鉴别布鲁氏菌野毒株与疫苗株a19和s2的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴别布鲁氏菌野毒株与疫苗株A19和S2 的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 布鲁氏菌病（Brucellosis)是由布鲁氏菌属细菌引起的一种广泛分布于世界各 地的人畜（兽）共患传染病，其不仅影响畜牧业的健康发展而且危害人类公共卫生健康。 根据国家卫计委公布的全国法定传染病疫情数据，2014年我国人感染布鲁氏菌病人数为 57222,发病率比2013年增长了 31. 48%。人感染布鲁氏菌病的传染源主要来源于感染的动 物及被污染的畜产品，因此，控制和消灭动物布鲁氏菌病，是防止人类感染布鲁氏病的根本 保障。
[0003] 目前疫苗免疫仍是控制动物布鲁氏菌病的主要措施之一。当前国外主要使用的布 鲁氏菌疫苗株是牛种S19株和RB51株以及羊种Rev. 1株，这些疫苗株我国目前尚未引进和 使用。我国使用的疫苗株主要是牛种布鲁氏菌A19疫苗株和猪种布鲁氏菌S2疫苗株，以前 还曾使用过羊种M5-90疫苗株，由于毒力问题现在暂时不再使用。A19和S2疫苗株的使用 为我国动物群布鲁氏菌病的防控提供了重要保障，但是也存在着无法鉴别疫苗株与野毒感 染株的关键技术瓶颈问题。虽然竞争ELISA(cELISA)和荧光偏振实验（FPT)以其高通量以 及操作方面的优势，在布鲁氏菌弱毒疫苗与野生菌株感染的血清学鉴别有一定的应用，但 是对未知背景的血清样本来说，单次检测仍不能确切分辨疫苗免疫或野毒感染。从病原学 方面鉴别诊断布鲁氏菌野毒株核酸，可以准确判断动物体是否带菌，为布布鲁氏菌病阳性 动物的检疫淘汰提供支撑。因此，利用分子生物学方法，依据疫苗株与其他布鲁氏菌毒株基 因组差异碱基序列，通过PCR扩增及PCR产物序列测定，可有效实现疫苗株与野毒株的分子 鉴别，将其应用于临床鉴别，可以为我国A19和S2疫苗株的鉴别提供技术保障。
【发明内容】
[0004] 发明人通过基因组序列比对，发现与其他布鲁氏菌属细菌基因组DNA序列不同的 是，A19疫苗株在基因组22840位点处，即SEQ ID No. 5的344位点处，缺失7个核苷酸序 列，该位点后序列为AGATTTCAGA，其他布鲁氏菌序列为AGATTTCAGATTTCAGA，因为此处为 AGATTTC的重复序列，所以在序列比对时会出现两种序列缺失现象（AGATTTC或TTTCAGA)。 在该缺失位点上下游处设计引物，通过PCR扩增后序列测定，序列比对以及测序峰图的不 同就可以特异性鉴别牛种布鲁氏菌A19疫苗株。同样我们发现猪种布鲁氏菌S2疫苗株在 基因组246967位点处，与其他布鲁氏菌属细菌基因组相比，S2疫苗株在该位点处，即SEQ ID No. 6的369位点处缺失25个核苷酸序列（TCCCTCATAAATGGCTTTCTTCATA)，根据该缺失 序列，本发明设计扩增引物，通过序列比对与峰图中是否出现套峰就可以将其与其他布鲁 氏菌野毒株或疫苗株进行鉴别，以上是提出本发明的技术依据。
[0005] 本发明的目的是提供一种鉴别布鲁氏菌野毒株与疫苗株A19和S2的试剂盒及其 使用方法，该试剂盒能够特异地鉴别临床样本中布鲁氏菌A19和S2疫苗株。
[0006] 为实现本发明目的，采用如下技术方案：
[0007] 鉴别布鲁氏菌野毒株与疫苗株A19和S2的试剂盒，该PCR试剂盒由PCR反应液、 DNA聚合酶、阳性质控标准品和阴性质控标准品组成；
[0008] 所述PCR反应液包括鉴定并测序A19疫苗株和S2疫苗株特异性核苷酸序列的引 物对，其中鉴别A19疫苗株的上游引物序列如SEQ ID No. 1所示，下游引物序列如SEQ ID No. 2所示，鉴别S2疫苗株的上游引物序列如SEQ ID No. 3所示，下游引物序列如SEQ ID No. 4所示。分别如下：
[0009] SEQ ID No. 1 :5'-TTCACCGTCATCGGATAATAGGTGCCA-3'
[0010] SEQ ID No. 2 :5'-GGCGGGCTGCATTCTTTACTCTGC-3'
[0011] SEQ ID No. 3 :5'-CCTGCTGAGCGATGACCACCA-3'
[0012] SEQ ID No. 4 :5'-CCGCCAGAACATGCGATTTGA-3'
[0013] 所述阳性质控标准品包括牛种布鲁氏菌A19疫苗株阳性质控标准品和猪种布鲁 氏菌S2疫苗株阳性质控标准品；
[0014] 所述牛种布鲁氏菌A19疫苗株阳性质控标准品由含有562个碱基的核苷酸片段构 成的PEASY-T3重组质粒组成，所述猪种布鲁氏菌S2疫苗株阳性质控标准品由含有539个 碱基的核苷酸片段构成的PEASY-T3重组质粒组成。
[0015] 所述含有562个碱基的核苷酸片段的序列如SEQ ID No. 5所示：
[0016] SEQ ID No. 5 ：
[0017] 5'-TTCACCGTCATCGGATAATAGGTGCCACCCTTTACCGTCGCATCATTGCAGACGATCATGCATTCG CGGCCCGATACGCGCCCGATGCCGGTGATGAAGCCAGCGGCGGGCGCTGCCCCGCCATACATGCCATGCGCTGCCGT CAGCCCCAGTTCCAGAAAGGGGGAACCCGGATCGAGCAATTGCGCCACGCGCTCACGGGGCAGAAGTTTTCCGCGCG AAACATGGCGGTCGCGCGCTTTCTCGCCGCCGCCGTCAATGGCAATGCGCGAGGCTTCCGCCACCACGTCGATTGCC GCCAGCATGGCCTTGCGGTTGGCCTCGAAGCTTGCGCTGCGCGTCGAGATTTCAGAACCGGCATCAACGGGTCTCCT GAAAGAGTTCCCGTCCGATCAGCATACGCCGGATTTCCGACGTGCCCGCGCCGATTTCATAAAGCTTGGCATCGCGC AAAAGGCGGCCCGTCGGATAATCGTTGATATAGCCGTTGCCGCCGAGAGACTGGATCGCCTGCAAGGCCATCTGCGT GGCATTTTCCGCAGAGTAAAGAATGCAGCCCGCC-3'
[0018] 所述含有539个碱基的核苷酸片段的序列如SEQ ID No. 6 :
[0019] SEQ ID No. 6 ：
[0020] 5' -CCTGCTGAGCGATGACCACCACCGAGCCGCGGTCGAACACGGCAAGCTGATTGGCCTGTTTGGAAC GGTCGGCAAGCTCGCGCATGAAGGGCGTGGCGAAGGAGGCAAGCCTGCGCACCGGCGCATGGAGTTGCGCAAGCCCG AACAGCTTCAGCGTCAGTGAATAACGGTCGCCATCGAGTTTGGTGACATAGCCGCGCTTCACCAGCCGGTCCAGCAT CCGGTAAAATTCGTTGGGGCTGCGGTCGAGATGCTTGGCGATCTCGGCCTGTGTCAGCCCGCCATCCACACTCGCCA GCAATTCCAATATGTCCAGCCCCTTGTCCAGCGCGGGCGCGCGATAGCGATCGTCAGTTTCCAAGGTCGGCTACGAA CAGCGTAAAGGGTGAAAGGAATAACCACCCGCAAATCGCCTTGACCATGTTTGAATAATATGTTTGCATATAAATGG AAGCCCCACAATCGGGGAACGTGGACGGGGGAGCGTCCGCTAATAAGGAGGAGACGAATGCAGGATTTCAAATCGCA TGTTCTGGCGG-3'
[0021] 所述PCR反应液还包括含有dNTPs、Mg'双蒸水的PCR缓冲液。
[0022] 所述含有562个碱基的核苷酸片段是从牛种布鲁氏菌A19疫苗株中克隆得到，所 述含有539个碱基的核苷酸片段是从猪种布鲁氏菌S2疫苗株中克隆得到。
[0023] 所述阴性质控标准品为无菌双蒸水（(IdH2O)。
[0024] 本发明进一步提供了鉴别布鲁氏菌野毒株与疫苗株A19和S2的PCR试剂盒的使 用方法，该方法的条件和步骤如下：
[0025] (1)提取待测样本的基因组DNA ;
[0026] 所述待检测的样本为血液、奶样、组织样本、气溶胶样本等。
[0027] (2)以提取的样本基因组DNA为模板，将样本DNA、阳性质控标准品和阴性质控标 准品分别加入到含有PCR反应液和DNA聚合酶的50 μ L体系的PCR反应管中，按照经过 优化后的PCR反应条件进行扩增，具体的反应条件为：94°C 3min，94°C 30sec、60°C 30sec、 72°C 30sec，35 个循环，72°C IOmin ;
[0028] 所述PCR反应液由鉴定布鲁氏菌A19疫苗株和S2疫苗株的引物对以及含有 dNTPs、Mg'双蒸水的PCR缓冲液组成；
[0029] 所述引物对分别为 SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2 和 SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4,分 别命名为A19-F、A19-R和S2-F、S2-R，序列如下：
[0030] 正向引物 A19-F :5' -TTCACCGTCATCGGATAATAGGTGCCA-3'
[0031] 反向引物 A19-R :5' -GGCGGGCTGCATTCTTTACTCTGC-3'
[0032] 正向引物 S2-F :5' -CCTGCTGAGCGATGACCACCA-3'
[0033] 反向引物 S2-R :5' -CCGCCAGAACATGCGATTTGA-3'
[0034] 所述的PCR反应体系为50 μ L，具体包括以下组份：
[0035]
[0036] (3)取50yL PCR产物，以1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，观察鉴别牛种布鲁氏 菌A