专利名称：一种布鲁氏菌dna疫苗及其构建方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种DNA疫苗及其 构建方法，以及这种疫苗的应用，确切讲本发明涉及一种布鲁氏菌DNA疫苗及其构建方法，以及这种疫苗的应用。
背景技术：
布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌(Brucella spp.)引起的一种人畜共患传染病，又称为马耳他热或波状热，简称布病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为B类动物疫病，我国也将其列为二类动物疫病，直接影响畜牧业发展，严重威胁着人类健康，造成巨大经济损失(蔡宝祥，2001)。布鲁氏菌病因其独特的致病机制及胞内寄生感染后难以根治的特点，除了大规模扑杀，应用疫苗预防一直是动物布鲁氏菌病防控最有效且经济的手段(Ko et al.，2003)。虽然布鲁氏菌疫苗种类较多，也为世界布病的免疫防控发挥了重要作用，但至今还没有一种布鲁氏菌传统疫苗在国际上获得普遍或持久应用，原因是现有的各类型疫苗在保护效果、安全性和制作成本等方面均存在着不同程度相互矛盾而又难以克服的缺点。
发明内容
本发明目的在于提供一种布鲁氏菌DNA疫苗及其构建方法与应用。本发明的布鲁氏菌DNA疫苗中包含了布鲁氏菌P39和18KD基因，并可以在真核细胞中通过IRES介导共表达。本发明的布鲁氏菌DNA疫苗中有如下的SEQl基因序列
atgggcgcct gttgccaatg cgcaggaaaa gcagaatgtc gaggttctgc actggtgacg60
tccggcggcg aagcgtccgc gcttgaagtt ttgaaaaaag atcttgaaag caagggcatt120
agctggaccg atatgccggt tgcaggtggc ggcggcacgg aagccatgac cgttttgcgc180
gcgcgcgtta ccgcaggcaa tgcgccaacc gcggtgcaga tgctgggttt tgacattcgc240
gactgggcgg agcagggcgc actcggcaat ctcgatacgg ttgcttccaa ggaaggctgg300
gaaaaggtta ttccggctcc cttgcaggaa tttgccaaat atgacggcca ctggattcgt360
gcgcccgtca atattcactc caccaactgg atgtggatca acaaggctgc tctcgacaag420
gctggcggca aggagccgac caattgggat gagctgattg cgcttctcga caatttcaag480
gcgcagggca ttacgccgat cgcgcatggc ggccagccgt ggcaggatgc aaccattttc540
gatgcggttg ttctttcatt cggcccggat ttctacaaga aggccttcat cgatctcgac600
ccggaagcac tgggcagcga taccatgaag caggccttcg accgcatgtc caagcttcgc660
acctatgttg atgacaactt ctccggccgt gactggaacc ttgcttcggc catggttatc720
gaaggcaagg ccggtgtcca gttcatgggc gactgggcga agggcgagtt cctcaaggcg780
权利要求
1.一种布鲁氏菌DNA疫苗，其特征在于疫苗中包含了布鲁氏菌P39和18KD基因，并可以在真核细胞中通过IRES介导共表达。
2.根据权利要求I所述的布鲁氏菌DNA疫苗，其特征在于DNA疫苗中有SEQl基因序列。
3.根据权利要求2所述的布鲁氏菌DNA疫苗，其特征在于DNA疫苗为pcDNA_P39/18KD重组质粒。
4.权利要求3所述的布鲁氏菌DNA疫苗制备方法，其特征在于 a.以流产布鲁氏菌2型CVCC12的总DNA为模板，分别用P39S引物SEQ2、SEQ3和18KDS引物SEQ4、SEQ5进行聚合酶链式反应，分别得到P39和18KD蛋白基因，然后将PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，回收目的基因并进行纯化，再分别将P39和18KD基因克隆到pMDlS-T载体，获得分别命名为PMD-P39和pMD-18KD的阳性质粒； b.将a步骤所得的pMD-P39和pQCXIXRetroviral Vector质粒双酶切后，用琼脂糖凝胶电泳并用胶回收试剂盒进行切胶纯化，将回收后的P39目的片段用T4DNA连接酶连入PQCXIX载体的MCS I位点中，再转化JM109感受态细胞，得到命名为pQC_P39的阳性的质粒；再将PMD-18KD和pQC-P39阳性质粒，用Mlu I和Xho I内切酶分别进行进行双酶切，琼脂糖凝胶回收将18KD目的基因克隆到pQC-P39载体的MCS II位点中，转化E. coli DH5 α感受态细胞，再在Amp抗性平板中挑取单克隆，并于LB液体培养基37°C 220rpm摇床过夜增菌后，得到命名为PQC-P39/18KD的阳性质粒； c.将阳性pQC-P39/18KD和pcDNA3.I质粒，用Not I和Xho I内切酶分别进行双酶切，然后纯化回收P39-IRES-18KD目的片段和线性化pcDNA3. I-GFP载体，回收产物用T4DNA连接酶进行连接，然后再转化入E. coli DH5 α，得到pCDNA_P39/18KD重组质粒。
5.权利要求3所述的布鲁氏菌DNA疫苗制备方法中所用的P39S引物SEQ2、SEQ3。
6.权利要求3所述的布鲁氏菌DNA疫苗制备方法中所用的18KDS引物SEQ4、SEQ5。
全文摘要
本发明公开一种布鲁氏菌DNA疫苗及其构建方法及这种疫苗的应用。本发明的布鲁氏菌DNA疫苗中包含了布鲁氏菌P39和18KD基因，并可以在真核细胞中通过IRES介导共表达。本发明的布鲁氏菌DNA疫苗中有SEQ1基因序列。本发明的布鲁氏菌DNA疫苗及其构建方法是以流产布鲁氏菌2型CVCC 12的总DNA为模板，分别用P39S引物SEQ2、SEQ3和18KDS引物SEQ4、SEQ5进行聚合酶链式反应，目标基因，再将目标基因酶切后转化JM109感受态细胞，得到命名为pQC-P39/18KD的阳性质粒。再将pQC-P39/18KD和pcDNA3.1质粒酶切后用T4DNA连接酶进行连接，然后再转化E.coli DH5α，得到pcDNA-P39/18KD重组质粒。
文档编号A61P31/04GK102772793SQ201210176460
公开日2012年11月14日 申请日期2012年5月30日 优先权日2012年5月30日
发明者景志忠, 蔺国珍, 邱昌庆, 郑福英 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所