Dock2基因片段作为猪免疫性状的分子标记及应用
【技术领域】
[0001] 本发现属于家畜分子标记制备技术领域，具体涉及D0CK2基因片段作为猪免疫性 状的分子标记及应用。
【背景技术】
[0002] 我国养猪历史悠久，养猪经验和品种资源极为丰富，养猪数量稳居世界榜首，并推 动了世界养猪业的发展。然而，养猪业的发展也面临着很多挑战，其中突出的问题是对某些 疫病的控制能力尚低，在疾病监测、诊断、预防和扑灭等环节仍存在很多问题，因此，在养殖 生产过程中的疾病问题是影响养猪业发展的关键性问题之一。生猪养殖过程中疾病的爆发 可直接导致生猪的死亡，出栏率降低，进而影响生猪养殖的经济效益。于此同时，为了预防 疾病而大量使用药物一方面增加养殖成本，另一方面也导致了病菌耐药性出现而使得养殖 场疾病的防治更加艰难，药物大量使用也使得猪肉食品安全问题突出。因此，在生猪养殖过 程中的疾病防控，直接关系到这一产业的发展和猪肉食品市场。尽量避免大量使用药物，寻 找抗病新策略，从培育抗病品系入手，是改善养猪行业行情的热门研究方向。
[0003] 外来种猪在育成的过程中生长性状受到强烈选择，有研究表明生长与免疫存在 负相关（唐国庆等，猪抗病育种研究进展.中国畜牧兽医，2002, 29(6) :29-32;严燕等， 猪遗传抗性与抗病育种研究进展.猪业科学，2007, 6:58-61.)，中外猪种在抗病、抗逆 性状中存在明显差异（唐利洲等，MHC基因对地方保护猪种抗病选育的应用前景.畜牧 与饲料科学，2010,31(2):142-143 ;施启顺等，不同猪种E.coli Fl 8受体基因的多态 性.遗传学报，2003,30(3):221-224.)。本申请人利用全基因组信息进行进化分析，发现 D0CK2 (Dedicator of Cytokinesis2)基因在中外猪种中基因频率存在显著差异，这表明该 基因受到了强烈选择。功能分析发现，D0CK2基因的第3内含子区在物种间高度保守，其中 一个高度保守的CEBP β转录因子结合位点存在一个A/G多态，在中国地方猪品种中G等位 基因频率很高，外来猪品种中A等位基因频率很高。
[0004] 大量的研究表明D0CK2基因在机体免疫抗病中发挥重要作用。D0CK2 属于造血细胞特异表达的CDM蛋白家族成员（Nishihara, T等，Non-adherent cell-specific expression of D0CK2,a member of the human CDM-family proteins. Biochem，1999, 1452:179-187.);研究表明CDM蛋白家族在细胞表面延伸过程起重要 作用（Y. C. Wu 等,C. elegans phagocytosis and cell-migration protein CED_5is similar to human D0CK180. Nature，1998, 392:501-504·)。功能研究表明 D0CK2 主要通 过激活Rac促进免疫细胞伪足形成，促进免疫细胞迀移，而免疫细胞迀移在机体免疫作用 中发挥重要功能（Lauffenburger，D.A 等，Cell migration:a physically integrated molecular process.Cell，1996,84:359-369 ;Yoshinori Fukui 等,Haematopoietic cell-specific CDM family protein D0CK2is essential for lymphocyte migration. Nature，2001，412:826-831.)。Rac属于Rho家族，具有GTP酶活性，Rac激活会引起免疫 细胞表面肌动蛋白纤维丝的组装，从而导致免疫细胞表面形成伪足和褶皱，促使免疫细胞 往高浓度趋化因子部位迁移（Alan Hall, Rho GTPases and the actin cytoskeleton. Science, 1998, 279:1995 ；Hiroshi Nishihara 等,D0CK2associates with CrkL and regulates Racl in human leukemia cell lines.Blood, 2002, 100:3968-3974.)〇 另 外，D0CK2还能够通过调节肌动蛋白细胞骨架，影响淋巴细胞归巢和免疫突触形成； D0CK2缺陷的受体因在器官移植中MHC抗原递呈存在障碍，从而降低免疫排斥反应 (Hongsi Jiang 等，Deletion of D0CK2, a regulator of the actin cytoskeleton in lymphocytes, suppresses cardiac allograft rejection. · JEM, 2005, 202:1121-1130.)〇 D0CK2基因突变会抑制体内Racl活化，从而减低T细胞、B细胞和NK细胞在趋化因子 诱导时的迀移能力；而当侵入性病毒感染D0CK2基因突变的外周血单核细胞时，IFN-a 和IFN-λ分泌显著减少。在D0CK2缺陷的成纤维细胞中，病毒复制增加，被病毒感染 的细胞的死亡的发生也增加 （Kerry Dobbs，B.S.等，Inherited D0CK2deficiency in patients with early-onset invasive infections.The New England Journal of Medicine, 2015, 372:2409-2422.)。这些研究都表明D0CK2在机体免疫抗病中发挥重要作 用。
[0005] 本发明申请中，申请人克隆了 D0CK2基因的第3内含子片段，鉴定了一个与猪免 疫性状密切相关的功能突变位点，为猪免疫性状的的标记辅助选择提供了新的SNP分子标 记。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于通过PCR扩增D0CK2基因第3内含子片段，利用CRS-PCR-RFLP 技术，在杜洛克X二花脸F2代群体中进行分型，分型结果与该群体的免疫指标关联分析， 进而鉴定与猪免疫性状相关的分子标记，为猪的抗病育种提供了新的分子标记。
[0007] 申请人通过基因克隆的方法，得到D0CK2基因第3内含子序列，其核苷酸序列如序 列表SEQ ID N0:1所述。在该序列的35bp处存在一个A35-G35等位基因的碱基突变，通过 在正向引物倒数第四位碱基位置引入突变，使得A35-G35形成BstZ17I-RFLP多态。申请人 将该基因片段作为检测猪免疫性状的分子标记。
[0008] 为了扩增D0CK2基因第3内含子序列，申请人设计了如下所示的引入酶切位点的 引物对：
[0009] 正向引物：5 ' -AGATAAGCCACCACGGAATGGAGAAATTGCgTAT-3 '（见序列表 SEQ ID NO : 2)
[0010] 反向引物：5' -ATCCCTGGTCTGTGGCATGTCC-3'（见序列表 SEQ ID NO :3)。
[0011] 同时申请人制备了检测上述与猪免疫性状相关的分子标记的引物对，该引物对的 DNA序列如下所示：
[0012] 正向引物：5 ' -AGATAAGCCACCACGGAATGGAGAAATTGCgTAT-3 '（见序列表 SEQ ID NO : 2)
[0013] 反向引物：5' - ATCCCTGGTCTGTGGCATGTCC - 3'（见序列表 SEQ ID NO :2)。
[0014] 申请人提供了一种猪免疫性状的分子标记的制备方法，其包括下列步骤：
[0015] 1)提取猪耳样组织基因组DNA ;
[0016] 2)对D0CK2基因第3内含子片段进行扩增、纯化与测序；
[0017] 3)利用CRS - PCR - RFLP方法对该片段在突变位点进行分型；
[0018] 4)利用SAS 9. 1软件进行基因型与猪免疫性状间的关联分析。
[0019] 更详细的技术方案请参见说明书的《【附图说明】》及《【具体实施方式】》中的实施例。
[0020] 本发明应用常规的PCR-RFLP的方法对序列表SEQ ID NO : 1所示的第35位碱基突 变进行了检测，并初步进行其基因型与猪免疫性状之间的关联分析的应用，为猪免疫性状 的分子标记辅助选择提供了 一个新的分子标记。
[0021] 与现有技术相比本发明具有的有益效果：
[0022] 本发明可通过在体外CRS-PCR-RFLP检测猪的基因型，作为非诊断目的的评价猪 的免疫能力，与目前ELISA、流式细胞仪等方法相比，本发明更简便、检测更准确、成本更低 廉、速度也更快。
【附图说明】
[0023] 序列表SEQ ID NO :1是本发明克隆的D0CK2基因内含子，即本发明制备的分子标 记的核苷酸序列。序列长度为116bp，在该序列的35bp处存在一个A/G等位基因突变（35bp 处的碱基"G"为突变后的碱基）。
[0024] 序列表SEQ ID NO :2是本发明克隆的D0CK2基因内含子和本发明分子标记的正向 引物序列。序列长度为34bp。
[0025] 序列表SEQ ID NO :3是本发明克隆的D0CK2基因内含子和本发明分子标记的反向 引物序列。序列长度为22bp。
[0026] 图1 :本发明的总体技术流程示意图。
[0027] 图2 :本发明克隆的D0CK2基因内含子序列PCR产物电泳图谱，附图标记说明：泳 道2-11为扩增个体，泳道1的M为DL 2000。
[0028] 图3 :D0CK2基因内含子序列BstZ17I-RFLP的三种基因型（AA GG AG)电泳图谱， 附图标记说明：泳道2-9为酶切个体，泳道1的M为DL 500。
[0029] 图4 :是本发明克隆的D0CK2基因内含子和本发明分子标记的核苷酸序列。图中 序列的35bp处存在一个A/G等位基因突变（35bp处的英文字母"R"为突变位点）。
【具体实施方式】
[0030] 实施例1猪D0CK2基因内含子序列的克隆
[0031] (1)利用苯酚抽提法提取杜洛克X二花脸F2代群体的耳样组织总DNA
[0032] 1)将杜洛克X二花脸F2代群体（广东华农温氏畜牧股份有限公司提供）的耳样 组织在液氮中磨碎，加入等体积IXSET(ImL),蛋白酶K(10ng/mL)至终浓度200ug/mL，十二 烷基硫酸钠（即SDS，10% )至终浓度0. 5%，摇匀。55°C水浴温育过夜消化。
[0033] 2)将消化后的组织样加入等体积的Tris饱和酚，缓慢颠倒离心管15min，于低温 冷冻离心机中4°C、IlOOOrpm离心10min，小心吸取上清液转移至另一离心管中，注意标上 相应的记号。
[0034] 3)加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（体积比25 :24 :1)，缓慢颠倒离心管10min， 于低温离心机中4°C、IlOOOrpm离心10min，小心吸取上清，转移至另一个干净的离心管中。
[0035] 4)