一种采用双重免疫标记监测昆虫迁飞规律的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物保护技术领域，具体涉及一种采用双重免疫标记监测昆虫迀飞规 律的方法，即采用酶联免疫吸附测定方法检测带有不同标记蛋白的迀飞型昆虫，以此来明 确当地迀飞昆虫的迀出规律以及迀入种群的再迀飞规律，进而指导农业迀飞性害虫的预测 预报及其防控。
【背景技术】
[0002] 昆虫迀飞是指在一定的季节里，在生长发育的某个特定阶段，成群或分散的，有规 律的从一个发生地飞到另一个地区的适应性现象。迀飞性昆虫多呈现跨省乃至跨国远距离 迀飞的景象，在农林牧区常常突发成灾，进而对经济生产造成严重威胁。例如，非洲的沙漠 虫皇（Schistocerca gregaria)、澳大利亚的疫幢（Chortoicetes terminifera)和中国的东 亚飞幢(Locusta migratoria manilensis)，都是臭名昭著的具有大区域暴发性和毁灭性 的迀飞性害虫。中国地处东亚季风区，特殊的地理气候条件使中国农作物的主要害虫都是 南北往返迀飞数千公里，屡屡"小虫成大灾"。因此研究昆虫的迀飞规律，对于防治迀飞型昆 虫显的尤为重要。
[0003] 当前主要运用雷达昆虫学和轨迹分析技术来研究昆虫的迀飞规律。前者主要通过 毫米波或厘米波昆虫雷达观测迀飞昆虫的空中迀飞行为规律来开展;后者则主要通过气象 数据(风向、风速和降雨等)分析，并采用回推的方式来计算迀飞型昆虫的来源，即虫源概率 区域。然而有关迀飞种群的迀出规律以及迀入种群的再迀飞规律等至今仍未具体明确。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种采用双重免疫标记监测昆虫迀飞规律的方法，该方法为 能明确当地种群的迀出规律以及迀入种群的再迀飞规律的行之有效的监测技术，进而指导 农业迀飞性害虫的预测预报及其防控。
[0005] 本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
[0006] -种采用双重免疫标记监测昆虫迀飞规律的方法，包括以下步骤：
[0007] (1)迀飞型昆虫的选择:选择一种或多种迀飞型昆虫；
[0008] (2)蛋白标记物的选择:选择蛋清蛋白标记物为第一种蛋白标记物，脱脂奶粉标记 物为第二种蛋白标记物；
[0009] (3)目的昆虫当地种群的发生情况调查：结合寄主作物的生长期，捕获目的昆虫， 并结合大田调查以明确目的昆虫当地种群的发生数量；
[0010] (4)第一种蛋白标记物的喷洒以及目的昆虫捕获:在目的昆虫当地种群高密度期 喷洒第一种蛋白标记物，24小时后分别捕获居留型和迀出型的目的昆虫，-20°C下保存；
[0011] (5)第二种蛋白标记物的喷洒以及目的昆虫捕获：于目的昆虫迀入高峰期均匀喷 洒第二种蛋白标记物，24小时后分别捕获居留型和迀出型的目的昆虫，-20°C下保存；
[0012] (6)目的昆虫当地种群的迀出行为规律及迀入种群的再迀飞行为规律研究：通过 酶联免疫吸附法分别检测步骤(4)和步骤(5)所捕获目的昆虫携带的标记蛋白种类及数量， 以明确当地种群的迀出行为规律和迀入种群的再迀飞规律；
[0013] I在调查目的昆虫当地种群时只用蛋清蛋白进行标记，捕获的迀出型目的昆虫中 呈蛋清蛋白阳性的即为有迀飞行为的当地种群：
[0014] 当地种群迀飞比例=迀出型蛋清蛋白阳性种群数量/(迀出型蛋清蛋白阳性种群 数量+居留型蛋清蛋白阳性种群数量）；
[0015] n在调查迀入种群中利用蛋清蛋白和脱脂奶粉双重蛋白标记，捕获的迀出型目的 昆虫中只有呈脱脂奶粉阳性的即为有再迀飞行为的迀入种群：
[0016] 迀入种群再迀飞比例=(迀出型脱脂奶粉阳性种群数量-迀出型双重阳性种群数 量)/(迀出型脱脂奶粉阳性种群数量+居留型脱脂奶粉阳性种群数量-迀出型双重阳性种群 数量-居留型双重阳性种群数量）。
[0017] 所述第一蛋白标记物的配制方法为：称取体积比为1:99的蛋清蛋白和水混合均 匀。
[0018] 所述第二蛋白标记物的配制方法为:称取质量体积比（g:mL)为1:99的脱脂奶粉和 水混合均匀。
[0019]所述第一蛋白标记物和第一蛋白标记物的喷洒量为250~300L/公顷。
[0020]所述的居留型目的昆虫通过大田普查的方式进行捕获，所述的迀出型目的昆虫通 过诱虫灯诱捕的方式进行捕获。大田普查捕获目的昆虫时一般是采用电动吸虫器进行。 [0021 ]所述酶联免疫吸附法为本领域的常规的技术方法。
[0022]步骤(6)中采用酶联免疫吸附法检测脱脂奶粉标记蛋白的详细过程为：
[0023] (1)捕获的目的昆虫分别放在微量离心管中，每一个微量离心管中加入750yl TBS 缓冲溶液，置于恒温摇床27°C，lOOrpm，清洗lh，取上清液移至新微量离心管；
[0024] (2)获得的上清液即为抗原样品，取80iU抗原样品加入到微量滴定板中，每个样品 重复三次，然后在4°C冰箱孵育lh;
[0025] (3)用2x PBST缓冲液冲洗微量滴定板1~4次，每次每孔用300yl冲洗，用洗板机清 洗；
[0026] (4)向微量滴定板中加入360yl 25%鸡蛋清蛋白封闭剂，然后置于4°C冰箱孵育 lh；
[0027] (5)按照步骤(3)，用2X PBST缓冲液冲洗微量滴定板1~4次；
[0028] (6)向微量滴定板反应孔中加入80yl的第一抗体：羊抗牛酪蛋白，按1:2000稀释， 将微量滴定板置于4°C冰箱孵育lh;
[0029] (7)用5X PBST缓冲液冲洗微量滴定板，每次每孔用300yl;
[0030] (8)向微量滴定板反应孔中加入80yl的第二抗体：鼠抗羊免疫球蛋白，按1:4000稀 释，将微量滴定板置于4°C冰箱孵育lh;
[0031] (9)用5x PBST缓冲液对微量滴定板清洗1~4次，每次每孔用300yl;
[0032] (10)微量滴定板每反应孔中加入80yl的TBM酶作用物3，3 '，5，5 ' -四甲基联苯胺， 将微量滴定板置于4°C冰箱孵育lOmin;
[0033] (11)加入50yl终止液2M H2S〇4终止反应；
[0034] (12)用酶标仪测定微量滴定板各反应孔的吸光值，借助吸光光度的方法测定在 650nm处吸光值；
[0035] (13)以水和第二种蛋白标记物分别作为阴性对照和阳性对照，将样品的吸光度值 与阴性对照(水)进行比较，判定样品为阴性或阳性：当样品的吸光光度值0D等于或大于阴 性对照吸光光度值的平均值加上3倍标准差时，就判定为阳性读数，即阳性读数认定标准 为:样品平均0D值2阴性对照平均0D值+3 X阴性对照平均0D值的标准差；当数值小于阴性 对照的平均吸光光度值时，样品被判定为阴性，即阴性读数认定标准为:样品平均〇〇值<阴 性对照平均0D值。
[0036] 步骤(6)中采用酶联免疫吸附法检测蛋清蛋白标记蛋白的详细过程为：
[0037] (1)捕获的目的昆虫分别放在微量离心管中，每一个微量离心管中加入750yl TBS 缓冲溶液，置于恒温摇床27°C，lOOrpm，清洗lh，取上清液移至新微量离心管；
[0038] (2)获得的上清液即为抗原样品，取80iU抗原样品加入到微量滴定板中，每个样品 重复三次，然后在恒温箱37°C，温育lh;
[0039] (3)用2x PBST缓冲液冲洗微量滴定板1~4次，每次每孔用300yl冲洗，用洗板机清 洗；
[0040] (4)向微量滴定板中加入360yl 1%牛血清蛋白封闭剂，然后放在摇床上在27°C下 孵育lh;
[00411 (5)按照步骤(3)，用2x PBST缓冲液冲洗微量滴定板1~4次；
[0042] (6)向微量滴定板反应孔加入80yl的第一抗体:兔抗鸡蛋清蛋白，按1:8000稀释， 将微量滴定板置于恒温箱37°C，孵育lh;
[0043] (7)用5x PBST缓冲液冲洗微量滴定板，每次每孔用300yl;
[0044] (8)向微量滴定板反应孔中加入80yl第二抗体：羊抗兔免疫球蛋白，按1:2000稀 释，将板置于恒温箱37°C，孵育2h;
[0045] (9)用5x PBST缓冲液对微量滴定板清洗1~4次，每次每孔用300yl;
[0046] (10)微量滴定板每反应孔中加入80yl的TBM酶作用物3，3 '，5，5 ' -四甲基联苯胺， 置于恒温箱27°C，10min;
[0047] (11)加入50yl终止液2M H2S〇4终止反应；
[0048] (12)用酶标仪测定微量滴定板各反应孔的吸光值，借助吸光光度的方法测定在 650nm处吸光值；
[0049] (13)以水和第一种蛋白标记物分别作为阴性对照和阳性对照，将样品的吸光度值 与阴性对照(水)进行比较;当样品的吸光光度值0D等于或大于阴性对照吸光光度值的平均 值加上3倍标准差时，就判定为阳性读数，即阳性读数认定标准为:样品平均0D值2阴性对 照平均0D值+3 X阴性对照平均0D值的标准差；当数值小于阴性对照的平均吸光光度值时，