一种双功能标记物构建的免疫传感器的制备方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种双功能标记物构建的免疫传感器的制备方法及其应用，属于新型纳米功能材料与生物传感器【技术领域】。其特征在于：（1）铜掺杂二氧化钛Cu@TiO2的制备；（2）双功能标记物-二抗孵化物Cu@TiO2-Ab2的制备；（3）双功能标记物构建的免疫传感器的制备及分析应用。本发明双功能标记物构建的免疫传感器优点在于识别快速、灵敏度高、检测限低、成本低、便于操作，能实现多种肿瘤标志物的高灵敏、特异性、快速准确检测。
【专利说明】一种双功能标记物构建的免疫传感器的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于功能化纳米材料、免疫分析及生物传感【技术领域】，具体涉及一种双功能标记物构建的免疫传感器的制备方法及其应用。
【背景技术】
[0002]自上世纪80年代，电化学传感器的研究与开发呈现出突飞猛进的局面。近年来，随着纳米材料科学和微电子技术的快速发展，纳米技术、生命科学、生物技术、电分析技术和表面科学等领域的交叉融合，各种新原理、新材料和新工艺的广泛采用，电化学传感器不断涌现并进入实际应用。
[0003]免疫传感器是将免疫学方法和分析化学相结合的生物传感器，通过抗原与抗体的特异性结合，使得它具有灵敏度高、选择性好、快速及操作简便等优点。
[0004]标记物是电化学免疫传感器的重要结构组成部分。由于免疫反应中的抗原抗体本身不具有氧化还原特性，因此不能在电化学检测中产生信号实现定量和定性分析。研制性能优异的标记物，用以标记抗原或抗体，成为实现高灵敏检测的关键所在。
[0005]纳米材料在光电方面的特殊性质，使其被广泛用于传感器件的制作。某些纳米材料具有大的比表面积，常被用作载体来固定抗原或抗体。其中，自身具有良好氧化还原能力的材料，可以用来作为电化学反应的信号源；而具有催化能力的材料，可以用其催化过氧化氢实现间接定量。因此在制备标记物的过程中利用纳米材料的特性能够达到良好的效果。
[0006]石墨烯具有比表面积大，催化性能好，能高效吸附固载生物分子及增强电子传递等优点。二氧化钛(TiO2)纳米材料具有不同的形貌和晶型结构，在光催化、传感器、电池及其他领域具有广泛的应用。它具有比表面积大、成本低廉、生物相容性好、制备简单等优点，能够稳定的固载抗体。已有研究结果显示金属离子掺杂的二氧化钛在光催化降解环境污染物方面具有良好的效果，而在传感器的制备中还未曾出现过。
[0007]本发明利用石墨烯增强电极的电子传递能力并将铜掺杂二氧化钛作为一种新型标记物，提供了一种双功能标记物构建的免疫传感器的制备方法，实现了在两种电化学检测技术下对一种分析物的灵敏分析。
【发明内容】
[0008]本发明的目的之一是提供一种双功能标记物的制备方法。
[0009]本发明的目的之二是将所制备的双功能标记物应用于免疫传感器的制备。
[0010]本发明的目的之三是利用所制备的免疫传感器，通过两种电化学技术对分析物进行检测。
[0011]本发明的技术方案，包括以下步骤。
[0012]1.一种双功能标记物-二抗孵化物的制备方法，包括以下步骤:
(I)二氧化钛纳米材料的制备
将2 mL钛酸丁酯加入4(T50 mL乙二醇中，室温搅拌6?8 h制成混合物，将该混合物加入150~170 mL的丙酮中，加2~3 mL水，剧烈搅拌广2 h，离心分离，用乙醇清洗2~4次，50°C干燥，制得二氧化钛前驱体；将0.1 g 二氧化钛前驱体分散到20 mL水中，搅拌条件下加热回流广2 h;再经过离心分离，乙醇清洗2~4次，50°C干燥，制得二氧化钛纳米材料，备用。
[0013](2)铜掺杂二氧化钛CuOTiO2的制备
将I g 二氧化钛纳米材料加到40 mL、10 mo 1.L-1的NaOH溶液中，搅拌2~3 h，装入聚四氟乙烯的反应釜中，12(Tl40°C加热18~24 h，取出并冷却至室温，用8~12mL、0.1 mo l.L-1HCl溶液搅拌处理，超纯水洗涤至中性，60°C下干燥，得到处理过的二氧化钛纳米材料；
将乙二胺(en)和Cu (OH) 2以化学计量比2:1的比例混合制得Cu (en) 2 (OH) 2溶液，将0.8g上述处理过的二氧化钛纳米材料加到50 mL制得的Cu(en)2(0H)2溶液中，搅拌1~2 h,得到蓝色物质，离心分离，用水清洗数次后，在40(T500°C下煅烧得到黄色粉末铜掺杂二氧化钛 CuiTiO20
[0014](3)双功能标记物的制备 将0.25 g Cu@Ti02、0.5 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷、80 mL甲苯，在氮气保护下，120°C搅拌回流4飞h，用甲苯和超纯水各清洗2~4次，5(T60°C下干燥，制得氨基功能化铜掺杂二氧化钛CuOTiO2,即双功能标记物；
所述的双功能标记物，其功能一是利用二氧化钛上的铜离子发生氧化还原反应产生的信号用方波伏安法对分析物进行检测；二是利用二氧化钛上的铜离子对催化H2O2产生的信号，采用计时电流法对分析物进行检测。
[0015](4)双功能标记物-二抗孵化物CuOTiO2-Ab2的制备
将I mg双功能标记物和0.5 mL、质量分数为2.5%的戊二醛混合，振荡f 2 h，离心，倾倒上层溶液，加入0.4~0.6 mL、ρΗ7.0~7.8的PBS溶液，超声使其分散均匀；加入3~5 μL分析物的二抗Ab2，振荡10~12 h后离心分离，用pH 7.0-7.8的PBS溶液定容至I mL，制得双功能标记物-二抗孵化物CuOTiO2-Ab2,置于4°C冰箱中备用。
[0016]2.一种双功能标记物构建的免疫传感器的制备方法，包括如下步骤:
(1)将:3~5μ LU.5^2.5 mg.mr1超声处理分散均匀的石墨烯，滴涂在玻碳工作电极表面，自然晾干；
(2)分别将:3~5μL的8~12.mL-1分析物的一抗(Ab1)滴涂在(I)中得到的工作电极表面，4°C冰箱中干燥；
(3)滴涂2~4μL、80-?20 Pg 的牛血清白蛋白于(2)中得到的工作电极表面，置于4°C冰箱中直至干燥，超纯水清洗后，置于4°C冰箱中晾干；
(4)取3~5μL上述制备的双功能标记物-二抗孵化物CuOTiO2-Ab2,滴涂于电极表面上，置于4 °C冰箱中晾干，制得一种双功能标记物构建的免疫传感器。
[0017]上述制备方法制备的免疫传感器，用于分析物的检测，包括如下步骤:
(I)用方波伏安法对分析物进行检测
1)使用电化学工作站对三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，钼丝电极为辅助电极，所制备的免疫传感器为工作电极，在10 mL、pH 4.0-6.0的PBS缓冲溶液中进行测试;
2)扫描电压范围从-0.4~0.4 V，电势阶跃为5 mV,频率25 Hz，振幅25 mV ；
3)二氧化钛上的铜离子发生氧化还原反应在0.0 V附近产生信号，根据所得电流强度与分析物浓度之间的线性关系，绘制工作曲线；
(2)用计时电流法对分析物进行检测
1)使用电化学工作站对三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，钼丝电极为辅助电极，所制备的免疫传感器为工作电极，在10 mL、pH 4.0~6.0的PBS缓冲溶液中进行测试;
2)在0.0--0.5 V的检测电压下，每隔40秒加入10 μL 5.0 mmol.L-1 H2O2，记录电流变化；
3)二氧化钛上的铜离子对H2O2具有催化作用，能将H2O2催化转变为H2O,同时产生电流变化，根据所得电流强度与分析物浓度之间的线性关系，绘制工作曲线；
4.上述所述分析物选自以下之一:癌胚抗原(CEA)，甲胎蛋白(AFP)，免疫球蛋白E(IgE)，免疫球蛋白G (IgG), α-L-岩藻糖苷酶(AFU)，前列腺特异性抗原(PSA)，CA15-3，CA125，CA 19-9, CA724，CA242，人绒毛膜促性腺激素(HCG)，乳腺癌易感基因(BRCA1 )，鳞状细胞癌抗原(SCC)、细胞角蛋白19片断(Cyfra21-1)，组织多肽抗原(TPA)，神经元特异性烯醇化酶(NSE)。
[0018]本发明的有益成果
(1)制备CuOTiO2标记抗体的孵化物，铜掺杂二氧化钛作为一种新型标记物，利用二氧化钛大的比表面积和良好的生物相容性可以负载更多的抗体，增大了传感器电流响应；
(2)使用了CuOTiO2制备标记物，可用两种电化学方法检测。二氧化钛上掺杂的铜离子可以通过自身氧化还原反应，在方波伏安法下产生电信号实现检测，另外铜离子可以催化过氧化氢产生信号，用计时电流法记录下信号改变，以此实现两种方法的检测。
[0019](3)线性范围与检测限。
【具体实施方式】
[0020]实施例1
1.一种双功能标记物-二抗孵化物的制备方法，包括以下步骤:
(1)二氧化钛纳米材料的制备
将2 mL钛酸丁酯加入40 mL乙二醇中，室温搅拌6 h制成混合物，将该混合物加入150mL的丙酮中，加2 mL水，剧烈搅拌I h，离心分离，用乙醇清洗2次，50°C干燥，制得二氧化钛前驱体；将0.1 g 二氧化钛前驱体分散到20 mL水中，搅拌条件下加热回流I h ;再经过离心分离，乙醇清洗2次，50°C干燥，制得二氧化钛纳米材料，备用；
(2)铜掺杂二氧化钛CuOTiO2的制备
将I g 二氧化钛纳米材料加到40 mL、10 molL-1的NaOH溶液中，搅拌2 h，装入聚四氟乙烯的反应釜中，120°C加热18 h，取出、冷却至室温，用8 mL、0.1 mo I.L-1 HCl溶液搅拌处理，超纯水洗涤至中性，60°C下干燥，得到处理过的二氧化钛纳米材料；
将乙二胺(en)和Cu (OH) 2以化学计量比2:1的比例混合制得Cu (en) 2 (OH) 2溶液，将0.8g上述处理过的二氧化钛纳米材料加到50 mL制得的Cu (en) 2 (OH) 2溶液中,搅拌I h,得到蓝色物质，离心分离，用水清洗数次后，在400°C下煅烧得到黄色粉末铜掺杂二氧化钛CuOTiO2;
(3)双功能标记物的制备将0.25 g Cu@Ti02、0.5 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷、80 mL甲苯，在氮气保护下，120°C搅拌回流4 h，用甲苯和超纯水各清洗2次，50°C下干燥，制得氨基功能化铜掺杂二氧化钛CuiTiO2,即双功能标记物；
所述的双功能标记物，其功能一是利用二氧化钛上的铜离子发生氧化还原反应产生的信号用方波伏安法对分析物进行检测；二是利用二氧化钛上的铜离子对催化H2O2产生的信号，采用计时电流法对分析物进行检测；
实施例2
1.一种双功能标记物-二抗孵化物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:
(1)二氧化钛纳米材料的制备
将2 mL钛酸丁酯加入50 mL乙二醇中，室温搅拌8 h制成混合物，将混合物加入170mL的丙酮中，加3 mL水，剧烈搅拌2 h，离心分离，用乙醇清洗4次，50°C干燥，制得二氧化钛前驱体；将0.1 g 二氧化钛前驱体分散到20 mL水中，搅拌条件下加热回流2 h ;再经过离心分离，乙醇清洗4次，50°C干燥，制得二氧化钛纳米材料，备用；
(2)铜掺杂二氧化钛CuOTiO2的制备
将I g 二氧化钛纳米材料加到40 mLUO mo IL-1的NaOH溶液中，搅拌3 h，装入聚四氟乙烯的反应釜中，140°C加热24 h，取出、冷却至室温，用12 mL、0.1 mo I.L—1 HCl溶液搅拌处理，超纯水洗涤至中性，60°C下干燥，得到处理过的二氧化钛纳米材料；
将乙二胺(en)和Cu (OH) 2以化学计量比2:1的比例混合制得Cu (en) 2 (OH) 2溶液，将0.8g上述处理过的二氧化钛纳米材料加到50 mL制得的Cu (en) 2 (OH) 2溶液中，搅拌2 h,得到蓝色物质，离心分离，用水清洗数次后，在500°C下煅烧得到黄色粉末铜掺杂二氧化钛CuOTiO2;
(3)双功能标记物的制备
将0.25 g Cu@Ti02、0.5 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷、80 mL甲苯，在氮气保护下，120°C搅拌回流6 h，用甲苯和超纯水各清洗4次，60°C下干燥，制得氨基功能化铜掺杂二氧化钛CuiTiO2,即双功能标记物；
所述的双功能标记物，其功能一是利用二氧化钛上的铜离子发生氧化还原反应产生的信号用方波伏安法对分析物进行检测；二是利用二氧化钛上的铜离子对催化H2O2产生的信号，采用计时电流法对分析物进行检测；
实施例3
1.一种双功能标记物-二抗孵化物的制备方法，包括以下步骤:
(1)二氧化钛纳米材料的制备
将2 mL钛酸丁酯加入45 mL乙二醇中，室温搅拌7 h成为混合物，将混合物加入160mL的丙酮中，加2.5 mL水，剧烈搅拌1.5 h，离心分离，用乙醇清洗3次，50°C干燥，制得二氧化钛前驱体；将0.1 g 二氧化钛前驱体分散到20 mL水中，搅拌条件下加热回流1.5 h ;再经过离心分离，乙醇清洗3次，50°C干燥，制得二氧化钛纳米材料，备用；
(2)铜掺杂二氧化钛CuOTiO2的制备
将I g 二氧化钛纳米材料加到40 mLUO mo I.L—1的NaOH溶液中，搅拌2.5 h，装入聚四氟乙烯的反应釜中，130°C加热20 h，取出、冷却至室温，用10 mL、0.1 mo I.L—1 HCl溶液搅拌处理，超纯水洗涤至中性，60°C下干燥，得到处理过的二氧化钛纳米材料；将乙二胺(en)和Cu (OH) 2以化学计量比2:1的比例混合制得Cu (en) 2 (OH) 2溶液，将0.8g上述处理过的二氧化钛纳米材料加到50 mL制得的Cu (en)2 (OH)2溶液中，搅拌Ih,得到蓝色物质，离心分离，用水清洗数次后，在450°C下煅烧得到黄色粉末铜掺杂二氧化钛CuOTiO2;
(3)双功能标记物的制备
将0.25 g Cu@Ti02、0.5 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷、80 mL甲苯，在氮气保护下，120°C搅拌回流5 h，用甲苯和超纯水各清洗3次，55°C下干燥，制得氨基功能化铜掺杂二氧化钛CuiTiO2,即双功能标记物；
所述的双功能标记物，其功能一是利用二氧化钛上的铜离子发生氧化还原反应产生的信号用方波伏安法对分析物进行检测；二是利用二氧化钛上的铜离子对催化H2O2产生的信号，采用计时电流法对分析物进行检测；
实施例4
双功能标记物-二抗孵化物CuOTiO2-Ab2的制备
将I mg双功能标记物和0.5 mL、质量分数为2.5%的戊二醛混合，振荡I h，离心，倾倒上层溶液，加入0.4 mL、pH7.0的PBS溶液，超声使其分散均匀；加入3 μL分析物的二抗Ab2,振荡10 h后离心分离，用pH 7.0的PBS溶液定容至I mL，制得双功能标记物-二抗孵化物CuOTiO2-Ab2,置于4 °C冰箱中备用。
[0021]实施例5
双功能标记物-二抗孵化物CuOTiO2-Ab2的制备
将I mg双功能标记物和0.5 mL、质量分数为2.5%的戊二醛混合，振荡2 h,离心，倾倒上层溶液，加入0.6 mL、pH7.8的PBS溶液，超声使其分散均匀；加入5 μL分析物的二抗Ab2,振荡12 h后离心分离，用pH 7.8的PBS溶液定容至I mL，制得双功能标记物-二抗孵化物CuOTiO2-Ab2,置于4 °C冰箱中备用。
[0022]实施例6
双功能标记物-二抗孵化物CuOTiO2-Ab2的制备
将I mg双功能标记物和0.5 mL、质量分数为2.5%的戊二醛混合，振荡1.5 h，离心，倾倒上层溶液，加入0.5 mL、pH7.5的PBS溶液，超声使其分散均匀；加入4 μL分析物的二抗Ab2,振荡11 h后离心分离，用pH 7.5的PBS溶液定容至I mL，制得双功能标记物-二抗孵化物CuOTiO2-Ab2,置于4 °C冰箱中备用。
[0023]实施例7
一种双功能标记物构建的免疫传感器的制备方法
(1)将3μ L、l.5 mg.ml/1超声处理分散均匀的石墨烯,滴涂在玻碳工作电极表面，自然晾干；
(2)分别将3PL的8.mL-1分析物的一抗Ab1滴涂在(I)中得到的工作电极表面，4°C冰箱中干燥；
(3)滴涂2μL、80的牛血清白蛋白于(2)中得到的工作电极表面，置于4°C冰箱中直至干燥，超纯水清洗后，置于4°C冰箱中晾干；
(4)取3μL上述制备的双功能标记物-二抗孵化物CuOTiO2-Ab2,滴涂于电极表面上，置于4 °C冰箱中晾干，制得一种双功能标记物构建的免疫传感器。[0024]实施例8
一种双功能标记物构建的免疫传感器的制备方法
(1)将5μ L、2.5 mg.ml/1超声处理分散均匀的石墨烯,滴涂在玻碳工作电极表面，自然晾干；
(2)分别将5PL的12分析物的一抗Ab1滴涂在(I)中得到的工作电极表面，4°C冰箱中干燥；
(3)滴涂4μL、120 Pg.mL—1的牛血清白蛋白于(2)中得到的工作电极表面，置于4°C冰箱中直至干燥，超纯水清洗后，置于4°C冰箱中晾干；
(4)取5μL上述制备的双功能标记物-二抗孵化物CuOTiO2-Ab2,滴涂于电极表面上，置于4 °C冰箱中晾干，制得一种双功能标记物构建的免疫传感器。
[0025]实施例9
一种双功能标记物构建的免疫传感器的制备方法
(1)将4μ L>2.0 mg.ml/1超声处理分散均匀的石墨烯,滴涂在玻碳工作电极表面，自然晾干；
(2)分别将4PL 的10分析物的一抗Ab1滴涂在(I)中得到的工作电极表面，4°C冰箱中干燥；
(3)滴涂3μL,ΙΟΟ Pg.ml/1的牛血清白蛋白于(2)中得到的工作电极表面，置于4°C冰箱中直至干燥，超纯水清洗后，置于4°C冰箱中晾干；
(4)取4μL上述制备的双功能标记物-二抗孵化物CuOTiO2-Ab2,滴涂于电极表面上，置于4 °C冰箱中晾干，制得一种双功能标记物构建的免疫传感器。
[0026]实施例10
用方波伏安法对分析物进行检测
(1)使用电化学工作站对三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，钼丝电极为辅助电极，所制备的免疫传感器为工作电极，在10 mL、pH 4.0-6.0的PBS缓冲溶液中进行测试;
(2)扫描电压范围从-0.4^0.4 V，电势阶跃为5 mV,频率25 Hz，振幅25 mV ；
(3)二氧化钛上的铜离子发生氧化还原反应在0.0 V附近产生信号，根据所得电流强度与分析物浓度之间的线性关系，绘制工作曲线。
[0027]实施例11
用计时电流法对分析物进行检测
(1)使用电化学工作站对三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，钼丝电极为辅助电极，所制备的免疫传感器为工作电极，在10 mL、pH 4.0-6.0的PBS缓冲溶液中进行测试;
(2)在0.0--0.5 V的检测电压下，每隔40秒加入10 μL 5.0 mmol ?ab1 H2O2，记录电流变化；
(3)二氧化钛上的铜离子对H2O2具有催化作用，能将H2O2催化转变为H2O,同时产生电流变化，根据所得电流强度与分析物浓度之间的线性关系，绘制工作曲线。
[0028]实施例12
按照实施例1~9进行操作，分析物选癌胚抗原(CEA)，用方波伏安法对分析物进行检测，体系的线性范围为3 pg ?πι^^δΟ ng ^mL4,检测限为1.46 pg *mL_1 ;用计时电流法对分析物进行检测，体系的线性范围为0.6 pg ?πι^^δΟ ng-mL4,检测限为0.24 pg-mL—1。分析物选甲胎蛋白(AFP)时，用方波伏安法对分析物进行检测，体系的线性范围为5 pg -mL-^60ng.mL—1，检测限为1.3 pg.mL—1 ;用计时电流法对分析物进行检测，体系的线性范围为2pg.mL-1 ~60 ng.mL-1,检测限为 0.54 pg.mL'
[0029]实施例13
按照实施例1~9进行操作，分析物选免疫球蛋白G (IgG)时，用方波伏安法对分析物进行检测，体系的线性范围为0.1 pg/mL^lOO ng/mL,检测限为0.052 pg ;用计时电流法对分析物进行检测，体系的线性范围为0.01 pg/mL^100 ng/mL，检测限为0.0043 pg分析物选免疫球蛋白E (IgE)时，用方波伏安法对分析物进行检测，体系的线性范围为0.5Pg.mdOO ng.mL—1，检测限为0.18 pg.mL—1 ;用计时电流法对分析物进行检测，体系的线性范围为 0.1 pg.mdOO ng.mL—1,检测限为 0.048 pg.mL'
[0030]实施例14
按照实施例1~9进行操作，分析物选a -L-岩藻糖苷酶(AFU)，时，用方波伏安法对分析物进行检测，体系的线性 范围为15 pg.mL-^10.0 ng.mL—1，检测限为4.5 pg.mL—1 ;用计时电流法对分析物进行检测，体系的线性范围为5.0 pg.mL-^10.0 ng.!!^1，检测限为1.6 pg.mL、
[0031]实施例15
按照实施例1~9进行操作，分析物选前列腺特异性抗原(PSA)，时，用方波伏安法对分析物进行检测，体系的线性范围为20 pg.md0.0 ng.mL—1,检测限为6.1 pg.mL—1 ;用计时电流法对分析物进行检测，体系的线性范围为5.0 pg.mL-^40.0 ng.!!^1，检测限为1.4 pg.mL、
[0032]实施例16
按照实施例1、进行操作，分析物选CA15-3，CA125，CA 19-9, CA724，CA242时，用方波伏安法对分析物进行检测，体系的线性范围分别为10 pg*mL^40 ng^mL—1，检测限可达到3.1 pg ;用计时电流法对分析物进行检测,体系的线性范围为5 pg ?mL^^O ng ?mL—1,检测限可达到1.2 pg.mL'
[0033]实施例17
按照实施例1~9进行操作，分析物选乳腺癌易感基因(BRCAl)时，用方波伏安法对分析物进行检测，体系的线性范围为10 pg.mL-^15 !^?!!!!^，检测限为〗』pg.mL—1 ;用计时电流法对分析物进行检测，体系的线性范围为4.0 pg.mL-^15 ng.mL—1，检测限为1.3pg* Inr10分析物选鳞状细胞癌抗原(SCCA)时，用方波伏安法对分析物进行检测，体系的线性范围为20 pg.mdO ng.mL—1,检测限为6.0 pg.mL—1 ;用计时电流法对分析物进行检测，体系的线性范围为8.0 pg.mdO ng.mL—1，检测限为2.1 pg.mL'
[0034]实施例18
按照实施例1~9进行操作，分析物选人绒毛膜促性腺激素(HCG)时，用方波伏安法对分析物进行检测，体系的线性范围为40 pg.mdO ng.mL—1,检测限为8.2 pg.mL—1 ;用计时电流法对分析物进行检测，体系的线性范围为10 pg.mL-^20 ng.mL—1，检测限为2.6Pg.mL 1O[0035]实施例19
按照实施例1、进行操作，分析物选细胞角蛋白19片断(Cyfra21-1)时，用方波伏安法对分析物进行检测，体系的线性范围为0.5 ng*mL^20 ng -mL'检测限为0.12 ng-mr1 ；用计时电流法对分析物进行检测，体系的线性范围为0.1 ng.mL-^20 ng.!!^1，检测限为
0.032 ng.mL 1 ο
[0036]实施例20
按照实施例1、进行操作，分析物选神经元特异性烯醇化酶(NSE)时，用方波伏安法对分析物进行检测，体系的线性范围为5.0 ng.mL-^80 ng.mL—1，检测限为1.3 ng.mL—1 ;用计时电流法对分析物进行检测，体系线性范围为1.0 ng.mL-^80 ng.mL—1，检测限为0.24ng.mL、
【权利要求】
1.一种双功能标记物-二抗孵化物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)二氧化钛纳米材料的制备 将2 mL钛酸丁酯加入4(T50 mL乙二醇中，室温搅拌6~8 h制成混合物，将混合物加入150^170 mL的丙酮中，加疒3 mL水，剧烈搅拌广2 h，离心分离，用乙醇清洗2~4次，50°C干燥，制得二氧化钛前驱体；将0.1 g 二氧化钛前驱体分散到20 mL水中，搅拌条件下加热回流1-2 h;再经过离心分离，乙醇清洗2~4次，50°C干燥，制得二氧化钛纳米材料，备用； (2)铜掺杂二氧化钛CuOTiO2的制备 将I g 二氧化钛纳米材料加到40 mLUO mo I.l-1的NaOH溶液中，搅拌2~3 h，装入聚四氟乙烯的反应釜中，12(Tl40°C加热18~24 h，取出、冷却至室温，用8~12 mL、0.1mo I.l-1 HCl溶液搅拌处理，超纯水洗涤至中性，60°C下干燥，得到处理过的二氧化钛纳米材料； 将乙二胺(en)和Cu (OH) 2以化学计量比2:1的比例混合制得Cu (en) 2 (OH) 2溶液，将0.8g上述处理过的二氧化钛纳米材料加到50 mL制得的Cu(en)2(0H)2溶液中，搅拌1~2 h,得到蓝色物质，离心分离，用水清洗数次后，在40(T500°C下煅烧得到黄色粉末铜掺杂二氧化钛 CuiTiO2 ； (3)双功能标记物的制备 将0.25 g Cu@Ti02、0.5 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷、80 mL甲苯，在氮气保护下，120°C搅拌回流4飞h，用甲苯和超纯水各清洗2~4次，5(T60°C下干燥，制得氨基功能化铜掺杂二氧化钛CuOTiO2,即双功能标记物； 所述的双功能标记物，其功能一是利用二氧化钛上的铜离子发生氧化还原反应产生的信号用方波伏安法对分析物进行检测；二是利用二氧化钛上的铜离子催化H2O2产生的信号，采用计时电流法对分析物进行检测； (4)双功能标记物-二抗孵化物CuOTiO2-Ab2的制备 将I mg双功能标记物和0.5 mL、质量分数为2.5%的戊二醛混合，振荡f 2 h，离心，倾倒上层溶液，加入0.4~0.6 mL、ρΗ7.0~7.8的PBS溶液，超声使其分散均匀；加入3~5 μL分析物的二抗(Ab2)，振荡10~12 h后离心分离，用pH 7.0-7.8的PBS溶液定容至I mL，制得双功能标记物-二抗孵化物CuOTiO2-Ab2,置于4°C冰箱中备用。
2.一种双功能标记物构建的免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)将:3-5μ LU.5^2.5 mg.mr1超声处理分散均匀的石墨烯，滴涂在玻碳工作电极表面，自然晾干； (2)分别将:3-5μL的8~12.mL-1分析物的一抗Ab1滴涂在(I)中得到的工作电极表面，4°C冰箱中干燥； (3)滴涂2~4μL、80-?20 Pg 的牛血清白蛋白于(2)中得到的工作电极表面，置于4°C冰箱中直至干燥，超纯水清洗后，置于4°C冰箱中晾干； (4)取3~5μL权利要求1制备的双功能标记物-二抗孵化物CuOTiO2-Ab2,滴涂于电极表面上，置于4 °C冰箱中晾干，制得一种双功能标记物构建的免疫传感器。
3.根据权利要求2所述的制备方法制备的免疫传感器，其特征在于，用于分析物的检测，包括如下步骤: (I)用方波伏安法对分析物进行检测1)使用电化学工作站对三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，钼丝电极为辅助电极，所制备的免疫传感器为工作电极，在10 mL、pH 4.0-6.0的PBS缓冲溶液中进行测试; 2)扫描电压范围从-0.4~0.4 V，电势阶跃为5 mV,频率25 Hz，振幅25 mV ； 3)二氧化钛上的铜离子发生氧化还原反应在0.0 V附近产生信号，根据所得电流强度与分析物浓度之间的线性关系，绘制工作曲线； (2)用计时电流法对分析物进行检测 1)使用电化学工作站对三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，钼丝电极为辅助电极，所制备的免疫传感器为工作电极，在10 mL、pH 4.0-6.0的PBS缓冲溶液中进行测试; 2)在0.0--0.5 V的检测电压下，每隔40秒加入10 μL 5.0 mmol.1/1 H2O2，记录电流变化； 3)二氧化钛上的铜离子对H2O2具有催化作用，能将H2O2催化转变为H2O,同时产生电流变化，根据所得电流强度与分析物浓度之间的线性关系，绘制工作曲线。
4.根据权利要求1和权利要求3所述的分析物，其特征在于，所述分析物选自以下之一:癌胚抗原(CEA)，甲胎蛋白(AFP)，免疫球蛋白E (IgE)，免疫球蛋白G (IgG), a-L-岩藻糖苷酶(AFU)，前列腺特异性抗原(PSA)，CA 15-3, CA125，CA 19-9, CA724，CA242，人绒毛膜促性腺激素(HCG)，乳腺癌易感基因(BRCA1)，鳞状细胞癌抗原(SCC)、细胞角蛋白19片断(Cyfra21-1),组织多肽抗原(TPA)，神经元特异性烯醇化酶(NSE)。
【文档编号】G01N33/53GK103913565SQ201410171321
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2014年4月26日 优先权日:2014年4月26日
【发明者】魏琴, 张森, 杜斌, 庞雪辉, 马洪敏, 吴丹 申请人:济南大学