一种环境雌激素无标记免疫传感器的制备方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种环境雌激素无标记免疫传感器的制备方法及在环境雌激素的检测中的应用，属于新型纳米功能材料和环境检测【技术领域】。本发明利用两种新型纳米功能材料修饰工作电极，利用二者的协同催化作用以及对抗体的吸附作用，从而制备了一种灵敏度高、特异性好、检测快速、制备简单的检测环境雌激素的无标记电化学免疫传感器。
【专利说明】一种环境雌激素无标记免疫传感器的制备方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种环境雌激素无标记免疫传感器的制备方法及应用。具体是采用具有协同催化作用的新型纳米复合材料构建的检测环境雌激素的无标记电化学免疫传感器，属于新型纳米功能材料与环境检测【技术领域】。
【背景技术】
[0002]环境雌激素是一类存在于环境中的化学物质，具有类似生物体内雌激素的活性，进入人体后具有模拟雌激素的作用，通过扰乱人体内分泌、免疫、神经等系统的正常功能而产生如致癌、损害生殖发育系统、免疫系统、神经系统等多种疾病，是一类严重危害人类健康的环境毒素。常见的环境雌激素来源包括如农药(如有机氯农药)、二手烟、废气(如燃烧塑料垃圾产生的有毒气体)、食品添加剂等。
[0003]用于环境雌激素的检测方法主要有高效液相色谱法、气相色谱法、色谱-质谱联用法、酶联免疫法、放射免疫法等。但大多数检测方法仪器贵重、操作复杂，检验人员必须经过严格训练后，方可进行检测。一些简便的方法如电化学分析法，虽操作简单、检测灵敏、快速，但特异性差。因此，可快速、灵敏、高特异性检测环境中的环境雌激素的电化学免疫传感器显得尤为突出。
[0004]电化学免疫传感器由于其灵敏度高、特异性好、操作简便等优点被广泛应用于临床分析和环境检测领域，一般可分为有标记和无标记两种，由于标记物的特性，前者比后者对检测环境要求更严格，操作也相对繁琐，因此其中在检测环境雌激素方面，无标记电化学免疫传感器更有应用前景。构建环境雌激素无标记免疫传感器，关键的技术是提高修饰电极对抗体的固定量和对测试底液的信号响应速度和大小。核壳结构的AuOPd纳米棒复合材料是一种新型贵金属纳米复合材料，由于其生物相容性好以及纳米级尺寸，增加了抗体的吸附量；并且核壳结构中Au为核Pd为壳层，减少了 Pd的使用量，降低了成本；同时其特殊的棒状形貌赋予Pd暴露出更多的催化晶面，可以更好的提高对作为测试底液的双氧水的催化响应速度和电流响应信号大小。另外，CoFe204/rGo—方面增加了电极比表面积,增强电极导电能力，另一方面可以与AuOPd产生协同催化作用，更大的增强对双氧水的催化响应速度和电流响应信号大小。因此，将二者联合使用，可成功用于无标记电化学免疫传感器的构建。
[0005]本发明先后使用C0Fe2CVrG0和AuOPd-Ab对电极进行修饰，然后利用环境雌激素抗原的加入，使得电极对双氧水的电流响应信号降低，从而实现了无标记的电化学免疫传感器的构建，并应用于简单、快速、特异性好和灵敏度高的检测环境雌激素。
【发明内容】
[0006]本发明的目的之一在于避免现有检测方法中存在的仪器设备复杂、操作过程繁琐及特异性差等不足，提供一种环境雌激素无标记免疫传感器的制备方法，所制备的传感器具有灵敏度高、特异性强的特点，且制备简单、操作方便，可用于环境雌激素的快速、灵敏检测；
本发明的目的之二在于将所制备的无标记免疫传感器应用到环境雌激素的检测中，实现对多种环境雌激素的快速、灵敏检测。
[0007]本发明采用的技术方案如下:
1.一种环境雌激素无标记免疫传感器的制备方法，所述环境雌激素无标记免疫传感器包括:工作电极、参比电极和对电极，所述工作电极的基底电极为玻碳电极，其表面依次修饰CoFe204/rGo、戊二醛、Au@PdNRs_Ab、牛血清蛋白(BSA)，所述参比电极为饱和甘汞电极，所述对电极为钼丝电极，所述C0Fe2CVrG0为铁酸钴/还原石墨烯复合材料，所述AuOPtNRs-Ab为金@钯核壳纳米棒复合材料孵化的环境雌激素抗体；
其特征在于，所述制备方法包括以下步骤:
a、制备CoFe204/rGo ；
b、制备AuOPdNRs-Ab ；
C、制备环境雌激素无标记免疫传感器工作电极；
其中，步骤a制备CoFe204/rGo的具体步骤如下:
将8?12 mg氧化石墨烯超声分散到25?35 ml无水乙醇中，依次加入0.5?1.5 ml 0.2mol/mL 的 Fe (NO3) 3水溶液、0.25?0.75 ml of 0.2 mol/L Co (NO3) 2 水溶液和 2.0?3.0 ml 氨水，80°C下搅拌l(Tl4h，然后转移至高压反应釜中，180°C下反应4?6h ;冷却至室温后，离心分离，于50°C真空干燥箱中烘干，即得C0Fe2CVrG0 ；
步骤b制备AuOPdNRs-Ab的具体步骤如下:
将20mL金纳米棒溶液和20mL 0.05、.2 mol/L的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液混合，在3(T45°C下搅拌，并顺序加入3飞mL 0.1 mol/L的L-抗坏血酸(AA)溶液、0.5?ImL 0.03 mol/L的氯化钯(PdCl2)溶液和3?6 mL 0.1 mol/L的氢氧化钠(NaOH)溶液，停止搅拌，静置f 3h，离心分离，加入20mL pH7.4的PBS缓冲溶液，然后再加入环境雌激素抗体(Ab)，在 4°C下震荡 24h，得到 AuOPdNRs-Ab ；
步骤c制备环境雌激素无标记免疫传感器工作电极的具体步骤如下:
①对工作电极进行预处理，使其表面光洁；
②在①中得到的电极表面滴加5?10μ? Γ5 mg/mL的CoFe204/rGo水溶液，室温下自然晾干；
③在②中得到的电极表面滴加5?10PL的戊二醛，室温下自然晾干；
④在③中得到的电极表面滴加5?8μ? 10 Pg/mL的AuOPdNRs-Ab溶液，4 V冰箱中保存晾干，超纯水清洗，晾干成膜，4 °C保存；
⑤在④中得到的电极表面滴加4飞μ?100 Pg/mL的BSA溶液，用以封闭电极上的非特异性活性位点，4 V冰箱中保存晾干，超纯水清洗，晾干成膜，即得到环境雌激素无标记免疫传感器的工作电极。
[0008]2.本发明所述的环境雌激素无标记免疫传感器，用于环境雌激素的检测，步骤如下:
I)将已知浓度的环境雌激素抗原标准溶液加入到4(Γ60 μ?、ρΗ=7.(Γ8.0的PBS缓冲溶液中，制得抗原混合溶液，取5?10 PL抗原混合溶液滴涂到所制备的环境雌激素免疫传感器的工作电极上，在4 V冰箱中保存晾干，ρΗ=7.(Γ8.0的PBS缓冲溶液清洗后，晾干，4 V保存；
2)将作为参比电极得甘汞电极、作为对电极得钼丝电极，与I)中组装的工作电极组成三电极系统，连接到电化学工作站上；在电解槽中先后加入l(T25mL ρΗ=7.(Γ8.0的PBS缓冲溶液和ImL 3飞mmol/L的过氧化氢(H2O2)溶液；通过计时电流法检测组装的工作电极对H2O2的响应；根据所得的电流响应与环境雌激素抗原标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；
3)将待测样品溶液代替环境雌激素抗原的标准溶液，按照所述环境雌激素抗原的工作曲线的绘制方法进行检测。
[0009]3.本发明所述的环境雌激素无标记免疫传感器的制备方法和应用，其特征在于所述环境雌激素选自下列之一:雌二醇、雌三醇、己烯雌酚、双酚A或壬基酚。
[0010]本发明的有益成果
(I)本发明所述的环境雌激素无标记免疫传感器制备简单，操作方便，实现了对多种环境雌激素的快速、灵敏、高选择性检测，具有市场发展前景。
[0011](2)本发明首次采用C0Fe2CVrG0和AuOPdNRs-Ab共同修饰电极，并利用二者的协同催化效应，显著提高电流相应速度和大小，进一步增强了抗体的吸附量，从而构建了无标记的电化学免疫传感器，具有重要的科学意义和应用价值。
【具体实施方式】
[0012]实施例1 CoFe204/rGo的制备
将8 mg氧化石墨烯超声分散到25 ml无水乙醇中，依次加入0.5 ml 0.2 mol/mL的Fe (NO3)3 水溶液、0.25 ml of 0.2 mol/L Co (NO3) 2 水溶液和 2.0 ml 氨水，80°C下搅拌 10h，然后转移至高压反应釜中，180°C下反应4h ;冷却至室温后，离心分离，于50°C真空干燥箱中烘干，即得CoFe204/rGo。
[0013]实施例2 CoFe204/rGo的制备
将10 mg氧化石墨烯超声分散到30 ml无水乙醇中，依次加入I ml 0.2 mol/mL的Fe (NO3)3 水溶液、0.5 ml of 0.2 M Co (NO3) 2 水溶液和 2.50 ml 氨水，80°C下搅拌 12h，然后转移至高压反应釜中，180°C下反应5h ;冷却至室温后，离心分离，于50°C真空干燥箱中烘干，即得 CoFe2O4Mo。
[0014]实施例3 CoFe204/rGo的制备
将12 mg氧化石墨烯超声分散到35 ml无水乙醇中，依次加入1.5 ml 0.2 mol/mL的Fe (NO3)3 水溶液、0.75 ml of 0.2 mol/L Co (NO3) 2 水溶液和 3.0 ml 氨水，80°C下搅拌 14h，然后转移至高压反应釜中，180°C下反应6h ;冷却至室温后，离心分离，于50°C真空干燥箱中烘干，即得CoFe204/rGo。
[0015]实施例4 AuiPdNRs-Ab的制备
将20mL金纳米棒溶液和20mL 0.05 mol/L的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液混合，在30°C下搅拌，并顺序加入3 mL 0.1 mol/L的L-抗坏血酸(AA)溶液、0.5 mL 0.03 mol/L的氯化钯(PdCl2)溶液和3 mL 0.1 mol/L的氢氧化钠(NaOH)溶液，停止搅拌，静置lh，离心分离，加入20mL pH7.4的PBS缓冲溶液，然后再加入环境雌激素抗体(Ab)，在4°C下震荡 24h，得到 AuOPdNRs-Ab。
[0016]实施例5 AuiPdNRs-Ab的制备
将20mL金纳米棒溶液和20mL 0.1 mol/L的CTAB溶液混合，在35°C下搅拌，并顺序加入 4 mL 0.1 mol/L 的 AA 溶液、0.8 mL 0.03 mol/L 的 PdCl2 溶液和 4 mL 0.1 mol/L 的NaOH溶液，停止搅拌，静置2h，离心分离，加入20mL pH7.4的PBS缓冲溶液，然后再加入环境雌激素抗体(Ab)，在4°C下震荡24h，得到Au@PdNRs-Ab。
[0017]实施例6 AuiPdNRs-Ab的制备
将20mL金纳米棒溶液和20mL 0.2 mol/L的CTAB溶液混合，在45°C下搅拌，并顺序加入 6 mL 0.1 mol/L 的 AA 溶液、I mL 0.03 mol/L 的 PdCl2 溶液和 6 mL 0.1 mol/L 的 NaOH溶液，停止搅拌，静置3h，离心分离，加入20mL pH7.4的PBS缓冲溶液，然后再加入环境雌激素抗体(Ab)，在4°C下震荡24h，得到Au@PdNRs-Ab。
[0018]实施例7环境雌激素无标记免疫传感器工作电极的制备方法
(1)对工作电极进行预处理，使其表面光洁；
(2)在(I)中得到的电极表面滴加5μ? I mg/mL的CoFe204/rGo水溶液，室温下自然晾干;
(3)在(2)中得到的电极表面滴加5μ?的戊二醛，室温下自然晾干；
(4)在(3)中得到的电极表面滴加5μ? 10 Pg/mL的AuOPdNRs-Ab溶液，4 V冰箱中保存晾干，超纯水清洗，晾干成膜，4 °C保存；
(5)在(4)中得到的电极表面滴加4μ? 100 Pg/mL的BSA溶液，用以封闭电极上的非特异性活性位点，4 V冰箱中保存晾干，超纯水清洗，晾干成膜，即得到环境雌激素无标记免疫传感器的工作电极。
[0019]实施例8环境雌激素无标记免疫传感器工作电极的制备方法
(1)对工作电极进行预处理，使其表面光洁；
(2)在(I)中得到的电极表面滴加8μ? 3 mg/mL的CoFe204/rGo水溶液，室温下自然晾干;
(3)在(2)中得到的电极表面滴加8μ?的戊二醛，室温下自然晾干；
(4)在(3)中得到的电极表面滴加6μ? 10 Pg/mL的AuOPdNRs-Ab溶液，4 V冰箱中保存晾干，超纯水清洗，晾干成膜，4 °C保存；
(5)在(4)中得到的电极表面滴加5μ? 100 Pg/mL的BSA溶液，用以封闭电极上的非特异性活性位点，4 V冰箱中保存晾干，超纯水清洗，晾干成膜，即得到环境雌激素无标记免疫传感器的工作电极。
[0020]实施例9环境雌激素无标记免疫传感器工作电极的制备方法
(1)对工作电极进行预处理，使其表面光洁；
(2)在(I)中得到的电极表面滴加10μ? 5 mg/mL的CoFe204/rGo水溶液，室温下自然晾干；
(3)在(2)中得到的电极表面滴加10μ?的戊二醛，室温下自然晾干；
(4)在(3)中得到的电极表面滴加8μ? 10 Pg/mL的AuOPdNRs-Ab溶液，4 V冰箱中保存晾干，超纯水清洗，晾干成膜，4 °C保存；
(5)在(4)中得到的电极表面滴加6μ? 100 Pg/mL的BSA溶液，用以封闭电极上的非特异性活性位点，4 V冰箱中保存晾干，超纯水清洗，晾干成膜，即得到环境雌激素无标记免疫传感器的工作电极。
[0021]实施例10实施例1、制备的环境雌激素无标记免疫传感器，用于环境雌激素的检测，步骤如下
(1)将已知浓度的环境雌激素抗原标准溶液加入到40μ?、ρΗ=7.0的PBS缓冲溶液中，制得抗原混合溶液，取5 PL抗原混合溶液滴涂到所制备的环境雌激素免疫传感器的工作电极上，在4 V冰箱中保存晾干，ρΗ=7.0的PBS缓冲溶液清洗后，晾干，4 °C保存；
(2)将作为参比电极得甘汞电极、作为对电极得钼丝电极，与(I)中组装的工作电极组成三电极系统，连接到电化学工作站上；在电解槽中先后加入1mL pH=7.0的PBS缓冲溶液和ImL 3 mmol/L的H2O2溶液；通过计时电流法检测组装的工作电极对H2O2的响应；根据所得的电流响应与环境雌激素抗原标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；
(3)将待测样品溶液代替环境雌激素抗原的标准溶液，按照所述环境雌激素抗原的工作曲线的绘制方法进行检测。
[0022]实施例11实施例1、制备的环境雌激素无标记免疫传感器，用于环境雌激素的检测，步骤如下
(1)将已知浓度的环境雌激素抗原标准溶液加入到50μ?、ρΗ=7.4的PBS缓冲溶液中，制得抗原混合溶液，取7 PL抗原混合溶液滴涂到所制备的环境雌激素免疫传感器的工作电极上，在4 V冰箱中保存晾干，ρΗ=7.4的PBS缓冲溶液清洗后，晾干，4 °C保存；
(2)将作为参比电极得甘汞电极、作为对电极得钼丝电极，与(I)中组装的工作电极组成三电极系统，连接到电化学工作站上；在电解槽中先后加入20mL pH=7.4的PBS缓冲溶液和ImL 4 mmol/L的H2O2溶液；通过计时电流法检测组装的工作电极对H2O2的响应；根据所得的电流响应与环境雌激素抗原标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；
(3)将待测样品溶液代替环境雌激素抗原的标准溶液，按照所述环境雌激素抗原的工作曲线的绘制方法进行检测。
[0023]实施例12实施例1、制备的环境雌激素无标记免疫传感器，用于环境雌激素的检测，步骤如下
(1)将已知浓度的环境雌激素抗原标准溶液加入到60μ?、ρΗ=8.0的PBS缓冲溶液中，制得抗原混合溶液，取10 PL抗原混合溶液滴涂到所制备的环境雌激素免疫传感器的工作电极上，在4 V冰箱中保存晾干，ρΗ=8.0的PBS缓冲溶液清洗后，晾干，4 °C保存；
(2)将作为参比电极得甘汞电极、作为对电极得钼丝电极，与(I)中组装的工作电极组成三电极系统，连接到电化学工作站上；在电解槽中先后加入25mL pH=8.0的PBS缓冲溶液和ImL 6 mmol/L的H2O2溶液；通过计时电流法检测组装的工作电极对H2O2的响应；根据所得的电流响应与环境雌激素抗原标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；
(3)将待测样品溶液代替环境雌激素抗原的标准溶液，按照所述环境雌激素抗原的工作曲线的绘制方法进行检测。
[0024]实施例13环境雌激素:雌二醇、雌三醇、己烯雌酚、双酚A或壬基酚的检测，包括以下步骤
(1)选择一种环境雌激素，按照实施例1、所述的步骤构建环境雌激素无标记免疫传感器；
(2)按照实施例1(Γ12所述的步骤进行检测，环境雌激素的检测技术指标见表I。
[0025]表I环境雌激素的检测技术指标
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实施例14牛奶中环境雌激素的检测
准确移取牛奶样品，加入一定质量浓度的环境雌激素抗原标准溶液，以未加入环境雌激素抗原的牛奶为空白，进行加标回收实验，按照实施例13的步骤进行检测，测定牛奶样品中环境雌激素的回收率，检测结果见表2。
[0026]表2牛奶中多种环境雌激素的检测结果.......................................................1.....................................................汴 ?.δ.Α?#:.............Si1.....................1si>%.....................Hie!...........^.0gaH1n-5%
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表2检测结果可知，结果的相对标准偏差(RSD)小于3.0 %，平均回收率为96.0?102%，表明本发明可用于牛奶中多种环境雌激素的检测，方法的灵敏度高、特异性强，结果准确可靠。
[0027]实施例15水样中环境雌激素的检测
准确移取一定水样，加入一定质量浓度的环境雌激素抗原标准溶液，以未加入环境雌激素抗原的水样为空白，进行加标回收实验，按照实施例13的步骤进行检测，测定水样中环境雌激素的回收率，检测结果见表3。
[0028]表3水样中多种环境雌激素的检测结果
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表3检测结果可知，结果的相对标准偏差(RSD)小于3.3 %，平均回收率为97.2?102%，表明本发明可用于水样中多种环境雌激素的检测，方法的灵敏度高、特异性强，结果准确可靠。
【权利要求】
1.一种环境雌激素无标记免疫传感器的制备方法，所述环境雌激素无标记免疫传感器包括:工作电极、参比电极和对电极，所述工作电极的基底电极为玻碳电极，其表面依次修饰CoFe204/rGo、戊二醛、AuOPdNRs-Ab、牛血清蛋白(BSA)，所述参比电极为饱和甘汞电极，所述对电极为钼丝电极，所述C0Fe2CVrG0为铁酸钴/还原石墨烯复合材料，所述AuOPtNRs-Ab为金@钯核壳纳米棒复合材料孵化的环境雌激素抗体； 其特征在于，所述制备方法包括以下步骤:
a、制备CoFe204/rGo ；
b、制备AuOPdNRs-Ab ； C、制备环境雌激素无标记免疫传感器工作电极； 其中，步骤a制备CoFe204/rGo的具体步骤如下: 将8?12 mg氧化石墨烯超声分散到25?35 ml无水乙醇中，依次加入0.5?1.5 ml 0.2mol/mL 的 Fe (NO3) 3水溶液、0.25?0.75 ml of 0.2 mol/L Co (NO3) 2 水溶液和 2.0?3.0 ml 氨水，80°C下搅拌l(Tl4h，然后转移至高压反应釜中，180°C下反应4?6h ;冷却至室温后，离心分离，于50°C真空干燥箱中烘干，即得C0Fe2CVrG0 ； 步骤b制备AuOPdNRs-Ab的具体步骤如下: 将20mL金纳米棒溶液和20mL 0.05、.2 mol/L的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液混合，在3(T45°C下搅拌，并顺序加入3飞mL 0.1 mol/L的L-抗坏血酸(AA)溶液、0.5?ImL 0.03 mol/L的氯化钯(PdCl2)溶液和3?6 mL 0.1 mol/L的氢氧化钠(NaOH)溶液，停止搅拌，静置f 3h，离心分离，加入20mL pH7.4的PBS缓冲溶液，然后再加入环境雌激素抗体(Ab)，在 4°C下震荡 24h，得到 AuOPdNRs-Ab ； 步骤c制备环境雌激素无标记免疫传感器工作电极的具体步骤如下: ①对工作电极进行预处理，使其表面光洁； ②在①中得到的电极表面滴加5?10μ? Γ5 mg/mL的CoFe204/rGo水溶液，室温下自然晾干； ③在②中得到的电极表面滴加5?10PL的戊二醛，室温下自然晾干； ④在③中得到的电极表面滴加5?8μ? 10 Pg/mL的AuOPdNRs-Ab溶液，4 V冰箱中保存晾干，超纯水清洗，晾干成膜，4 °C保存； ⑤在④中得到的电极表面滴加4飞μ?100 Pg/mL的BSA溶液，用以封闭电极上的非特异性活性位点，4 V冰箱中保存晾干，超纯水清洗，晾干成膜，即得到环境雌激素无标记免疫传感器的工作电极。
2.如权利要求1所述的环境雌激素无标记免疫传感器，用于环境雌激素的检测，步骤如下: 1)将已知浓度的环境雌激素抗原标准溶液加入到4(Γ60μ?、ρΗ=7.(Γ8.0的PBS缓冲溶液中，制得抗原混合溶液，取5?10 PL抗原混合溶液滴涂到所制备的环境雌激素免疫传感器的工作电极上，在4 V冰箱中保存晾干，ρΗ=7.(Γ8.0的PBS缓冲溶液清洗后，晾干，4 V保存； 2)将作为参比电极得甘汞电极、作为对电极得钼丝电极，与I)中组装的工作电极组成三电极系统，连接到电化学工作站上；在电解槽中先后加入l(T25mL ρΗ=7.(Γ8.0的PBS缓冲溶液和ImL 3飞mmol/L的过氧化氢(H2O2)溶液；通过计时电流法检测组装的工作电极对H2O2的响应；根据所得的电流响应与环境雌激素抗原标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线； 3)将待测样品溶液代替环境雌激素抗原的标准溶液，按照所述环境雌激素抗原的工作曲线的绘制方法进行检测。
3.如权利要求1和2所述的环境雌激素无标记免疫传感器的制备方法和应用，其特征在于所述环境雌激素选自下列之一:雌二醇、雌三醇、己烯雌酚、双酚A或壬基酚。
【文档编号】G01N27/327GK104133070SQ201410338509
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年7月17日 优先权日:2014年7月17日
【发明者】张勇, 郭占魁, 魏琴, 吴丹, 李燕 申请人:济南大学