19株引物对扩增出562bp及与之大小对应的条带，鉴别猪种布鲁氏菌S2疫苗株引物对 扩增出539bp及与之大小对应的条带；本领域技术人员应知晓，在琼脂糖凝胶电泳检测时， 显示与目的条带大小对应的条带，意指PCR扩增产物大小相近，因样品来源或目标种属不 同，PCR产物大小会有较小差异，但显示条带对应，例如相差30bp/20bp范围内的条带均显 示大小对应。
[0037] (4)如果上述PCR检测结果与目的条带不符，则说明模板为布鲁氏菌阴性，如果 PCR检测条带大小正确，则对阳性条带进行切胶回收纯化，然后再进行序列测定。
[0038] (5)结果判定：
[0039] A19疫苗株鉴别结果判定，使用A19-F引物对纯化的562bp或与之大小对应的产物 进行测序，如果测序结果峰图为单一峰，与SEQ ID No. 5比对后完全匹配，则该样本为A19 疫苗株；如果测序结果峰图为单一峰，与SEQ ID No. 5比对后在第344位点处多出7个核苷 酸序列（AGATTTC或TTTCAGA)，则该样本为除A19疫苗株以外的其他布鲁氏菌野毒株或疫 苗株；如果测序结果与SEQ ID No. 5比对，在峰图的序列第354位，即AGATTTCAGA后出现套 峰，则该样本为A19疫苗株和其他布鲁氏菌株混合。
[0040] S2疫苗株鉴别结果判定，使用S2-F引物对纯化的539bp及与之大小对应的产物进 行测序，如果测序结果峰图为单一峰，与SEQ ID No. 6比对后完全匹配，则该样本为S2疫苗 株；如果测序结果峰图为单一峰，与SEQ ID No. 6比对后在第369位点处多出25个核苷酸 序列（TCCCTCATAAATGGCTTTCTTCATA)，则该样本为除S2疫苗株以外的其他布鲁氏菌野毒株 或疫苗株；如果测序结果与SEQ ID No. 5比对，在峰图序列第369位点后出现套峰，则该样 本为S2疫苗株和其他布鲁氏菌株混合。
[0041 ] 本领域技术人员应当明了，上述鉴别方法，其直接目的是鉴别菌株种类，而非获取 疾病诊断结果。
[0042] 本发明取得了以下效果：
[0043] (1)为我国A19和S2疫苗株的鉴别提供新的技术手段；
[0044] (2)本发明所述引物对具有较高的特异性，通过扩增-电泳检测，可有效的区分布 鲁氏菌和其他常规细菌菌株；
[0045] (3)本发明所述鉴别方法，有效地将其他布鲁氏菌野毒株与疫苗株区分开来，具有 极高的准确率。
【附图说明】
[0046] 图I A19疫苗株缺失位点处上下游序列PCR扩增，+ :模板为A19疫苗株阳性质控 标准品的PCR扩增产物562bp，-:模板为阴性质控标准品，1-5:模板分别为牛种布鲁氏菌 疫苗株A19株、猪种布鲁氏菌疫苗株S2株、羊种布鲁氏菌疫苗株M5-90株、绵羊种布鲁氏菌 63/290株、犬布鲁氏菌RM6/66株基因组DNA的PCR扩增产物562bp ;6-10 :模板分别为大 肠杆菌0157:H7、小肠结肠炎耶尔森菌0:9、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、牛分支杆菌基因组 DNA0
[0047] 图2 S2疫苗株缺失位点处上下游序列PCR扩增，+ :模板为S2疫苗株阳性质控标 准品的PCR扩增产物539bp，-:模板为阴性质控标准品，1-5:模板分别为猪种布鲁氏菌疫 苗株S2株、牛种布鲁氏菌疫苗株A19株、羊种布鲁氏菌疫苗株M5-90株、绵羊种布鲁氏菌 63/290株、犬布鲁氏菌RM6/66株基因组DNA的PCR扩增产物539bp ;6-10 :模板分别为大 肠杆菌0157:H7、小肠结肠炎耶尔森菌0:9、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、牛分支杆菌基因组 DNA0
[0048] 图3 A19疫苗株缺失位点处序列测定峰图，A :测序峰图为单一峰，与SEQID No. 5 比对后完全匹配，检测模板为A19疫苗株。B :测序峰图为单一峰，与SEQ ID No. 5比对后在 344位点处多出7个核苷酸序列（AGATTTC或TTTCAGA)，检测模板为除A19疫苗株以外的其 他布鲁氏菌野毒株或疫苗株。C :测序结果与SEQ ID No. 5比对，峰图在序列第354位点后， 即AGATTTCAGA序列后出现套峰，检测模板为A19疫苗株与其他布鲁氏菌株的混合。
[0049] 图4 S2疫苗株缺失位点处序列测定峰图，A :测序峰图为单一峰，与SEQ ID No. 6 比对后完全匹配，检测模板为S2疫苗株。B :测序峰图为单一峰，与SEQ ID No. 6比对后在 369处多出25个核苷酸序列（TCCCTCATAAATGGCTTTCTTCATA)，检测模板为除S2疫苗株以外 的其他布鲁氏菌野毒株或疫苗株。C :测序结果与SEQ ID No. 6比对，峰图在序列位点369 以后出现套峰，检测模板为S2疫苗株与其他布鲁氏菌株的混合。
【具体实施方式】
[0050] 下述实施例用于进一步说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0051] 以下实施例均按照常规试验条件与方法进行，或者按照制造厂商所建议的试验条 件。
[0052] 1.试验材料
[0053] 牛种布鲁氏菌疫苗株A19株（B. abortus A19)，猪种布鲁氏菌疫苗株S2株（B. suis S2)，羊种布鲁氏菌疫苗株M5-90株（B. melitensis M5-90)，绵羊种布鲁氏菌63/290株 (B. ovis 63/290)，犬布鲁氏菌 RM6/66 株（B. canis RM6/66)，大肠杆菌 0157:H7、小肠结 肠炎耶尔森菌0:9、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌（CMCC25623)、牛分支杆菌（M.bovis ATCC 19210)、临床上确诊为布鲁氏菌阳性的血液、奶样、流产胎儿组织和气溶胶等DNA样本均由 山东省农业科学院奶牛研究中心疾病研究室保存。
[0054] DNA聚合酶（TaKaRa LA Taq)购自宝生物工程（大连）有限公司，琼脂糖购自北京 全式金生物技术有限公司，快速DNA提取试剂盒、细菌DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试 剂盒等均购自天根生化科技（北京）有限公司，其他生化试剂均为进口分装或国产分析纯。 PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，DNA序列测定由山东省农业科学院测 序中心完成。
[0055] 2.实验仪器
[0056] 梯度PCR仪（TaKaRa TP-600)，电泳仪（北京市六一仪器厂DYY-6C型），Alpha个人 型凝胶成像系统 red(美国 ProteinSimple 公司），DNA 测序仪（ABI3730XL DNA Analyzer)。
[0057] 实施例一、鉴别布鲁氏菌野毒株与疫苗株A19和S2的PCR试剂盒的使用方法
[0058] (1)提取待测样本的基因组DNA :使用快速DNA提取试剂盒对待检测的血液、奶样、 组织样本、气溶胶等样本进行基因组DNA的提取。
[0059] (2)以提取的样本基因组DNA为模板，分别使用A19-F、A19-R和S2-F、S2-R引物 对进行PCR扩增，同时以阳性质控标准品和阴性质控标准品分别作为阳性和阴性对照，依 次将50 μ L反应体系的各组份加到PCR反应管中，分别为10XPCR Buffer :5. 0 μ L，dNTP Mixture (2. 5mM) :8. 0 μ L，10 μ M 的正向引物：2. 0 μ L，10 μ M 的反向引物：2. 0 μ L，待测样本 DNA :5. 0 μ L，DNA聚合酶：0· 5 μ L，最后加27. 5 μ L双蒸水（CldH2O)补足到50 μ L。PCR的扩 增效果直接影响到检测结果的特异性和灵敏性，因此需要对PCR反应条件中的相关参数进 行优化，包括引物的浓度、Mg 2+浓度、退火温度、退火时间、循环次数以及延伸时间等。PCR反 应条件的优化采用现有技术，最终优化后的PCR反应条件为：引物浓度为0. 4 μ m〇L/L，Mg2+ 浓度为 〇.2mmoL/L，PCR 反应条件为：94°C 3min，94°C 30sec、60°C 30sec、72°C 30sec，35 个 循环，72°C lOmin。以上述优化好的反应条件进行PCR扩增。
[0060] (3)反应结束后，取50 μ L PCR产物，以1. 5%琼脂糖凝胶进行电泳（120V25min) 检测，观察鉴别牛种布鲁氏菌A19株引物对扩增出562bp的条带，鉴别猪种布鲁氏菌S2疫 苗株扩增出539bp的条带。
[0061] (4)如果上述PCR检测结果与目的条带不符，则说明模板为布鲁氏菌阴性，如果 PCR检测条带大小正确，则对阳性条带进行切胶回收纯化，然后用DNA测序仪进行序列测 定。
[0062] (5)结果判定：
[0063] A19疫苗株鉴别结果判定，使用A19-F引物对纯化的562bp产物进行测序，如果测 序结果峰图为单一峰，与SEQ ID No. 5比对后完全匹配，则该样本为A19疫苗株；如果测序 结果峰图为单一峰，与SEQ ID No. 5比对后在第344位点处多出7个核苷酸序列（AGATTTC 或TTTCAGA)，则该样本为除A19疫苗株以外的其他布鲁氏菌野毒株或疫苗株；如果测序结 果与SEQ ID No. 5比对，在峰图的序列第354位，即AGATTTCAGA后出现套峰，则该样本为 A19疫苗株和其他布鲁氏菌株混合。
[0064] S2疫苗株鉴别结果判定，使用S2-F引物对纯化的539bp产物进行测序，如果 测序结果峰图为单一峰，与SEQ ID No. 6比对后完全匹配，则该样本为S2疫苗株；如果 测序结果峰图为单一峰，与SEQ ID No. 6比对后在第369位点处多出25个核苷酸序列 (TCCCTCATAAATGGCTTTCTTCATA)，则该样本为除S2疫苗株以外的其他布鲁氏菌野毒株或疫 苗株；如果测序结果与SEQ ID No. 6比对，在峰图序列第369位点后出现套峰，则该样本为 S2疫苗株和其他布鲁氏菌株混合。
[0065] 实施例二、PCR试剂盒的组装
[0066] (1)配制PCR反应液：
[0067] ①分别设计2对鉴定牛布鲁氏菌A19疫苗株和猪种布鲁氏菌S2疫苗株