布鲁氏菌弱毒疫苗突变株及其构建方法与应用的制作方法

专利名称：布鲁氏菌弱毒疫苗突变株及其构建方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及疫苗突变株及其构建方法与应用，特别是涉及一种布鲁氏菌弱毒疫苗突变株及其构建方法与其在制备布鲁氏菌预防性疫苗中的应用。
背景技术：
布鲁氏菌病(布病)是由布鲁氏菌引起的一种流行广泛、危害极大的人畜共患病，是《中华人民共和国传染病防治法》中记载的35种传染病中的乙类传染病，并被列为《家畜家禽防疫条例实施细则》中记载的二类传染病之首。迄今为止，该病已波及到世界五大洲，在200多个国家中已有160多个国家和地区有人畜布病的存在和流行。布病是目前世界上流行最广，危害最大的人畜共患病之一，严重地影响着人民健康和畜牧业发展。人患此病，病期可长达数月、数年，甚至十几年，严重者甚至丧失劳动能力。家畜患布病后出现流产、死胎、不孕、乳腺炎和睾丸炎等，每年因家畜布病造成的经济损失高达数十亿美元。布病在我国流行范围广、危害严重，自新中国成立后开展了全面的系统防治，因而有效地控制了布病的发生和流行。然而，自上个世纪90年代以来，该病的国内外疫情呈明显上升趋势，被列为再度肆虐的传染病，引起国内外的广泛关注。为防治动物布病，我国成功地研制出布鲁氏菌羊种M5弱毒疫苗和猪种S2弱毒疫苗，并进行了大面积的推广应用，对牛、羊、猪、鹿等动物布病的防制起了巨大的作用，经济效益和社会效益十分显著。此外，对人采用从国外引进的104M减毒活菌苗免疫疫区内职业人群及受威胁的高危人群，也有效地控制了布鲁氏菌的感染。但是，在布氏菌疫苗用于防治布病的过程中，还存在着自然感染和疫苗免疫难以鉴别的问题，因为人畜应用活菌苗以后所产生的各种血清反应和自然感染所产生的各种血清学反应极其相似。鉴别诊断不仅关系着布病的防治工作，同时对流行病学调查也具有重要意义，这也是布病防治领域的难题之一。
布鲁氏菌弱毒活疫苗防治人、畜间布病的主要问题是接种后产生的抗体与自然感染产生的抗体无法鉴别，这给布病的诊断带来困难。目前，广泛应用的布鲁氏菌弱毒活疫苗包括国际通用的S19、Rev-1和104M，以及我国研制的布鲁氏菌羊种M5弱毒疫苗和猪种S2弱毒疫苗都存在这个问题(WHO.The Development of New/ImprovedBrucellosis VaccinesReport of WHO Meeting，1997.)。近来，美国从强毒株2308中筛选出一种减毒的粗糙型牛种布鲁氏菌突变株活疫苗RB51，此突变株由于缺乏O-抗原不产生相应的抗体，因此不干扰常规血清学诊断，在美国已获得政府批准正式使用(WHO.The Development of New/Improved Brucellosis VaccinesReport of WHOMeeting，1997.)。但是，最近的文献报道，RB51也产生低水平的O-抗原，意味着用RB51做疫苗仍有干扰常规血清学和ELISA诊断的可能性(Cloeckaert A，Zygmunt M S，Guilloteau L A.Brucella abortus vaccine strain RB51 produces low levels ofM-like O-antigen.Vaccine.2002，201820-1822.)。
bp26(GenBank号AF242532)、wboA(与O-抗原聚合作用有关)(GenBank号AF107768)、omp31(GenBank号U39453，该基因的功能为形成细胞外膜孔道的蛋白)、P39(GenBank号AF360361，该基因的功能为参与结合蛋白依赖的转运系统)和pgm(GenBank号AF232056，磷酸葡萄糖变位酶，Phosphoglucomutase，与O-抗原组装有关)是来源于病原体的基因，这些基因是细菌复制非必需的，同时它们又编码免疫显性抗原。

发明内容
本发明的目的是提供免疫保护作用良好，并且能够与非突变株感染进行鉴别的布鲁氏菌弱毒疫苗突变株。
为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案布鲁氏菌弱毒疫苗突变株，是将布鲁氏菌弱毒疫苗株中编码免疫显性抗原蛋白bp26、wboA、omp31、P39或pgm的基因敲除，得到布鲁氏菌弱毒疫苗突变株。
所述布鲁氏菌弱毒疫苗株可为布鲁氏菌羊种M5株、人用104M株或猪种S2株(上述布鲁氏菌弱毒疫苗株均可购自中国药品生物制品研究所)。
将其中一株免疫效果较好的布鲁氏菌羊种M5疫苗株的bp26基因缺失突变株命名为M5-26，该细胞株已于2007年03月30日保藏于位于中国湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M207030。
本发明的第二个目的是提供一种构建上述布鲁氏菌弱毒疫苗突变株的方法。
本发明所提供的布鲁氏菌弱毒疫苗突变株的构建方法，可包括以下步骤1)设计引物分别依据布鲁氏菌全基因组序列中靶基因bp26、wboA、omp31、P39或pgm的上、下游已知区域的核苷酸序列，各设计两对特异的PCR引物，扩增目的基因上、下游两个长度为500bp至1000bp的同源性核苷酸片段；为定向连接成含缺损基因的同源性核苷酸片段，所述扩增上游片段的逆向引物和扩增下游片段的正向引物的5’端添加一种相同的限制性内切酶识别位点及其保护性碱基，所述扩增上游片段的正向引物和扩增下游片段的逆向引物的5’端添加另一种相同的限制性内切酶识别位点及其保护性碱基，此外，为防止改变下游基因的读码框架，扩增上游同源性核苷酸片段的逆向引物与扩增下游同源性核苷酸片段的正向引物的5’末端在缺失目的基因相应区域的间隔碱基数为3的倍数；2)目的基因缺陷型同源性核苷酸片段的获得以布鲁氏菌的基因组DNA为模板，分别在步骤1)设计的两对引物的引导下进行PCR扩增，得到两个同源性核苷酸片段，再将这两个上、下游同源性核苷酸片段定向连接起来，得到目的基因缺陷型同源性核苷酸片段；3)将步骤2)获得的目的基因缺陷型同源性核苷酸片段连接入自杀载体中，得到含有目的基因缺陷型同源性核苷酸片段的重组自杀载体；4)将步骤3)构建的含有目的基因缺陷型同源性核苷酸片段的重组自杀载体转化布鲁氏菌，筛选阳性克隆，得到缺失目的基因的布鲁氏菌弱毒疫苗突变株。
在上述布鲁氏菌弱毒疫苗突变株的构建方法中，步骤1)中依据bp26的上游已知区域的核苷酸序列设计的PCR引物可为序列表中的序列1和序列2，依据bp26的下游已知区域的核苷酸序列设计的PCR引物可为序列表中的序列3和序列4；扩增上游片段的逆向引物和扩增下游片段的正向引物的5’端添加的限制性内切酶识别位点可任意选择，如Bgl II识别位点等，其保护性碱基可为序列表中序列5。所述扩增上游片段的正向引物和扩增下游片段的逆向引物的5’端添加的限制性内切酶识别位点可依据载体确定，如可为BamHI识别位点，其保护性碱基可为序列表中序列6。
步骤3)中用于构建含有目的基因缺陷型同源性核苷酸片段的重组自杀载体的出发载体可为pKNG101或pCVD442等自杀载体，优选为pKNG101(Kaniga K，DelorI，Cornelis GR.A wide-host-range suicide vector for improving reverse geneticsin gram negative bacteriainactivation of the blaA gene of Yersiniaenterocolitica.Gene.1991，109(1)137-41)。
步骤4)中用于转化含有目的基因缺陷型同源性核苷酸片段的重组自杀载体的布鲁氏菌出发菌株可为布鲁氏菌羊种M5株、人用104M株或猪种S2株。
本发明针对现有的布鲁氏菌弱毒疫苗存在难以鉴别诊断等问题，通过基因敲除的方式制备了它们的突变株，以小鼠为模型的动物实验结果表明，突变株的免疫保护作用良好，并且能够与非突变株感染进行鉴别，构建的布氏菌活菌苗突变株缺失了病原体的某些基因，这些基因是细菌复制非必需的同时它们又编码免疫显性抗原，而且保持了母系菌株的免疫力而毒力不增加，此外，由于本发明构建的突变株缺失了某个抗原蛋白基因，因此还可以根据缺失基因的免疫生物学特性建立区分疫苗免疫和自然感染的鉴别诊断方法。本发明的布鲁氏菌弱毒突变株有望发展成为带标记的弱毒疫苗，对控制布病的流行、传播和国民经济的健康发展具有重要的实际意义，应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。


图1为布鲁氏菌弱毒疫苗突变株构建过程的流程2为PCR扩增的F1和F2片段的琼脂糖凝胶电泳检测结果图3为F1和F2连接产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见《Molecular CloningA Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular CloningA Laboratory Manual，3rdedition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。所用引物均由上海生工合成。
实施例1、布鲁氏菌羊种M5疫苗株bp26基因缺失突变株的构建及其毒力和免疫保护作用评价一、布鲁氏菌羊种M5疫苗株bp26基因缺失突变株的构建选择缺失靶基因依据的条件第一，基因缺失后不影响布鲁氏菌疫苗突变体的复制，并且毒力不增加，而免疫力不降低；第二，缺失基因应编码免疫显性的抗原蛋白。依据上面的条件选择wboA、bp26、omp31、P39或pgm作为用于构建布鲁氏菌弱毒疫苗突变株的缺失靶基因。以缺失bp26为例，参见图1用本发明的方法构建布鲁氏菌羊种M5疫苗株的bp26缺失突变株，具体过程包括以下步骤1、PCR引物设计依据布鲁氏菌羊种菌16M株的全基因组序列，在bp26基因上下游设计两对特异的PCR引物P1A/P1B与P2A/P2B，在上游片段的逆向引物P1B和下游片段的正向引物P2A的5′-末端添加相同的限制性核苷酸内切酶Bgl II识别位点及其保护性碱基(GAAGATCT，序列表中序列5)，在上游片段的正向引物P1A和下游片段的逆向引物P2B的5′-末端，分别添加BamHI酶切位点及其保护性碱基(CGGGATCC，序列表中序列6)，引物序列如下P1A5′-CGGGATCCGGTTTGTAACGATTTTAAATTA-3′(序列表中序列1)P1B5′-GAAGATCTTATCGACCCCATACTGCGGGAA-3′(序列表中序列2)；P2A5′-GAAGATCTTTTTAGAGGATGTCCTTTTC-3′(序列表中序列3)P2B5′-CGGGATCCAAGACCACTGCCGCATACCG-3′(序列表中序列4)。
2、目的基因缺陷型同源性核苷酸片段的获得1)PCR扩增以布鲁氏菌羊种菌16M株(购自中国药品生物制品研究所)的基因组DNA为模板，分别在步骤1设计的两对引物的引导下进行PCR扩增，50μl反应体系为10×PCR缓冲液5μl，上游引物(5uM)2μl，下游引物(5uM)2μl，dNTPs(10μM)0.5μl，rTaq(5u/ul)0.4μl，水38.μl，布鲁氏菌基因组DNA(20ng/μl)2μl。PCR扩增条件为先95℃3min；然后94℃30sec，58℃40sec，72℃1min，共30个循环，最后72℃10min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2所示(泳道1为F1片段，泳道2为F2片段，泳道3为DNA Marker DL2000)，经扩增获得了两个同源性核苷酸片段，即长度约为700bp的F1和长度约为500bp的F2，与预期结果相符。
2)纯化PCR产物用诺德金生物公司生产的PCR产物纯化/琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对步骤1)的PCR扩增产物进行纯化，方法为取待纯化的PCR产物200μl，与等体积的结合液充分混匀，短暂离心后转移到吸附柱中，室温放置1min后12000rpm离心1min，弃废液后向柱中加入600μl漂洗液AW，12000rpm离心1min，再加500μl漂洗液AW，12000rpm离心1min后将吸附柱置于一新的离心管中，开盖放置1min，彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液，加50μl无菌水洗脱，37℃放置2min，最后12000rpm离心1min收集纯化产物。
3)酶切PCR产物用限制性内切酶Bgl II对步骤2)经纯化的两个DNA片段分别进行酶切，20μl酶切体系为DNA片段(1000ng)4μl，Bgl II内切酶(TAKARA公司)1μl，10×酶切缓冲液2μl，水13μl。酶切条件为37℃作用4小时。反应结束后，用GeneacidPCR产物试剂盒纯化酶切后的片段，最后用20μl的水洗脱(重复洗2次)。
4)酶切产物的连接在T4DNA连接酶的作用下，将两个酶切片段F1和F2在4℃下连接过夜(12-24小时)，连接体系为片段F1酶切产物200ng，片段F2酶切产物200ng，T4DNA连接酶1μl，10×连接酶缓冲液1μl，补加水至10μl。连接反应结束后，对连接产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示(泳道1为连接产物，泳道2为DNA MarkerDL2000)，用PCR产物纯化/琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒切胶回收F1-F2目的DNA片段，回收及纯化方法为称重并记录小离心管的重量，紫外灯下从琼脂糖凝胶中切割F1-F2目的片段放入称好的小离心管中，称重，计算出胶块重量，每10mg胶块加入10μl结合液BS，涡旋振荡均匀，50-65℃水浴作用10min，期间不时摇动，使胶块完全溶解。瞬时离心，将溶液全部转移至吸附柱中，室温放置1min，12000rpm离心1min，弃废液，吸附柱放回收集管中，再加600μl漂洗液AW，12000rpm离心1min，弃废液，吸附柱放回收集管中，加500μl漂洗液AW，12000rpm离心1min，弃废液，吸附柱放回收集管中，12000rpm离心2min，将吸附柱转至新的离心管中，开盖放置1min，彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液，加50μl无菌水至吸附柱中，室温放置2min，最后12000rpm离心1min，得到F1-F2目的DNA纯化样品，以此作为目的基因缺陷型同源性核苷酸片段。
3、构建含有目的基因缺陷型同源性核苷酸片段的自杀载体1)酶切F1-F2片段和自杀质粒用BamHI(50U)分别消化约500ng的F1-F2片段和约1000ng的自杀质粒pKNG101，20μl酶切反应体系及反应条件为F1-F2或pKNG101(500ng或1000ng)4μl，BamHI内切酶10×缓冲液2μl，水13μl，在30℃下作用12h后，分别用Geneacid PCR产物试剂盒纯化消化产物，方法为将100μl反应产物置于一微量离心管中，加5倍体积的DF缓冲液，振荡混匀，加到装有收集管的DF离心柱中，13000rpm离心30sec，弃废液后重新将DF柱装到收集管上，向柱中加600μl Wash缓冲液，13000rpm离心30sec，弃废液后重新将DF柱装到收集管上，13000rpm离心3min干燥离心柱，将干燥后的离心柱装到一新离心管上，加15-50μl无菌去离子水，室温放置3min，最后13000rpm离心2min收集纯化的DNA样品。
2)F1-F2片段与质粒连接在T4DNA连接酶的作用下，将步骤1)中经酶切及纯化后的F1-F2片段与pKNG101酶切产物在4℃连接过夜，以将片段F1-F2插入自杀质粒的BamHI位点处，得到含有F1-F2片段的重组载体，命名为pKNG101/F1-F2，连接反应体系为F1-F2片段酶切产物200ng，pKNG101酶切产物100ng，T4DNA连接酶1μl，10×缓冲液1μl，补加水至10μl。
3)制备大肠杆菌SPY372λpir感受态接种受体菌大肠杆菌SPY372λpir(Millert VL，Mekalanos JJ.A Novel SuicideVector and Its Use in Construction of Insertion MutationsOsmoregulation ofOuter Membrane Proteins and Virulence Determinants in Vibrio cholerae RequirestoxR.Journal of Bacteriology.170(6)2575-2583)于3mL LB肉汤培养基(胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g、950mL去离子水)中，在37℃下150rpm摇菌至浑浊(控制OD值为0.4-0.6，即菌量不能太多，也不能太少)，4500rpm离心5min集菌，用1mL的0.1M CaCl2洗菌两次(用毛细管将菌轻轻悬起，4℃下5000rpm离心5min，弃上清)，加入1mL的0.1M CaCl2重悬菌体，4℃过夜，24小时内备用。过夜制备的感受态菌转化效率最高，但存放时间不能太长(不超过48h)，否则感受态细菌易老化。取100μl制备的感受态菌，接入3mL含40μg/mL氨苄青霉素的LB肉汤(ApR)中，过夜培养无菌体生长，确定没有污染。
4)转化大肠杆菌SPY372λpir取100-200μl步骤3)制备的大肠杆菌SPY372λpir感受态细菌，加入到1.5mL的离心管中，再加入10μl步骤3)获得的连接产物，冰浴30min后，于42℃(水浴)热冲击90秒，冰浴3min，加入400μl的LB肉汤，离心管口用封口膜封紧，37℃下摇动2小时，取150μl涂于含40μg/mL氨苄青霉素的LB抗性平板(ApR)，倒置于37℃培养箱中，培养12-16小时，挑取10-20个克隆，于LB琼脂平板上在37℃下增菌培养12小时，用特异引物P1A和P2B引导的PCR反应筛选出阳性克隆，可扩增出1200bpDNA片段的为阳性克隆。
4、转化布鲁氏菌1)提取含有目的基因缺陷型同源性核苷酸片段的自杀质粒用GENEAID质粒微量提取试剂盒从步骤3筛选出的大肠杆菌SPY372λpir的阳性克隆中提取自杀质粒，将鉴定正确的大肠杆菌SPY372λpir阳性克隆接种到6mL的LB肉汤(ApR)培养基中，在37℃下培养6-8小时(OD值0.6-0.8)，12000rpm离心1min集菌，弃上清，加入200μlPD1(RNase A added)，充分混匀；再加入200μlPD2，上下翻转4-6次，此时溶液变为澄清透明；加入300μl PD3，上下翻转4-6次后产生大量白色絮状沉淀，12000rpm离心10min；将上清小心转移至离心柱内，避免带有菌体沉淀颗粒，12000rpm离心1min，倒掉离心管内液体；在离心柱内加入400μlW1溶液，12000rpm离心1min，倒掉离心管内液体；在离心柱内加入600μlWash Buffer溶液，12000rpm离心1min，倒掉离心管内液体；再离心1min，甩干柱内洗液；加入20μl无菌去离子水，12000rpm离心1min收集质粒。取2μl质粒，加2μl载样缓冲液，补水至10μl，进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果可见约8400bp的明亮致密条带。
2)羊种布鲁氏菌M5株电转化感受态细胞制备将羊种布鲁氏菌M5株(购自中国药品生物制品研究所)接种到5mL LB液体培养基中，37℃低速振荡培养6小时至OD值为0.6-0.8，将电击杯(1mm)和无菌去离子水预先在冰浴上预冷，在4℃下4000rpm离心5min收集菌体，用等体积的预冷无菌去离子水(5mL)洗涤两次，离心集菌，再用等体积的预冷无菌去离子水(5mL)悬浮均匀，分装成50μl体系，置冰浴上备用。
3)电转化取1μl pKNG101/F1-F2的重组质粒(100ng左右)，加入到步骤2)中新鲜制备的50μl感受态细菌(预冷10min)中，轻微混匀，置冰上继续放置15min，加入到已预冷的电击杯中(贴壁加入避免气泡产生)，于25μF、200Ω、1.8Kv的电击参数下电击。电击后立即加入500μl的LB液体培养基悬浮细菌，将电击细胞转到离心管中，37℃低速振荡培养2小时，取100μl涂于含5％蔗糖的LB琼脂平板(又称LB-蔗糖平板)上，37℃过夜培养。
6)突变株筛选和鉴定从每个LB-蔗糖平板上各挑取5-6个克隆，涂抹在LB-蔗糖平板上37℃增菌培养12小时后，各取约2mg细菌置于含50μl无菌蒸馏水的小管中，混匀，煮沸5分钟后，10000rpm离心10min，以上清液为模板，用引物P1A/P2B进行PCR扩增，挑选仅扩增出1200bp F1-F2长度的小片段克隆，再于LB-蔗糖平板上进行稀释培养，各取5-6个克隆重复进行PCR鉴定，将连续3次经PCR鉴定均为阳性克隆作为目的基因缺陷突变株。对突变株进行序列测定，表明获得了序列正确的布鲁氏菌M5疫苗株bp26基因缺失突变株。
二、布鲁氏菌M5疫苗株bp26基因缺失突变株的毒力和免疫保护作用测定1、突变株的毒力测定取TSA(tryptose soy agar)培养基(胰蛋白胨17.0g、大豆胨3.0g、葡萄糖2.5g、NaCl 5.0g、K2HPO42.5g、琼脂20.0g、蒸馏水1000mL)上生长的布鲁氏菌M5疫苗株和步骤一获得的bp26基因缺失的突变株菌落，分别用PBS制成1×105CFU菌悬液，再将75只6-8周雌性BALB/c小鼠随机分成三组，分别在腹膜内每只小鼠注射0.2mL布鲁氏菌M5疫苗株和bp26基因突变株菌液(M5突变株)，在另一组每只小鼠注射0.2mL生理盐水作空白对照。分别在感染后的第8，15，28，42和60天，从每组中取5只小鼠处死，无菌条件下取出脾脏、称重、然后加5mL的PBS匀浆，10倍系列稀释后取0.1mL接种至TSA平板培养基上，30℃培养5天后细菌记数(CFU)，推算全脾内活苗数，最后换算成对数值，结果如表1和表2所示。表1显示了布鲁氏菌M5疫苗株和M5疫苗突变株脾内细菌记数情况，表2显示了二者感染小鼠后的炎症应答情况。从二者感染小鼠后脾内活菌记数和脾重可以看出，布鲁氏菌M5疫苗株和本发明的M5疫苗突变株的毒力无有意义的差别，即突变株的毒力未增加。
表1布鲁氏菌M5疫苗株和M5疫苗突变株脾内细菌记数结果

注每组测定结果均为5只小鼠的平均值。
表2 布鲁氏菌M5疫苗株和M5疫苗突变株的脾重计算结果

注每组测定结果均为5只小鼠的平均值。
2、测定布鲁氏菌羊种M5疫苗株bp26基因缺失突变株的免疫保护作用取TSA(tryptose soy agar)培养基上生长的布鲁氏菌S2308(购自中国药品生物制品研究所)菌落，用PBS制成5×104CFU菌悬液，取布鲁氏菌羊种M5疫苗株或bp26基因缺失突变株免疫小鼠10周后，各组中10只小鼠分别腹膜内攻毒0.2mL的5×104CFU布鲁氏菌株S2308，同时设空白对照组，攻毒15天后，处死小鼠，取出脾脏，用5mL的PBS匀浆，用PBS系列稀释后，取0.1mL接种TSA平板(平板中加0.1％赤癣糖醇保证只有S2308能生长)，30℃培养5天后细菌记数(CFU)，推算全脾内活菌数，结果见表3。由表3可以看出，分别由M5疫苗株和M5疫苗突变株免疫的小鼠组与空白对照组相比，脾内活菌记数明显降低，表明疫苗株和疫苗突变株均具有良好的免疫保护作用。将用上述方法获得的免疫效果较好的布鲁氏菌羊种M5疫苗株bp26基因缺失突变株命名为M5-26，该细胞株已于2007年03月30日保藏于位于中国湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M207030。
表3布鲁氏菌M5疫苗株和M5疫苗突变株免疫保护作用测定结果

注每组测定10只小鼠的结果。
序列表<160>6<210>1<211>29<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>1cgggatccggt ttgtaacgat tttaaatta29<210>2<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2gaagatcttat cgaccccata ctgcgggaa29<210>3<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3gaagatctttt tagaggatgt ccttttc 27<210>4<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>4cgggatccaag accactgccg cataccg 27<210>5<211>7<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>5gaagatct7<210>6<211>7<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>
<400>6cgggatcc 权利要求
1.布鲁氏菌弱毒疫苗突变株，是将布鲁氏菌弱毒疫苗株缺失bp26、wboA、omp31、P39或pgm基因后得到的布鲁氏菌弱毒疫苗突变株。
2.根据权利要求1所述的布鲁氏菌弱毒疫苗突变株，其特征在于所述布鲁氏菌弱毒疫苗株为羊种M5株、人用104M株或猪种S2株。
3.根据权利要求1所述的布鲁氏菌弱毒疫苗突变株，其特征在于为生物保藏号为CCTCC M207030的布鲁氏菌弱毒疫苗突变株M5-26。
4.一种构建权利要求1所述的布鲁氏菌弱毒疫苗突变株的方法，包括以下步骤1)分别依据布鲁氏菌全基因组序列中靶基因bp26、wboA、omp31、P39或pgm的上、下游已知区域的核苷酸序列，各设计两对特异的PCR引物，扩增目的基因上、下游两个长度为500bp至1000bp的同源性核苷酸片段；为定向连接成含缺损基因的同源性核苷酸片段，所述扩增上游片段的逆向引物和扩增下游片段的正向引物的5’端添加一种相同的限制性内切酶识别位点及其保护性碱基，所述扩增上游片段的正向引物和扩增下游片段的逆向引物的5’端添加另一种相同的限制性内切酶识别位点及其保护性碱基，此外，为防止改变下游基因的读码框架，扩增上游同源性核苷酸片段的逆向引物与扩增下游同源性核苷酸片段的正向引物的5’末端在缺失目的基因相应区域的间隔碱基数为3的倍数；2)以布鲁氏菌的基因组DNA为模板，分别在步骤1)设计的两对引物的引导下进行PCR扩增，得到两个同源性核苷酸片段，再将这两个上、下游同源性核苷酸片段定向连接起来，得到目的基因缺陷型同源性核苷酸片段；3)将步骤2)获得的目的基因缺陷型同源性核苷酸片段连接入自杀载体中，得到含有目的基因缺陷型同源性核苷酸片段的重组自杀载体；4)将步骤3)构建的含有目的基因缺陷型同源性核苷酸片段的重组自杀载体转化布鲁氏菌，筛选阳性克隆，得到缺失目的基因的布鲁氏菌弱毒疫苗突变株。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于所述步骤1)中扩增上游片段的逆向引物和扩增下游片段的正向引物的5’端添加的限制性内切酶识别位点为BglII识别位点，其保护性碱基为序列表中的序列5，扩增上游片段的正向引物和扩增下游片段的逆向引物的5’端添加的限制性内切酶识别位点为BamH I识别位点，其保护性碱基为序列表中的序列6。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于所述步骤1)中依据bp26的上游已知区域的核苷酸序列设计的PCR引物为序列表中的序列1和序列2，依据bp26的下游已知区域的核苷酸序列设计的PCR引物为序列表中的序列3和序列4。
7.根据权利要求4或5或6所述的构建方法，其特征在于所述步骤3)中用于构建含有目的基因缺陷型同源性核苷酸片段的重组自杀载体的出发载体为pKNG101或pCVD442。
8.根据权利要求4或5或6所述的构建方法，其特征在于所述步骤4)中用于转化含有目的基因缺陷型同源性核苷酸片段的重组自杀载体的布鲁氏菌出发菌株为布鲁氏菌羊种M5株、人用104M株或猪种S2株。
9.权利要求1或2或3所述的布鲁氏菌弱毒疫苗突变株在制备布鲁氏菌预防性疫苗中的应用。
10.权利要求1或2或3所述的布鲁氏菌弱毒疫苗突变株在制备鉴别布鲁氏菌疫苗免疫和自然感染试剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了布鲁氏菌弱毒疫苗突变株及其构建方法与应用。其目的是提供布鲁氏菌弱毒疫苗突变株及其构建方法与其在制备布鲁氏菌预防性疫苗中的应用。该布鲁氏菌弱毒疫苗突变株是将布鲁氏菌弱毒疫苗株缺失bp26、wboA、omp31、P39或pgm基因后得到的布鲁氏菌弱毒疫苗突变株。以小鼠为模型的动物实验结果表明，突变株的免疫保护作用良好，而且毒力不增加。此外，由于本发明构建的突变株缺失了某个抗原蛋白基因，因此还可以根据缺失基因的免疫生物学特性建立区分疫苗免疫和自然感染的鉴别诊断方法。本发明的布鲁氏菌弱毒突变株有望发展成为带标记的弱毒疫苗，对控制布病的流行、传播和国民经济的健康发展具有重要的实际意义，应用前景广阔。
文档编号A61K39/10GK101092605SQ200710099648
公开日2007年12月26日 申请日期2007年5月25日 优先权日2007年5月25日
发明者王效义, 王棠, 郭兆彪, 宋亚军, 周蕾, 杨瑞馥 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所