疫苗，缩短了研发时间，并降 低研发成本。
【附图说明】
[0034] 图1是采用本发明疫苗与对照组的对比试验结果图。
【具体实施方式】
[0035]下面结合具体实施例和图1来进一步详细说明本发明。
[0036] 实施例1
[0037] -种金黄色葡萄球菌疫苗的制备方法，包括以下步骤：
[0038] (1)取金黄色葡萄球菌标准株ATCC 25923菌液接种于血平板，37°C培养24h;
[0039] (2)挑取1个菌落，接种至经高压灭菌的胰蛋白胨肉汤，37°C振荡培养18h至OD6q0为 0.6-0.8，转速为220印111;
[0040] (3)在转速3000rpm离心10min，弃去上清，用无菌roS重悬沉淀后再次离心，重复3 次，以去除培养基与代谢产物，最后一次离心后得到的沉淀用无菌PBS重悬，使其浓度为IX 109/ml；
[0041] (4)将菌液置于冰上，用γ射线发生装置进行辐射处理，辐射强度为10Gy/min，辐 射时间为l〇h，总剂量为6kGy;
[0042] (5)吸取步骤(4)中辐射处理后的菌液10μ1进行无增殖活性检验，具体为：用经高 压灭菌的LB培养基稀释10倍，涂布于LB琼脂平板上，37 °C培养48h，确定无菌落生长；
[0043] (6)米用Cell Titer 96Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay试剂 盒(Promega)评估辐射后细菌与未辐射细菌的代谢活性。具体为:将适当稀释后的辐射后菌 液与未辐射菌液分别加到96孔板中（均做8个复孔），加入含有底物MTS和电子偶联剂PES的 反应溶液，37 °C孵育lh，用酶标仪测定490nm处的吸光度(OD490)，计算8孔平均值，福射后菌 液与未辐射菌液〇D49Q的比值为47%。
[0044] (7)在菌液中加入氢氧化铝佐剂，佐剂终浓度为0.5mg/ml，充分混合，即得到金黄 色葡萄球菌疫苗。
[0045] 实施例2
[0046]金葡菌疫苗免疫保护力的验证
[0047]在4-6周龄Balb/c小鼠中检测金黄色葡萄球菌疫苗的保护性，免疫组和对照组各 10只，免疫组和对照组如表1所示：
[0050] 表 1
[0051] 初次免疫后2周用表1中相同剂量进行第2次免疫注射;初次免疫后3周用表1相同 剂量进行末次免疫注射;末次免疫后2周，对小鼠腹腔注射0.5ml致死剂量金黄色葡萄球菌 ATCC 25923,细菌数量约为1 X 107。观察小鼠的发病和死亡情况，2周后统计免疫组和对照 组小鼠的生存率。具体结果如图1所示。
[0052]由图1可知，免疫组和对照组小鼠的生存率分别为90 %和10 %，保护率为88.9 %， 本实施例1中所得到的金黄色葡萄球菌疫苗的保护性高。
[0053]以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例 对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本 发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方 式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
【主权项】
1. 一种金黄色葡萄球菌疫苗的制备方法，其特征在于:包括以下步骤： (1) 菌体培养:将金葡菌菌液接种于平板培养基上，进行菌落培养后，再将菌落接种于 含有胰蛋白胨肉汤的培养基中进行对数培养； (2) 菌体提取:将步骤（1)中所述培养后的菌液进行离心，去除培养基，得到菌体沉淀； 用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤并重悬至菌体浓度为5 X 108/ml-2 X 109/ml; (3) 菌体处理:将步骤(2)中得到的菌液置于低温环境下，用γ射线、紫外线或X射线进 行辐射处理后，进行菌体部分保留代谢活性检验和无增殖活性检验； (4) 疫苗配制:再将步骤(3)中检验合格的菌液加入佐剂，充分混合，得到金黄色葡萄球 菌疫苗； 所述佐剂为氢氧化铝或磷酸铝溶液。2. 根据权利要求1所述的金黄色葡萄球菌疫苗的制备方法，其特征在于：步骤（1)所述 的平板培养基为血平板，培养温度为37 °C，培养时间为24h。3. 根据权利要求1所述的金黄色葡萄球菌疫苗的制备方法，其特征在于：步骤（1)所述 对数培养为振荡培养，转速为220rpm，温度为37°C，培养时间为16-20h。4. 根据权利要求1所述的金黄色葡萄球菌疫苗的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所 述重悬后菌体浓度为1 X l〇9/ml。5. 根据权利要求1所述的金黄色葡萄球菌疫苗的制备方法，其特征在于：步骤(3)中菌 液采用γ射线进行辐射，所述γ射线辐射剂量为2_30kGy。6. 根据权利要求5所述的金黄色葡萄球菌疫苗的制备方法，其特征在于:所述γ射线辐 射剂量为2_8kGy。7. 根据权利要求1所述的金黄色葡萄球菌疫苗的制备方法，其特征在于:所述步骤(3) 菌体部分保留代谢活性检验合格为辐射后细菌代谢活性与未辐射细菌的比例为20-80 %。8. 根据权利要求1所述的金黄色葡萄球菌疫苗的制备方法，其特征在于:所述步骤(3) 菌体无增殖活性检验方法为将辐射后的菌体接种于LB琼脂平板上，在37°C的温度下培养 24-48h，确定无菌落生长。9. 根据权利要求1所述的金黄色葡萄球菌疫苗的制备方法，其特征在于:所述佐剂为氢 氧化铝，佐剂终浓度为0.5-lmg/ml。10. -种根据权利要求1-9任意一项所述制备方法得到的金黄色葡萄球菌疫苗。
【文档编号】A61K39/085GK105833259SQ201610227955
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年4月12日
【发明人】沈玉保, 李竹石, 魏宪义, 蒋德席
【申请人】四川远大蜀阳药业股份有限公司