布鲁氏菌多表位融合蛋白疫苗的制备及应用
【专利摘要】本发明公开了布鲁氏菌多表位融合蛋白抗原，是将布鲁氏菌外膜蛋白BP26、OMP31、OMP16、OMP2b优势抗原表位的氨基酸序列进行串联，构建了融合蛋白基因，表达了蛋白，制备了布鲁氏菌多表位融合蛋白抗原疫苗。小鼠攻毒实验表明对布鲁氏菌感染具有免疫保护性。
【专利说明】
布鲁氏菌多表位融合蛋白疫苗的制备及应用
技术领域
[0001] 本发明涉及分子生物学技术和免疫学领域。具体涉及一种布鲁氏菌多表位融合蛋 白抗原及其在制备布鲁氏菌病苗方面的应用。
【背景技术】
[0002] 近年来，随着经济全球化的快速发展，新的传染病不断发生，一些旧的传染病也开 始死灰复燃，尤其是对人类危害较为严重的布鲁氏菌病，近几年发病率呈逐年增加的趋势， 给世界各国带来巨大的公共卫生问题和经济损失。
[0003] 布鲁氏菌病是由布鲁氏菌侵入机体引起的一种人兽共患传染病。人群感染布鲁氏 菌后可引起发热、多汗、乏力、游走性关节痛等全身性症状，严重者出现肝脾及睾丸肿大，关 节变形，最终丧失劳动能力和生育能力;动物在感染布鲁氏菌后，公畜会出现睾丸肿大，影 响繁殖和配种，母畜可能出现流产、早产，而且流产胎儿、胎衣、阴道分泌物等含有大量的细 菌，如果不及时消毒，还可能引起同群动物感染或者感染人类。布鲁氏菌进入机体后主要在 细胞内寄生，并进行繁殖，因此，一般药物很难发挥药效，且复发率很高，目前没有理想的治 疗布鲁氏菌病药物，疫苗预防是防控该病的最为有效的手段。目前布鲁氏菌疫苗种类较多， 主要包括弱毒活疫苗、灭活疫苗、突变株疫苗、DNA疫苗等 [1]。由于这些疫苗都存在着动物流 产、免疫效果不好等缺点，目前为止还没有特别理想的布鲁氏菌疫苗应用于布鲁氏病的防 控。因此研制新型、有效疫苗是目前防控布鲁氏病的研究热点。
[0004] 基因工程亚单位疫苗和融合蛋白疫苗是布鲁氏菌病疫苗研究的一个重要的方向， 其原理是用DNA重组技术，将编码病原微生物特异性抗原表位的基因导入工程菌(受体菌） 或细胞，使其在受体细胞中高效表达出来，然后加入免疫佐剂后制成疫苗，其优点在于能够 延长保护期限、不会出现减毒活疫苗转变致病力而导致人或动物致病、防止动物出现流产、 稳定性好等。因此，本研究拟利用生物信息学技术预测布鲁氏菌主要保护性抗原的B细胞、T 细胞优势抗原表位，利用免疫学技术筛选理想的表位，再利用融合蛋白技术将优势表位进 行串联制备出具有自主创新性的、免疫原性好的新型疫苗，为布鲁氏菌病的预防和控制提 供良好的手段。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是，提供一种布鲁氏菌多表位融合蛋白抗原。
[0006] 布鲁氏菌多表位融合蛋白抗原，它的氨基酸序如序列表SQ ID No. 1所示。
[0007] 布鲁氏菌多表位融合蛋白抗原，它的碱基序如序列表SQ ID No.2所示。
[0008] 布鲁氏菌多表位融合蛋白抗原疫苗，它是权利要求1所述的布鲁氏菌多表位融合 蛋白抗原。
[0009] 本发明提供了布鲁氏菌多表位融合蛋白抗原，是将布鲁氏菌外膜蛋白BP26、 0MP31、0MP16、0MP2b优势抗原表位的氨基酸序列进行串联，构建了融合蛋白基因，表达了蛋 白，制备了布鲁氏菌多表位融合蛋白抗原疫苗。小鼠攻毒实验表明对布鲁氏菌感染具有免 疫保护性。
【附图说明】
[0010] 图1布鲁氏菌rMEP表达及定位(M:蛋白Marker; 1:诱导前;2:37°C诱导4h的上清； 3:37°C诱导4h的沉淀）； 图2布鲁氏菌rMEP镍琼脂糖亲和层析SDS-PAGE结果(M:Protein marker; 1:上样；2:流 出；3: 10mmol/L Imidazole洗脱组分；4:20 mmol/L Imidazole洗脱组分；5-8:50 mmol/L Imidazole洗脱组分；9:500 mmol/L Imidazole洗脱组分）； 图3布鲁氏菌rMEP阴离子交换层析SDS-PAGE结果(M:Protein marker; 1:上样;2:流出； 3: 50 mmol/L NaCl洗脱组分;4-7:100 mmol/L NaCl洗脱组分;8-10:150 mmol/L NaCl洗 脱组分；11:200 mmol/L NaCl洗脱组分；12:300 mmol/L NaCl洗脱组分；13:1 mol/L NaCl 洗脱组分）； 图4布鲁菌rMEP表达SDS-PAGE鉴定结果(M为蛋白质Marker; 1为布鲁菌多表位融合蛋 白）； 图5布鲁菌rMEP表达Western Blot鉴定结果(M为蛋白质Marker; 1为布鲁菌多表位融 合蛋白）； 图6三组小鼠血清中特异性抗体水平测定结果； 图7三组小鼠血清中特异性抗体亚型测定结果； 图8三组小鼠脾细胞培养上清液中细胞因子IFN- γ和IL-6测定； 图9三组小鼠 CTL活性检测结果； 图10三组小鼠 Τ细胞亚型检测结果。
【具体实施方式】
[0011]下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施中未注明具体条 件的实验方案，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。
[0012] 实施例1布鲁氏菌多表位融合基因的设计及质粒的构建 从Pubmed数据库中调取布鲁氏菌优势外膜蛋白的氨基酸序列，采用BepiPred (http://www.cbs.dtu.dk/services/Bepipred/)， ABCpred (http:// www. imtech. res . in/ raghava/abcpred/)和COBEpro (http:// scratch. proteomics. ics. uci. edu/)等软件对布鲁氏菌外膜蛋白的B细胞表位进行预测，采用IEDB (http:// tools, iedb .org/main/tcell/)网站的T细胞表位预测工具对T细胞表位进行预测，采用BLASTP analysis对抗原表位进行相似性分析，选择优势抗原表位，在相邻表位之间加入一段连接 肽序列，采用DNA Star对抗原表位的串联顺序和连接肽的种类进行优化，选择免疫原性好 的序列作为目的融合蛋白疫苗的氨基酸序列，用于下一步布鲁氏菌rMEP疫苗的表达及应用 研究。
[0013] 采用DNAStar对所设计的布鲁氏菌rMEP疫苗的α螺旋、β折叠、柔性、亲水性、抗原性 等免疫学参数进行预测，根据设计好的布鲁氏菌rMEP疫苗的氨基酸序列进行密码子优化 后，人工合成或PCR方法构建融合蛋白基因序列如SEP ID N0.2所示，将所构建的融合蛋白 基因连接于PET-28b载体的多克隆酶切位点处。
[0014] 上述步骤中的选取的优势外膜蛋白为布鲁氏菌8?26、01^31、01^16和01^213。
[0015]上述步骤中的抗原表位见表1。
[0016] 上述连接肽序列Linker的编码"GGGS"。
[0017] 实施例2布鲁氏菌rMEP的表达 表达宿主菌大肠杆菌BL2UDE3)菌种由吉林大学公共卫生学院卫生检验教研室保存； 含布鲁氏菌rMEP疫苗碱基序列的表达载体pET-28b质粒由实施例1中所构建;各种分子生物 学试剂均购于生物试剂公司。
[0018] 将实施例1中获得的pET-28b质粒转化大肠杆菌BL2UDE3)表达菌，42°C热击90s， 冰上静置2min后涂LA平板(含30yg/mL卡那霉素），37°C培养过夜。挑取表达菌株的单个菌落 于4mL LB培养基(含30yg/mL卡那霉素）中，37°C，220r/min培养18~24h。取0.4mL培养物加入 到4mL新鲜的LB培养基(含30yg/mL卡那霉素冲继续培养，当菌液的OD600达到0.6左右时，添 加终浓度为0.5mmol/L的IPTG，37°C，220r/min诱导4h，同时设定未添加 IPTG诱导剂的作为 阴性对照。12000r/min离心10min，收集菌体。采用SDS-PAGE检测布鲁氏菌rMEP疫苗的表达 情况及定位，结果如附图1所示。结果显示宿主菌经诱导后在细菌沉淀与上清中均有目的融 合蛋白表达，且在菌体沉淀中表达量最高，说明所表达的布鲁氏菌融合蛋白为包涵体蛋白。
[0019] 为了获得可溶性的布鲁氏菌rMEP，将收集的菌体用破碎缓冲液(0.05m〇VL Tris， 0.3 mol/LNaCl，0.1% Trition X-100，pH=8.0)重悬后，冰浴中超声破碎菌体，超声功率为 400W，20min(超声2s，暂停6s)，超声后，12000r/min，4°C离心20min，弃上清，沉淀用包涵体 溶解缓冲液（〇.〇〇8mol/L尿素，0.05mol/L Tris，0.3 mol/LNaCl，0.1%Triton X-100，pH= 8.0)溶解，冰浴中超声破碎菌体，超声功率为400W，20min(超声2s，暂停6s)，12000r/min，4 °C离心20min，弃沉淀，上清中含有目的融合蛋白，进行下一步纯化。
[0020] 实施例3布鲁氏菌rMEP的纯化 取上述实施例2超声破碎后的上清液，所述细菌上清液中含有布鲁氏菌可溶性rMEP，采 用镍琼脂糖亲和层析和阴离子交换层析对上清液中的布鲁氏菌可溶性rMEP进行纯化，具体 纯化液和纯化方法按照相关试剂盒的说明书进行配制和操作，将收集的纯化蛋白液的各洗 脱组分经SDS-PAGE检测后，将高纯度组分透析到roS缓冲液(含0. l%SKL，pH=7.4)中，4°C透 析过夜，0.4 5 μ m滤膜过滤除菌后分装，置于-8 0 °C冰箱长期保存。采用S D S - P A G E电泳和 Western Blot检测对纯化后的融合蛋白进行检测，结果如附图4和附图5所示，所表达的融 合蛋白分子量位于60kD左右，条带清晰且没有杂带。经SK3071非干扰型蛋白浓度测定试剂 盒测定蛋白浓度，标准曲线方程为y=-〇. 0054x+0.9946，R2=0.9946，经计算，纯化后的蛋白 浓度为 1.39mg/mL。
[0021] 实施例4布鲁氏菌rMEP疫苗的制备及小鼠免疫 取上述实施例3纯化的布鲁氏菌rMEP，用无菌roS缓冲液调整蛋白浓度为600yg/mL，与 等体积的弗氏完全佐剂（或弗氏不完全佐剂）混合至完全乳化状态，即为布鲁氏菌rMEP疫 苗。取布鲁氏菌疫苗株M5-90,调整菌浓度为2X10 9CFU/mL，与等体积的弗氏完全佐剂(或弗 氏不完全佐剂)混合至完全乳化状态，即为对照疫苗。取无菌PBS，与等体积的弗氏完全佐剂 (或弗氏不完全佐剂)混合至完全乳化状态，即为阴性疫苗。
[0022]取BALB/c小鼠30只，标记后适应性饲养一周，均无异常，将小鼠随机分为三组，第 一组小鼠免疫布鲁氏菌rMEP疫苗，第二组小鼠免疫对照疫苗，第三组小鼠免疫阴性疫苗，作 为空白对照组。小鼠免疫途径为腹腔注射。初次免疫采用弗氏完全佐剂疫苗进行免疫，初次 免疫后15天、30天和45天采用免疫弗氏不完全佐剂疫苗加强免疫，免疫途径均为腹腔注射， 剂量均为l〇〇yL/只，每次免疫前均采用尾静脉采血的方式收集血清，-70°C保存备用。
[0023]实施例5布鲁氏菌rMEP疫苗的免疫保护效果评价及应答分析 (1)小鼠血清中特异性抗体水平测定 采用间接ELISA法检测免疫前后小鼠血清中特异性抗体水平的变化，具体操作步骤为： 用实施例3纯化的布鲁氏菌rMEP、布鲁氏菌疫苗株M5-90分别包被酶标板，lOOyL/孔，4°C过 夜，PBST拍洗三次后，用1%BSA封闭37°C封闭2h，300yL/孔，加入1: 200开始倍比稀释的血清 样品，100μL7孔，37 °C孵育lh，TOST拍洗三次后，加入1:10000稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗， lOOyL/孔，37°C孵育lh，PBST拍洗三次后，加入TMB显色液，lOOyL/孔，室温避光反应15min， 加入2M H2S〇4,50yL/孔终止反应，酶标仪读取0D450。结果如图6所示，免疫布鲁氏菌rMEP和 布鲁氏菌疫苗株M5-90后，小鼠体内均能够产生特异性抗体，而且免疫布鲁氏菌rMEP的小鼠 体内出现特异性抗体的时间早于免疫布鲁氏菌疫苗株M5-90的小鼠。
[0024] (2 )小鼠血清中特异性抗体亚型测定 米用抗体亚型测定试剂盒（Cat.5300-5; Southern Biotech, Birmingham, AL, USA) 检测小鼠阳性血清中总IgG、IgM、IgG 1、IgG2a、IgG2b和IgG3的水平，具体操作步骤为：用实 施例3纯化的布鲁氏菌rMEP、布鲁氏菌疫苗株M5-90和捕获抗体包被酶标板，lOOyL/孔，4°C 过夜，PBST拍洗三次后，用1%BSA封闭37 °C封闭lh，300yL/孔，加入1:1000稀释的小鼠血清样 品，100μL7孔，37 °C孵育lh，PBST拍洗三次后，加入1:500稀释的HRP标记的亚型抗体，lOOyL/ 孔，37 °C孵育lh，PBST拍洗三次后，加入ABTS显色液，lOOyL/孔，室温避光反应10~20 min，加 入2M H2S〇4，50μ!7孔终止反应，酶标仪读取0D450。结果如图7所示，免疫布鲁氏菌rMEP疫苗 和疫苗株M5-90后，小鼠血清中的I gM、I gG 1、I gG2a、I gG2b和I gG3均较阴性对照组升高明 显，而且免疫布鲁氏菌rMEP小鼠血清中的I gG 1、I gG2a、I gG2b和I gG3水平明显高于阴性对 照组和疫苗株M5-90组，说明所制备的布鲁氏菌rMEP疫苗能够引起刺激机体产生强烈的体 液免疫应答。
[0025] (3)小鼠脾淋巴细胞分离 最后一次免疫结束后两周，颈椎脱白处死小鼠，体表消毒后无菌分离小鼠脾脏，将脾脏 置于钢网上，加入适量1640培养基轻轻研磨脾脏，制备单细胞悬液，lOOOr/min离心5min后， 弃上清，加入10mL红细胞裂解液，静止5min，1000r/min离心5min，用1640培养基离心洗涤 细胞两次，将细胞重悬于1640培养基中，得到小鼠脾淋巴细胞单细胞悬液。
[0026] (4)细胞因子IFN- γ和IL-6测定 取上述小鼠脾淋巴细胞单细胞悬液，用含10%胎牛血清的1640培养调整细胞浓度为2 X 106个/mL，加入到24孔板中，每孔2mL，37 °C，5%C02培养过夜，弃去培养液，每孔分别加入lmg/ mL融合蛋白、PBS或者2.5 mg/mL ConA，37°C，5%C02培养48h，收集上清，用于细胞因子的测 定。采用IFN-γ和IL-6细胞因子测定试剂盒(Peprotech，RockyHill，NJ，USA)测定脾细 胞培养上清液中IFN- γ和IL-6的水平，具体操作步骤为：用试剂盒中的捕获抗体包被酶标 板，1〇〇μL7孔，4 °C过夜，PBST拍洗三次后，用1%BSA，300yL/孔，封闭室温封闭，每孔分别加入 不同浓度的标准品或脾细胞培养上清液，l〇〇yL/孔，室温孵育2h，PBST拍洗三次后，加入生 物素标记的检测抗体，lOOyL/孔，室温孵育2h，PBST拍洗三次后，加入亲和素标记的HRP，1: 2000稀释，lOOyL/孔，室温孵育0.5h，PBST拍洗三次后，加入ABTS显色液，lOOyL/孔，室温避 光反应10~20 min，加入2Μ H2S〇4，50yL/孔终止反应，酶标仪读取0D450。结果如图8所示，免 疫布鲁氏菌rMEP疫苗和疫苗株Μ5-90后，小鼠脾细胞培养上清液中产生的IFN- γ和IL-6水 平明显升高，且免疫布鲁氏菌rMEP疫苗小鼠脾细胞培养上清液中产生的IFN- γ和IL-6水 平明显高于阴性对照组和疫苗株Μ5-90组，同样说明所制备的布鲁氏菌rMEP疫苗能够引起 刺激机体产生强烈的体液免疫应答。
[0027] (5)CTL杀伤实验 取上述步骤(3)小鼠脾淋巴细胞单细胞悬液，调整细胞浓度为3 X106个/mL加入到96孔 细胞培养板中，37°C，5%C02培养2h，贴壁细胞即为巨噬细胞，洗去未贴壁的细胞，加入10yg/ mL的融合蛋白，培养过夜，按照脾细胞:巨噬细胞=25:1加入脾细胞，同时设置仅有脾细胞和 仅有效应细胞的对照组，37°C，5%C0 2培养24h，每孔加入20yL MTT，37°C，5%C02培养4h，弃去 上清培养液，每孔加入150yL DMS0,酶标仪读取0D492。结果如图9所示，说明免疫布鲁氏菌 rMEP疫苗和疫苗株M5-90的小鼠的CTL活性均显著高于阴性对照组，说明所制备的布鲁氏菌 rMEP疫苗能够较好的诱导脾细胞的CTL活性。
[0028] (6)T细胞亚型测定 取上述步骤(3)小鼠脾淋巴细胞单细胞悬液，调整细胞浓度为IX 107个/mL，分别取100 yL加入到EP管中，1000r/min离心5min，弃上清，用含2%胎牛血清的PBS重悬细胞，加入FITC 标记的抗鼠⑶4抗体、PE标记的抗鼠⑶8抗体、APC-Cy 7标记的抗鼠⑶3抗体，避光，冰浴反应 15~20min，1000r/min离心5min，用含2%胎牛血清的roS洗涤细胞两次，用350yL的含2%胎牛 血清的PBS重悬细胞，采用流式细胞仪进行检测。结果如图10所示，说明免疫布鲁氏菌rMEP 疫苗小鼠的CD 3、CD4和CD8细胞比例均高于免疫布鲁氏菌疫苗株M5 -9 0的小鼠和阴性对照 组，说明所制备的布鲁氏菌rMEP疫苗比布鲁氏菌疫苗株M5-90具有更好的免疫保护作用。
[0029] (7)小鼠攻毒实验 最后一次免疫结束后30天进行小鼠攻毒实验，每只小鼠腹腔注射5 X 105CFU 16M，攻毒结束后2周，处死小鼠，无菌取脾，用含有0.1% Triton X-100的roS研 磨脾脏，研磨液进行倍比稀释后涂于TSA平板，37°C培养进行菌落计数。结果如表2所示，与 PBS相比，鲁氏菌rMEP疫苗具有明显的保护性，其免疫保护力高于我国现在常用的布鲁氏菌 疫苗株M5-90。实验结果显示布鲁氏菌rMEP疫苗对布鲁氏菌感染具有免疫保护性。
免疫保护力a: PBS免疫组脾细胞中l〇g1QCFU的平均值减去实验免疫组脾细胞中 logioCFU的平均值。
【主权项】
1. 一种布鲁氏菌病特异性融合蛋白抗原，它的氨基酸序如序列表SQ ID No. 1所示。2. -种布鲁氏菌病特异性融合蛋白抗原基因，它的碱基序如序列表SQ ID No.2所示。3. -种原核表达载体，它是在含有T7启动子的原核融合蛋白表达载体中插入了如序 列表SQ ID No.2所不的基因。4. 根据权利要求3所述的一种原核表达载体，其特征在于:所述的原核表达载体为pET-28b 〇5. -种大肠杆菌工程菌，它是转染了上述原核表达载体的大肠杆菌BL21 (DE3)。6. -种布鲁氏菌病的检测试剂盒，其特征在于它的诊断抗原为权利要求1所述的特异 性融合蛋白抗原，检测试剂盒为人布鲁氏菌病抗体ELISA试剂盒。
【文档编号】C07K19/00GK105906717SQ201610277587
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年4月29日
【发明人】徐坤, 李娟 , 李丽, 殷德辉, 宋秀玲, 王娟, 刘玉申, 宋丹丹, 曲笑锋, 鞠文, 赵超, 庞博, 孟祥君, 张惠雯, 翟玥, 暴昊
【申请人】吉林大学