专利名称：一种流产布鲁氏菌重组菌及其在制备疫苗中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种流产布鲁氏菌重组菌及其在制备疫苗中的应用。
技术背景布鲁氏菌病是一种人畜共患的传染病，也是大动物传染病中仅次于口蹄疫，具 有重要的政治、经济影响力的疾病，在世界各国的流行形势十分严峻。长期以来全 球防控布鲁氏菌病的策略主要是检疫-扑杀(发达国家)或免疫接种(发展中国家)， 前者通过检疫扑杀患病牛、羊、猪等动物为措施，耗资巨大、操作困难；后者通过 免疫接种并辅助扑杀措施，虽可阻止疾病在动物群中的传播，但免疫动物和临床患 病动物难以鉴别，使患病动物在自然群体中长期存在，严重威胁人类和动物群的健 康，阻碍动物布鲁氏菌病的根除和净化。根据现在国际上及我国的使用来看，粗糙型疫苗株RB51和疫苗株S19都是弱 毒活疫苗，但S19的毒力强，接种母畜易引起流产，利用血清学方法不能与野生菌 株感染区分；而RB51的毒力相对较弱，虽然能够进行血清学的鉴别诊断，但RB51 的免疫效力备受争议，在我国也没有使用。所以安全标记疫苗菌株是现在世界各国 对于布鲁氏菌病防控的技术瓶颈。 发明内容本发明的目的提供一种流产布鲁氏菌重组菌及其在制备疫苗中的应用。本发明提供的重组菌株，是将是将流产布鲁氏菌(5rwce^a Wor^s)菌株S19 中的荚膜多糖合成蛋白基因和羧基尿苷磷酸脱羧酶基因灭活得到的菌株。所述流产布鲁氏菌菌株S19为现有流产布鲁氏菌疫苗株。所述荚膜多糖合成蛋白可为任何来源于流产布鲁氏菌r&7/"7h s力or^a^的 荚膜多糖合成蛋白，具体可为序列表的序列l所示的荚膜多糖合成蛋白。所述荚膜 多糖合成蛋白的编码序列具体可为序列表的序列2所示的核苷酸序列。所述羧基尿苷磷酸脱羧酶可为任何来源于流产布鲁氏菌^"27/ceWa Wo/^m9 的羧基尿苷磷酸脱羧酶，具体可为序列表的序列3所示的羧基尿苷磷酸脱羧酶。所 述羧基尿苷磷酸脱羧酶的编码序列具体可为序列表的序列4所示的核苷酸序列。可通过任何现有方法灭活所述荚膜多糖合成蛋白基因和羧基尿苷磷酸脱羧酶4列缺失、外源或内源序列插入、同源重组、RNA干扰等。灭活荚膜多糖合成蛋白基因的同源重组可通过将DNA片段DA15导入流产布鲁 氏菌菌株S19实现；所述DNA片段DA15自上游至下游依次为同源臂DA15-1和同源 臂DA15-2;所述同源臂DA15-1和同源臂DA15-2能与所述菌株基因组中的荚膜多糖 合成蛋白编码序列的上游和下游相同序列发生同源重组，灭活所述荚膜多糖合成蛋 白基因。所述同源臂DA15-1和同源臂M15-2的长度均为400-600bp。 所述同源臂DA15-1具体可为以流产布鲁氏菌菌株S19的基因组DNA为模板， 用如下引物进行PCR扩增得到的DNA片段pWU0397 (上游引物)5 ， -GGAATTCTCMTGTAACCAACTTCA-3 ，(序列表的序列5); pWU0398 (下游引物)5' -AAGCTTAGAGGTCATACCTTCCTG-3 ，(序列表的序列6 )。 所述同源臂DA15-2具体可为以流产布鲁氏菌菌株S19的基因组DNA为模板， 用如下引物进行PCR扩增得到的DNA片段pWU0399 (上游引物)5， -CCTCTMGCTTATCTGTTTGCTGATGCG-3，(序列表的序列7); pWU0400 (下游引物)5' -CGGGATCCGCGTTTCGGATAAGATG-3 ，(序列表的序列8 )。 灭活羧基尿苷磷酸脱羧酶基因的同源重组可通过将DNA片段DAT导入流产布鲁 氏菌菌株S19实现；所述DNA片段DAT自上游至下游依次为同源臂DAT-1和同源臂 DAT-2;所述同源臂DAT-1和同源臂DAT-2能与所述菌株基因组中羧基尿苷磷酸脱 羧酶编码序列的上游和下游相同序列发生同源重组，灭活所述羧基尿苷磷酸脱羧酶 基因。所述同源臂DAT-1和同源臂DAT-2的长度均为400-600bp。所述同源臂DAT-1具体可为以流产布鲁氏菌菌株S19的基因组DNA为模板，用如下引物进行PCR扩增得到的DNA片段pWU0659 (上游引物)5， -GGMTTCMGTCTTCTCACCCACATCC-3，(序列表的序列9); pWU0660 (下游引物)5， -MGCTTCGTCATCGTGCMTTCTG-3，(序列表的序列10)。 所述同源臂DAT-2具体可为以流产布鲁氏菌菌株S19的基因组DNA为模板，用如下引物进行PCR扩增得到的DNA片段pWU0661 (上游引物)5， -TGACGMGCTTCGCTCGATTGGMGMGT-3'(序列表的序列11);pWU0662 (下游引物)5' -CGGGATTCCCGTTCGCCTGTMGGA-3，(序列表的序列12)。实验证明，该重组菌的毒力低于出发的母本菌株，免疫保护效力与现有疫苗株 相当，并且具有临床检疫、诊断用免疫标记。因此，该重组菌可用于制备布鲁氏菌 疫苗。所述重组菌株可应用于制备流产布鲁氏菌病疫苗。本发明还保护一种流产布鲁氏菌病疫苗，它的活性成为所述的重组菌株。 本发明发现，灭活荚膜多糖合成蛋白基因和羧基尿苷磷酸脱羧酶基因的粗糙型流产布鲁氏菌疫苗稳定突变株与原始母本菌株-国际标准疫苗株S19相比，因脂多 糖合成障碍，其毒力相对降低，但免疫保护作用与原始菌株相似；最为重要的是该 菌株为粗糙型，在实际检疫实践中可以通过血清学技术简易地区别疫苗免疫动物和 临床野毒菌株感染动物。本发明可应用于布鲁氏菌病疫苗的改造、诊断鉴别试剂的 研制，应用于开发布鲁氏菌病疫苗和配套的鉴别诊断试剂，对促进全球动物布鲁氏 菌病的根除和净化具有十分重要的意义。
图1为DA15-1和DA15-2的PCR扩增电泳图。 图2为DA15的PCR扩增电泳图。图3为pEX18AP-DA15转化大肠杆菌DH5 a后经PCR扩增的鉴定图。 图4为pEX18AP-DA15的BamHI和EcoRI双酶切鉴定图。 图5为重组载体pEX18AP-DA15的构建流程图。 图6为DAT-1和DAT-2的PCR扩增电泳图。 图7为DAT的PCR扩增电泳图。图8为pEX18AP-DAT转化大肠杆菌DH5 a后经PCR扩增的鉴定图。 图9为pEX18AP-DAT的BamHI和EcoRI双酶切鉴定图。 图10为重组载体pEX18AP-DAT的构建流程图。 图11为重组菌RB15的PCR鉴定图。 图12为重组菌RB15T的PCR鉴定图。图13为重组菌RB15T接种后小鼠脾脏载菌量随时间变化曲线。 图14为重组菌RB15T接种小鼠的初步免疫保护试验结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实 验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊 说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中所用的菌株和质粒如下流产布鲁氏菌(5n/ce7Zg aZwrfys)菌株2308 (标准菌株)、流产布鲁氏菌 (i race7h aybar&s)菌株S19 (疫苗菌株)均购自中国兽药监察所菌种室；流产 布鲁氏菌(5r"ce77a a力or^As)菌株RB51 (粗糙型疫苗菌株)来自美国产商业牛布 鲁氏菌粗糙型疫苗的分离菌株；pEX18AP质粒(构建方法参见文献TungT. Hoang， Gene 1998,212:77-86)。实施例1、重组菌株的构建根据流产布鲁氏菌基因组中的荚膜多糖合成蛋白基因(GenBank Accession Number: BAbS 19—104980)，设计两对引物， 一对引物用于扩增同源臂DA15-1，另 一对引物用于扩增DA15-2。同源臂DA15-1和同源臂DA15-2连接后形成序列DA15， 将序列DA15插入pEX18AP质粒，得到重组载体pEX18AP-DA15。根据流产布鲁氏菌 基因组中的羧基尿苷磷酸脱羧酶基因(GenBank Accession Number: BAbS 19_119940) 设计两对引物， 一对引物用于扩增同源臂DAT-1，另一对引物用于扩增DAT-2。同 源臂DAT-1和同源臂DAT-2连接后形成序列DAT,将序列DAT插入pEX18AP质粒， 得到重组载体pEX18AP-DAT。重组载体pEX18AP-DA15和pEX18AP-DAT与流产布鲁氏 菌菌株S19发生同源重组即可得到灭活荚膜多糖合成蛋白基因和羧基尿苷磷酸脱羧 酶基因的重组菌株。一、重组载体pEX18AP-DA15的构建构建过程示意图见图5。1、布鲁氏菌基因组的提取取15iU灭活的流产布鲁氏菌菌株S19，加入lml TNE (每升含有l. 21g Tris，5. 84g NaCl，O. 37g EDTA)混匀，10000r/min离心，留沉淀弃上清。之后加入 135u 1 TNE重悬洗涤后的沉淀。再向其中加入135u 1含2% Triton X-IOO的TNE，混 匀。加30ul新鲜配制的溶菌酶(5mg/ml)，轻弹试管混匀。37。C水浴孵育30min， 之后加入15ul蛋白酶K (20mg/ml)，涡旋混匀。65。C水浴至少孵育2h。加入RNAse (使RNAse浓度达到10ug/ml)，琼脂糖凝胶电泳鉴定后将提取的7基因组DNA于4'C保存备用。2、 PCR扩增荚膜多糖合成蛋白基因的上游片段DA15-1 (579bp)和下游片段 DA15-2 (505bp)扩增上游片段的引物如下pWU0397 (上游引物)5， -GGAATTCTCAATGTMCCAACTTCA-3，； pWU0398 (下游引物)5， -AAGCTTAGAGGTCATACCTTCCTG-3，。 上游引物中加入EcoRI酶切位点，下游引物中加入HindIII酶切位点。 扩增下游片段的引物如下pWU0399 (上游引物)5， -CCTCTAAGCTTATCTGTTTGCTGATGCG-3，； pWU0400 (下游引物)5, -CGGGATCCGCGTTTCGGATMGATG-3，。 上游引物中加入HindIII酶切位点，下游引物中加入BamHI酶切位点。 以步骤1得到的基因组DNA为模板，使用上述两个引物对进行降落PCR，参数是94。C预变性3 min; 94'C变性45 s ，退火温度从65'C至50'C每降1'C运行2个循环，每个循环72'C延伸lmin;最后72'C终延伸10 min。扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，见图l。图1中，1: DA15-1的PCR扩增产物；2: DA15-2的PCR扩增产物；3: DNA分子量标准。结果表明，成功扩增出了目的片段。3、 DA15片段的获得通过PCR扩增将上游片段DA15-1和下游片段DA15-2连接，得到片段即为DA15 片段。PCR扩增所用的引物如下pWU0397 (上游引物)5， -GGAATTCTCAATGTMCCAACTTCA-3，； pWU0400 (下游引物)5， -CGGGATCCGCGTTTCGGATMGATG-3，。 PCR扩增体系DA15-l片段1 ulDA15-2片段1 uldNTP (2. 5 mM)1 ulTaq酶2 ul10XTaq buffer5 ulpWUM397 (20pmol/u 1)1 ulpW丽OO (20pmol/u 1)1 ul双蒸水补足至50 ul38 ul扩增产物进行电泳检测，见图2。图2中，1: PCR产物；2: DNA分子量标准。 结果表明，成功获得了将DA15-1和DA15-2连接的DAT片段。 4、 pEX18AP-DA15质粒的构建提取含有AMP抗性、SacB基因和lac-Z基因以及含有多克隆位点的pEX18AP质粒。将经BaraHI和EcoRI双酶切后的pEX18AP质粒与相同双酶切的步骤3的DA15片段进行连接。将得到的重组质粒命名为pEX18AP-DA15。用pEX18AP-DA15转化到大肠杆菌DH5 a ，然后进行蓝白斑筛选。挑取阳性菌株的单菌落进行摇菌培养，先进行PCR鉴定，鉴定引物如下pWU0397 (上游引物)5， -GGAATTCTCAATGTAACCAACTTCA-3，； pWU0400 (下游引物)5， -CGGGATCCGCGTTTCGGATMGATG-3，。 结果见图3。图3中，1: DNA分子量标准；2: pEX18AP-DA15转化阳性菌株的PCR产物。然后提取质粒并进行BamHI和EcoRI双酶切鉴定。酶切鉴定的结果见图4。图 4中，1: DNA分子量标准；2:阳性菌株中重组质粒的双酶切产物。 将得到的含有重组质粒的菌株增殖，保存在-8(TC备用。 二、重组载体pEX18AP-DAT的构建 构建过程示意图见图10。 1、布鲁氏菌基因组的提取取15y 1灭活的流产布鲁氏菌菌株S19，加入lml TNE (每升含有1.21g Tris，5.84g NaCl，0.37g EDTA)混匀，10000r/min离心，留沉淀弃上清。之后加入 135ul TNE重悬洗涤后的沉淀。再向其中加入135111含2% Triton X-100的TNE，混 匀。加30ul新鲜配制的溶菌酶(5mg/ml)，轻弹试管混匀。37r水浴孵育30min，之后加入15ul蛋白酶K (20mg/ml)，涡旋混匀。65'C水浴至少孵育2h。加入RNAse (使RNAse浓度达到10ug/ml)，琼脂糖凝胶电泳鉴定后将提取的 基因组DNA于4'C保存备用。2、 PCR扩增羧基尿苷磷酸脱羧酶基因的上游片段DAT-1 (403bp)和下游片段 DAT-2 (鄉bp)扩增上游片段的引物如下pWU0659 (上游引物)5， -GGAATTCAAGTCTTCTCACCCACATCC-3，； pWU0660 (下游引物)5， -AAGCTTCGTCATCGTGCMTTCTG-3，。 上游引物中加入EcoRI酶切位点，下游引物中加入HindIII酶切位点。 扩增下游片段的引物如下pWU0661 (上游引物)5' -TGACGAAGCTTCGCTCGATTGGAAGAAGT-3，； pWU0662 (下游引物)5， -CGGGATTCCCGTTCGCCTGTMGGA-3'。 上游引物中加入Hindin酶切位点，下游引物中加入BamHI酶切位点。 以步骤1得到的基因组DNA为模板，使用上述两个引物对进行降落PCR，参数是94。C预变性3 min; 94。C变性45 s ，退火温度从65。C至5CTC每降1。C运行2个循环，每个循环72-C延伸lmin;最后72'C终延伸10 min。扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，见图6。图1中，1: DNA分子量标准；2: DAT-1的PCR扩增产物；3: DAT-2的PCR扩增产物。结果表明，成功扩增出了目的片段。3、 DAT片段的获得通过PCR扩增将上游片段DAT-1和下游片段DAT-2连接，得到片段即为DAT片 段。PCR扩增所用的引物如下pWU0659 (上游引物)5， -GGAATTCAAGTCTTCTCACCCACATCC-3，； pWU0662 (下游引物)5， -CGGGATTCCCGTTCGCCTGTAAGGA-3，。 PCR扩增体系10DAT-1片段1 ulDAT-2片段1 uld證(2.5 mM)1 ulTaq酶2 ul10XTaq buffer5 ulP翻659 (20pmol/u 1)1 ulpW腿62 (20pmol/u 1)1 ul双蒸水补足至50 ul38 ul扩增产物进行电泳检测，见图7。图7中，1: PCR产物；2: DNA分子量标准。 结果表明，成功获得了将DAT-1和DAT-2连接的DAT片段。 4、 pEX18AP-DAT质粒的构建提取含有AMP抗性、SacB基因和lac-Z基因以及含有多克隆位点的pEX18AP质粒。将经BamHI和EcoRI双酶切后的pEX18AP质粒与相同双酶切的步骤3的DAT片段进行连接。将得到的重组质粒命名为pEX18AP-DAT。用pEX18AP-DAT转化到大肠杆菌DH5 a ，然后进行蓝白斑筛选。挑取阳性菌株的单菌落进行摇菌培养，先进行PCR鉴定，鉴定引物如下pWU0659 (上游引物)5， -GGAATTCAAGTCTTCTCACCCACATCC-3，； pWU0662 (下游引物)5， -CGGGATTCCCGTTCGCCTGTAAGGA-3，。 结果见图8。图8中，1: pEX18AP-DAT转化阳性菌株的PCR产物；2: DNA分子量标准。然后提取质粒并进行BamHI和EcoRI双酶切鉴定。酶切鉴定的结果见图9。图 9中，1:阳性菌株中重组质粒的双酶切产物；2: DNA分子量标准。 将得到的含有重组质粒的菌株增殖，保存在-8(TC备用。 三、重组菌株的获得的获得 1、重组菌株的获得RB15的获得在含有20mlTSB培养基的离心管中接种50ul流产布鲁氏菌菌株S19， 37。C培养 24小时后，离心菌体并用预冷的三蒸水悬浮并转入预冷的1. 5ml离心管中，继续 离心洗涤3-4次。然后，加入适量的冷三蒸水悬浮菌液，取87ul菌液和3ul重组 质粒pEX18AP-DA15加入lmm的电极杯，将电极杯放入BI0RAD电穿孔仪中，调整仪 器至Agr程序后，按Pulse钮进行电击。查询电击参数为2.22KV。电击后，向电极杯中加入lml S0C培养液，转入1.5ml离心管，室温下静置10rain,置于37'C摇 床复苏12-18h。将转化复苏后的菌液涂布于TSB (含100ug/ul的氨节青霉素)。 5-8天后长出单个菌落。挑取单菌落至TSB液体培养基(无抗生素)37C增殖48h， 再将该菌液稀释10-100倍后，取100ul涂布于含有5y。蔗糖的TSA平板培养基。经 过3-5天后长出单菌落，将阳性菌落进行PCR鉴定。 PCR鉴定的引物如下pWU0397 (上游引物)5， -GGAATTCTCMTGTAACCAACTTCA-3，； pWU0400 (下游引物)5， -CGGGATCCGCGTTTCGGATAAGATG-3，。 重组菌株RB15的PCR鉴定结果见图11。图11中，1: DNA分子量标准；2:重组菌株RB15; 3:流产布鲁氏菌菌株S19。结果表明，通过双交换获得了灭活荚膜多糖合成蛋白的流产布鲁氏菌菌株，将其命名为重组菌株RB15。2、重组菌株RB15T的获得按照步骤l的程序，以获得的重组菌株RB15为母本，通过电转化技术将重组 质粒pEX18AP-DAT导入，筛选阳性菌落进行PCR鉴定。 PCR鉴定的引物如下pWU0659 (上游引物)5， -GGAATTCAAGTCTTCTCACCCACATCC-3，； pWU0662 (下游引物)5， -CGGGATTCCCGTTCGCCTGTAAGGA-3，。 重组菌株RB15T的PCR鉴定结果见图12。图12中，1: DNA分子量标准；2:流产布鲁氏菌菌株S19; 3:重组菌株RB15T。结果表明，获得了通过双交换灭活荚膜多糖合成蛋白基因和羧基尿苷磷酸脱羧酶基因的流产布鲁氏菌菌株，将其命名为重组菌株RB15T。实施例2、重组菌株RB15T的应用试验动物4-6周龄SPF级Balb/C雌鼠，购自北京维通利华实验动物技术有 限公司，许可证编号为SCXK(京)2007-0001。 一、毒力鉴定将小鼠随机分为四组，每组30只。具体接种方案如下 第一组(试验组)接种实施例1制备的重组菌株RB15T，每只小鼠腹腔接种 剂量O. lml，内含107细菌。第二组(对照组l):接种流产布鲁氏菌菌株2308，每只小鼠腹腔接种剂量 0. lml，内含107细菌。
第三组(对照组2):接种流产布鲁氏菌菌株S19，每只小鼠腹腔接种剂量0. lml， 内含107细菌。
第四组(对照组3):接种流产布鲁氏菌粗糙型疫苗菌株RB51，每只小鼠腹腔 接种剂量O. lml，内含107细菌。
分别于接种后第l、 3、 4、 6和10周从每组小鼠中选5只，进行脾脏载菌量和 血清学检测评价。
脾脏载菌量随时间的变化见图13。图13中，WT表示接种菌株2308的实验结 果，S19表示接种菌株S19的实验结果，RB15T表示接种重组菌株RB15T的实验结 果，RB51表示接种菌株RB51的实验结果。结果表明重组菌株RB15T接种后，小 鼠的脾脏载菌量随时间延长逐渐降低，在体内的清除速度远远快于S19和RB51，证 明该菌株在小鼠体内的持续时间可能较疫苗菌株S19要短许多。
血清学检测结果表明，接种流产布鲁氏菌标准菌株和流产布鲁氏菌疫苗菌株 S19的小鼠血清通过布鲁氏菌虎红平板凝集试验抗原(中国兽医药品监察所制造， 批号200801)检测时，均能够在2分钟内出现明显的凝集反应，通过试管凝集试验 抗原(中国兽医药品监察所制造，批号200603)检测到的抗体效价达到l: 100以 上，而重组菌株RB15T的小鼠血清的检测结果为阴性，而接种重组菌株RB6和RB51 小鼠血清的检测结果为阴性。
二、疫苗效力评价
将上述健康小鼠随机分为四组，每组15只。四组小鼠分别注射重组菌株RB15T、 流产布鲁氏菌疫苗菌株S19、流产布鲁氏菌菌株RB51和PBS，具体如下
第一组(试验组)接种实施例1制备的重组菌株RB15T，每只小鼠腹腔接种 剂量O. lml，内含107细菌。
第二组(疫苗对照组)接种流产布鲁氏菌菌株S19，每只小鼠腹腔接种剂量 0. lml，内含107细菌。
第三组(粗糙型菌株对照组)接种流产布鲁氏菌粗糙型疫苗菌株RB51，每只 小鼠腹腔接种剂量O. lral，内含107细菌。
第四组(空白对照组)接种0.01M pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)，每只小鼠 腹腔接种剂量0. lml。上述菌株接种后，将每组小鼠分成三个小组(每个小组5只)，分别于接种后第 12周、16周和20周用流产布鲁氏菌菌株2308 (5race77a a6orz^s)攻毒，剂量为 106CFU/ml。两周后采血并剖杀各组小鼠，取脾脏称重量并计算脾脏载菌量变化，评 价免疫效力。试验设置三次重复，结果取平均值。
脾脏的平均载菌量变化结果如图14所示。图14中，PBS表示空白对照组的实 验结果，S19表示疫苗对照组的实验结果，RB15T表示试验组的实验结果，RB51表 示粗糙型菌株对照组的实验结果。小鼠体内攻毒结果表明，该重组菌株RB15T的免 疫保护效力优于菌株RB51，与母本疫苗菌株S19类似，且该重组菌株RB15T具有免 疫诊断标记，接种动物与临床感染动物能够通过血清学反应进行鉴别。序列表
〈110〉 中国农业大学 〈120〉 一种流产布鲁氏菌重组菌及其在制备疫苗中的应用
<130> CGGNARY92323
〈160〉 12
〈210〉 1 〈211> 622 〈212〉 PRT
〈213〉 流产布鲁氏菌("潔e仏a力orto) <400〉 1
Met Ser Leu Lys Tyr Pro Trp Gin Arg Leu Ala Leu Leu Pro Arg lie
15 10 15
Ser Lys Gin lie lie Leu Val Leu Ser Asp Cys Leu Leu Leu Leu Ala
20 25 30
Ser Ala Tyr Leu Ala Phe Val Val Arg Phe Gly Phe Val Phe Val Pro
35 40 45
Asn Leu Ala Gin Leu Phe Leu lie Leu lie Ala Pro Leu Leu Ala lie
50 55 60
Pro Val Phe lie Arg Phe Gly Leu Tyr Arg Ala lie lie Arg Tyr Leu 65 70 75 80
Ala Glu Arg Ala lie Trp Ser lie Phe Gin Ala Thr Ala Val Ala Ala
85 90 95
Leu Phe Trp Val Ala Leu Val Phe Leu Met Glu Leu Tyr Gly Ser Thr 100 105 110Gly Leu Pro Arg Ser Val Pro Leu Leu
115 120 Phe lie Ser Ala Ser Arg Phe Gly
Glu 145 Glu
Glu
Gin 225 Asn
lie 130 His
Pro
Ala
Tyr Lys
Asp Ala
Lys Arg
Leu Val Val
lie lie Gly 195 Tyr
Arg
Gin 165 Phe
Gly 180
Leu Arg Val
Asn 210 Lys
Gly lie Lys Arg
Thr Arg lie
Glu Arg Gin
Leu Val Ser Ala 260 Pro
Leu 245 Leu
Pro
Ser Pro Val 275
lie Met lie Thr
Arg
Arg 290
Leu Thr lie Ala
Cys 305
Ser Ser Glu Phe
Ala Ser Cys Thr 340
Phe 135
Thr Ser Ser Ala
Trp Trp
Tyr 150
Leu Ala Thr Ala
Leu
Leu 140 lie
Leu Ser Thr Val 125 Leu
lie
Leu 155
Arg Ser His Ser
Arg Thr Ala Gly
lie Asp Pro
Asp Tyr
Leu 170
Gly Gin Leu Ala
Ala 185
Thr Glu Glu lie
lie
Asp 175 Met
Gly 160 Thr
Asp
Arg 200
Val Val Val Ser
Gly 190
Ser Leu lie
Gin 215
Phe Ala Arg Leu
Glu 230
Pro Pro lie Ala
Arg Asn Val Asp
Thr
Thr 280 Ala
Glu 265 Leu
Gly
Gly 295
Trp Asn Pro
Gin 310
Leu Tyr Gin lie
Asp 250 lie
Leu
Gly
Ala
Leu 235 Leu
Asp
Arg
Ser
Glu 220 Gly
Pro 205
Pro Ala Leu Glu
Arg Leu Pro Ala
Thr Ala Gly
Asp Glu
Leu
Leu 270 Val
Lys 255 Gly
Glu
Val 240 Tyr
Arg
Gly
Val 285
Gly Ser Gin Leu
lie 300
lie Val Leu Phe
Ala 325
Val Val Pro Val
Ala 315
Arg Gin Leu Arg
Leu 345
Asp 330
Gly Ser Val Arg
Asp 350
Gin 335 Arg
Glu 320 Phe
AlaCys
Cys
Gly 385 Leu
Val Glu Lys 355
Ala Tyr Phe Asn Asn Thr Asp
Ala 370 lie
Pro lie Arg Asp His Ser lie Asp Thr Val Tyr His 360 365
Pro Leu Val Glu Arg Asn Pro Leu Val 380
Gly Thr Leu Glu Val Ala Glu Ala Ala
395 400
lie Ser Ser Asp Lys Ala
Lys His Val 375 Phe
Asn
Val 390
Glu Arg Met Val
Val Arg Pro Thr 420 Tyr
Val Glu Arg Met Val Leu 405 410 Asn Val Met Gly Ala Thr
Val lie Tyr 435 Tyr
Ala
Ser
Tyr Val
Phe 450
Val Pro Leu Phe
Val 465
Leu Thr His Glu
Gly
Arg
Arg 470 Met
Asp 485
Val Gin Ser
Ala Thr Lys Arg Trp Ala 425 430
Arg Leu Ala Glu Gin Ala Gly Lys
440 445
Phe Gly Asn Val Leu Gly Ser Asn
455 460
Glu Gin lie Ala Asn Gly Gly Pro 475
Met Ser lie Lys
Thr Arg Tyr
Ala Glu Leu lie 500
Glu Met Gly Glu
Arg Gly
Val Leu Leu 515
lie Leu Leu Ala
Ala 505 Val
Phe 490 lie
Lys 415 Glu
Lys
Gly
Val
Glu 495 Asp
Leu
Lys
Ser
Thr 480 Ala
Thr
Asn
Gin 545 Met
Met 530 Gly
Asp Glu
His Pro Lys
Tyr Glu Glu
lie 580
lie Ala lie 550
Phe Tyr Asp Pro
Leu 565
Met Arg Ala Pro
Ala Gin Ser Gly 510
Pro Val Lys lie Arg Asp Leu Ala Glu 520 525 Gly Leu Thr Val Arg Asn Glu Glu Asn Pro 535 540 Glu Val Thr Gly lie Arg Glu Gly Glu 555
Leu Ala Gin Arg
Gin 585
Ser 570 Gly
Ser Lys Ala Val 590
Thr 575 Val
Lys 560 Arg
Asplie Gin Glu
Ser
Leu Ala Val Leu Arg Thr Ala
Met Glu Lys Glu Asp
595
600
605
lie Glu Met
Val
Arg Lys Val Leu Phe Glu Val
lie Ala Ser
610
615
620
<210> 2
<211> 1869
<212〉 DNA
〈213> 流产布鲁氏菌(5n/ce7Za Wor^s)
<400> 2
atgagtttaaaatatccttggcaaagattggcgcttctgccgcgcatcagcaaacagatc60
attctggtgttgagcgattgcctgttgctgcttgcaagcgcctatctagcttttgtcgtc120
cgtttcggtttcgtcttcgtacccaatctggcgcagcttttcctgatcctgattgcgccg180
cttctggccattccggtcttcatccgttttgggctttaccgcgccatcattcgttatctg240
gccgagcgcgccatctggtcgatcttccaggccaccgcagtcgccgccttgttctgggtg300
gcgctggtgttcctgatggagctttacggcagcaccggcctgccgcgttctgttccgctt360
ctttattggctcctgagtacggttttcatttccgcaagccgcttcggcgcaaaatggctg420
ctacgcactgccgaac3cg3caagcggtataccagttcagccctgataatcggcattggc480
g認cggcgcgtcagcttgcgacggcccttcgcagccatagcgatacgttggtggtgggt540
tttatcgatcctgccgggcaactggccggaatggacattattggcctgcgtgtctatcgc600
8cggaagaaattccaagcctgatcgaaaattacggtatca3gC3ggttgtcgtttcagaa660
cccgcgctggagcsg肌ggagcgccaggagtttgcgcgccttttggggcgcctgccggtc720
aatacgcgceittcttccgcccattgctgatctcacggccgggaaatatctcgtteigtgcg780
ctgcgcaatgtcgagatcgatgatcttttggggcgttcgccggttccgcctgatacaacg840
cttctgcgtgaggtcgtggaggggcggcgcatcatgataaccggcgcgggcggttccatc900
ggcagccagctttgcctcacgattgcgcaatggaacccggctgcgattgttctctttgaa960
tcgagtgagtttgcattataccagatcgacaggcagcttcgccagtttgcctcttgcacg1020
gtggtgccggtccttggctccgtgcgtgaccgcgcctgcgtggaaaaaccgatccgcgat1080
cattccatcgatacggtttatcactgtgcggcttacaeigcatgtgccgctggtggagagg1140
18aacccgctggtcggcattttca3caatgtattcggcacgc tggaggtggc cgaggcagcg1200
ttgaacacgg3tgtggaacgcatggtgctgatctcttccg acaaggccgt gcgccccacc1260
aatgtcatgggcgcgaccaagcggtgggcggaactggtta tctattatta cggacggctg1320
gctgagcaggccggcaagaaaaaagctttctattccgtcc gttttggcaa tgtgcttggc1380
tccaacggttcggtagtgccgcttttccgcgagcagattg caaatggcgg ccccgttacg1440
ctgacgcatgaagacatgax:gcgctatttcatgtccatca aggaggcggc ggaactgatc1500
gtgcagtccggcgcgattgcccaatccggtgataccgttc ttttggaaat gggtgagccg1560
gtgaaaatccgcgatctggccgaaaacatgatcctgctcg cgggactcac cgtgcgcaac1620
gaggaaaaccCgC3gggCg3tatcgccattgaggtgacgg gtattcgcg3 aggcgagaag1680
atgtatgaagagcttttctacgatccttcgctcgcccagc gcacccgtca tccgaaaatc1740
atgcgtgcgccccagggcagcaaggccgtggtagatattc aggaaagcct ggcggtactg1800
cggaccgccatggaaaaggaggatatcgaaatggtccgca aggtgctttt cgaggtcata1860
gcttcctga1869
〈210> 3
〈211〉 238
〈212〉 PRT
〈213〉流产布鲁氏菌
〈400〉 3
Met Thr Thr Glu Leu 1 5 Leu Asp Val Pro Thr 20
Gly Asn Ala Val Ser 35
Gly Gly Leu Asp Phe 50
Phe Leu Asp Met Lys 65
19
(Brucella abortus)
His Asp Asp Ala Ser Gly Arg Leu lie Val Gly
10 15 lie Ala Glu Ala Glu Lys Val Val Glu Glu Leu
25 30 Phe Tyr Lys lie Gly Tyr Gin Leu Val Phe Ala
40 45 Ala Lys Ser Leu Val Ala Ala Arg Lys Lys Val
55 60 Leu Leu Asp lie Asp Asn Thr lie Ala Lys Gly 70 75 80Val Glu Asn Val Ala Lys Met Gly Val Ser Met Leu Thr Leu His Ala
85 90 95
Tyr Pro Lys Ala Met Arg Ala Ala Val Glu Ala Ala Arg Gly Ser Asp
100 105 110
Leu Cys Leu Leu Gly Val Thr Val Leu Thr Ser Met Asp Asn Ala Asp
115 120 125
Uu Arg Glu Ala Gly Tyr Phe Asp Asn Ala Glu Thr Leu Val Leu Lys
130 135 140
Arg Ala Arg Gin Ala His Glu Ala Gly Met Gly Gly lie Val Ala Ser 145 150 155 160
Ala Val Glu Ala Gin Ala lie Arg Gin Ala Val Arg Pro Asp Met Ala
165 170 175
lie Val Thr Pro Gly lie Arg Pro Ala Gly Ser Glu Lys Gly Asp Gin
180 185 190
Lys Arg Val Met Thr Pro Ala Asp Ala Leu Arg Ala Gly Ala Ser His
195 200 205
Leu lie Val Ala Arg Pro lie Val Gly Ala Pro Asp Arg Lys Ala Ala
210 215 220
Ala Leu Ala lie Leu Lys Glu Met Arg Ser lie Gly Arg Ser 225 230 235
<210> 4 <211> 717 <212〉 DNA
〈213〉 流产布鲁氏菌(Brucella abortus) <400> 4
atgacgacag aattgcacga tgacgcatcc gggcgcctga tcgtgggcct tgacgtgccg 60 acaattgccg aggcggaaaa ggtggtcgaa gaactgggca atgctgtttc cttctacaag 120 atcggctatc agcttgtttt tgccggtggg cttgatttcg ccaaaagcct tgtggcggcg 180
20cgcaaaaaeig gtggeiaeieitg atgcgtgcgg ctgacctcca ctggtgctgei gcggtggagg ggcatccgcc gccttgaggg cgcaaggcgg
tcttcctcga tcgcgaeigat cggtgg呵c tggacaatgc aacgtgcccg cgcaggccat
CggC3ggg3g
ccggtgcgag cagcccttgc
catgaagctg ctcgatatcg acaacacgat tgccaaaggc
gggtgtttcc atgctcacgc ttcatgccta tccgaaggca
cgccagaggg tcggacctat gccttttggg cgtgacggtc
cgatcttcgg gaagccggtt atttcgacaa tgcggaaacg
tcaggcgcat gaggccggta tgggcggcat tgtcgcctcg
tcgccaggcg gttcgccccg atatggccat cgtcacaccg
cgagaagggc gaccagaagc gcgtgatgac gccagccgat
ccatctcatc gtggcgcgcc cgatcgtggg cgcaccggat
catcctgaag gaaatgcgct cgattggaag aagttag
〈210〉 5
〈211> 25
〈212> DNA <213>人工序列
〈220>
<223>
<400> 5
ggaattctca atgtaaccaa cttca
〈210〉 6
〈211〉 24
〈212〉 DNA 〈213〉人工序列
〈220>
<223>
240 300 360 420 480 540 600 660 717
25
21〈400〉 6
肪gctt3gag gtcatscctt cctg 24
〈210> 7
〈211> 28
<212> 醒 <213〉人工序列
〈220〉
〈223>
〈400> 7
cctctaagct tatctgtttg ctgatgcg 28
〈210> 8
〈211〉 25
〈212〉 薩 〈213〉人工序列
〈220>
〈223>
〈400〉 8
cgggatccgc gtttcggata agatg 25
<210> 9
〈211> 27
22<212〉 DNA 〈213>人工序列
〈220>
〈223>
<400> 9
ggaattcaag tcttctcacc cacatcc 27
〈210〉 10
<211〉 24
〈212> DNA 〈213>人工序列
〈220>
〈223〉
<400〉 10
aagcttcgtc atcgtgcaat tctg 24
〈210> 11
〈211> 29
<212> DNA 〈213〉人工序列
〈220〉
〈223〉<400〉 11
tgacgaagct tcgctcgatt ggaagaagt 29
〈210〉 12
<211〉 25
<212> 腿 〈213>人工序列
〈220〉
〈223〉
<400> 12
cgggattccc gttcgcctgt aagga 2权利要求
1、流产布鲁氏菌重组菌株，是将流产布鲁氏菌(Brucella abortus)菌株S19中的荚膜多糖合成蛋白基因和羧基尿苷磷酸脱羧酶基因灭活得到的菌株。
2、 如权利要求1所述的重组菌株，其特征在于所述荚膜多糖合成蛋白如序列 表的序列1所示；所述羧基尿苷磷酸脱羧酶如序列表的序列3所示。
3、 如权利要求2所述的重组菌株，其特征在于所述荚膜多糖合成蛋白的编码 序列如序列表的序列2所示；所述羧基尿苷磷酸脱羧酶的编码序列如序列表的序列4 所示。
4、 如权利要求1至3中任一所述的重组菌株，其特征在于所述灭活是通过同源重组实现的。
5、 如权利要求4所述的重组菌株，其特征在于所述灭活所述荚膜多糖合成蛋白基因的同源重组是将DNA片段DA15导入所述流 产布鲁氏菌菌株S19实现的;所述DNA片段DA15自上游至下游依次包括同源臂DA15-1 和同源臂DA15-2;所述同源臂DA15-1和同源臂DA15-2能与所述菌株基因组中荚膜多 糖合成蛋白编码序列的上游和下游相同序列发生同源重组，灭活所述荚膜多糖合成蛋 白基因；所述灭活所述羧基尿苷磷酸脱羧酶基因的同源重组是将DNA片段DAT导入所述流 产布鲁氏菌菌株S19实现的；所述DNA片段DAT自上游至下游依次包括同源臂DAT-1 和同源臂DAT-2;所述同源臂DAT-1和同源臂DAT-2能与所述菌株基因组中羧基尿苷 磷酸脱羧酶编码序列的上游和下游相同序列发生同源重组，灭活所述羧基尿苷磷酸脱 羧酶基因。
6、 如权利要求5所述的重组菌株，其特征在于所述同源臂DA15-1和同源臂 DA15-2的长度均为400-600bp;所述同源臂DAT-1和同源臂DAT-2的长度均为 400-600bp。
7、 如权利要求6所述的重组菌株，其特征在于所述同源臂DA15-1是以流产布 鲁氏菌菌株S19的基因组DNA为模板，用序列5和序列6组成的引物对进行PCR扩增 得到的DNA片段；所述同源臂DA15-2是以流产布鲁氏菌菌株S19的基因组DNA为模 板，用序列7和序列8组成的引物对进行PCR扩增得到的DNA片段。
8、 如权利要求6或7所述的重组菌，其特征在于所述同源臂DAT-1是以流产 布鲁氏菌菌株S19的基因组DNA为模板，用序列9和序列10组成的引物对进行PCR 扩增得到的DNA片段；所述同源臂DAT-2是以流产布鲁氏菌菌株S19的基因组DNA为模板，用序列11和序列12组成的引物对进行PCR扩增得到的DNA片段。
9、 权利要求1至8中任一所述重组菌株在制备流产布鲁氏菌病疫苗中的应用。
10、 一种流产布鲁氏菌病疫苗，其活性成为权利要求1至8中任一所述的流产布 鲁氏菌重组菌株。
全文摘要
本发明公开了一种流产布鲁氏菌重组菌及其在制备疫苗中的应用。本发明的重组菌株，是将流产布鲁氏菌菌株S19中的荚膜多糖合成蛋白基因和羧基尿苷磷酸脱羧酶基因灭活得到的菌株。本发明得到的菌株的毒力较小，无需灭活就可以作为疫苗免疫，接种动物不产生脂多糖抗体，通过血清学反应能够区别强毒菌株感染动物和重组菌株免疫动物。本发明有助于布鲁氏菌病疫苗的改造、诊断鉴别试剂的研制，有利于开发布鲁氏菌疫苗和配套的鉴别诊断试剂，对促进全球动物布鲁氏菌病的根除和净化具有十分重要的意义。
文档编号A61P31/04GK101575587SQ200910085859
公开日2009年11月11日 申请日期2009年6月3日 优先权日2009年6月3日
发明者婕 任, 刘文娟, 刘文晓, 吴清民, 张春燕, 羽 杨, 牛建蕊, 真 王 申请人:中国农业大学