一种基于多重微滴pcr偶联荧光分光光度法的生物基因定性、定量、高通量检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于多重微滴PCR偶联荧光分光光度法的生物基因定性、定量、高通量检测方法。首先，设计特异性引物并对其选择性地进行不同荧光基团标记，随后应用上述荧光标记的特异性引物进行微滴PCR扩增，扩增产物经纯化后，用荧光分光光度计或酶标仪来测量纯化后的PCR产物中各个发射波长和荧光值含量，达到自动检测的目的，可同时进行定性、定量和高通量检测。本发明方法可实现对大量目标DNA分子同时进行高通量的扩增和定性、定量和高通量检测。
【专利说明】—种基于多重微滴PCR偶联荧光分光光度法的生物基因定性、定量、高通量检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属生物基因检测【技术领域】，涉及一种基于多重微滴PCR偶联荧光分光光度法的生物基因定性、定量、高通量检测方法。
【背景技术】
[0002]传统生物基因定性、定量PCR检测技术每次只能对单一一种的基因进行检测，而对于基因成分不明确的样品，需要通过多种检测方法、进行多次实验才能确定，周期长、工作量大，且成本高。虽然多重常规PCR、定量PCR能一次实验可同时检测几种基因，但在同一反应管中进行多重PCR效果常常很差，产生非特异扩增，短的片段经常会被优先扩增，在同源区的重组常会产生人工片段。其关键是引物的设计，引物和引物之间，引物本身，产物和产物之间不能有错配，复杂的多重PCR引物设计必须依赖于较为大型的数据库和计算机模拟PCR结果，以及后期的验证，这个不是一般小型实验室可以完成的事情。
[0003]目前国内外一些机构及公司开展了高通量检测方法的研究，如Bio-Rad公司、SGS检测机构开发了一些转基因检测试剂盒等以及已经广泛应用于临床研究的基因芯片技术。然而这些检测方法成本非常高，技术复杂、人员要求高并且需要昂贵的仪器来完成。目前国内外的生物基因 产品检测方法仍以单一的定性、定量PCR的检测方法为主。
[0004]因此，在未来的生物基因检测中，这些检测技术已越来越不能胜任一次处理含有几种、十几种、几十种生物基因的样品检测的特殊需要，尤其是大数量的生物样品，需要更有效的、快速的高通量检测方法。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题在于提供一种基于多重微滴PCR偶联荧光分光光度法的生物基因定性、定量、高通量检测方法，以弥补现有技术的缺陷(现有的PCR检测技术要么只能对生物样品进行定性检测，如常规PCR ;要么只能进行定量检测，如荧光定量PCR ；有的只能高通量检测，如基因芯片技术；因而大大限制了其应用)，同时实现快速定性、定量和高通量检测。
[0006]本发明方法可作为生物学研究中高通量DNA分子分析的一种手段,可对多个DNA分子同时进行检测，提高了分析的通量，还可同时进行定性、定量检测，减少了宝贵样品和试剂的消耗。
[0007]本发明所述的多重微滴PCR偶联荧光分光光度法的生物基因定性、定量、高通量的检测方法，首次由本申请发明人提出，属于本领域的创新之举。该方法具体是指将油相和PCR反应体系的水相混合在一起，利用“油包水”的乳化技术将PCR反应体系分隔成109的独立微滴，每个微滴含有一个或二个模板和引物，每个微滴代表一个反应，这些反应可以在相同的条件下平行地进行扩增，同时进行多重PCR ;用不同的荧光基团标记不同待测产品的特异性引物，通过微滴PCR进行扩增，不同的PCR产物被不同的荧光标记，因而不同的待测产品由不同的荧光识别，进而可以通过荧光分光光度法，例如利用荧光酶标仪或荧光分光光度计等对生物基因进行定性检测；同时对荧光的强度进行测量，通过标准曲线进而可以对生物基因产品进行定量检测。由于同一个PCR管中的多种不同生物基因有不同的荧光标识，因而可以同时检测多种生物基因，进而实现高通量检测。
[0008]在本发明方法中，首先将设计好的引物选择性地进行不同荧光基团标记，随后在单一的微滴PCR方法中应用上述荧光标记的引物进行PCR扩增，扩增PCR产物经过纯化后，最后应用荧光分光光度计或酶标仪等来测量纯化后的产物中的各个发射波长和荧光值的含量，达到自动检测的目的，并同时进行定性、定量和高通量检测。本发明这种组合检测方法可实现对大量目标DNA分子同时进行高通量的扩增和定性、定量和高通量检测。
[0009]具体来讲，本发明所述的基于多重微滴PCR偶联荧光分光光度法的生物基因定性、定量、高通量检测方法，包括如下步骤:
[0010]第一步，针对待测生物样品的DNA序列分别设计PCR特异性引物(包括上游引物或下游引物)，要求各对引物Tm值要相近、各目标片段的长度分别要尽可能相近，从而有利于在等同的PCR参数下进行扩增。引物长度一般在20-25bp之间，扩增的目的片段大小在200-250bp之间。并选择合适的荧光基团并按具体情况对该已设计好的上游引物或下游引物进行荧光基团标记。
[0011]所述荧光基团的激发光谱与发射光谱的带宽之和应大于该荧光基团的斯托克斯位移；这样才能避免激发光谱与发射光谱发生重叠，两个不同的荧光基团的激发光谱不能发生重叠，发射光谱也不能发生重叠。
[0012]第二步，使用上述已标记荧光基团的特异性引物对在水油乳化剂中对相应的DNA模板进行多重微滴PCR扩增；
[0013]所述水油乳化剂具体配制方法为:25°C下，取200 μ I微滴如表1所示的PCR水相在1.5分钟内逐滴加入到400 μ I微滴PCR油相(其成分如表2所示)中，混合后形成均匀的水油乳化剂，所述水油乳化剂中微滴的直径为I~8μΜ，每微升的水油乳化剂包含3Χ106到IXlO7个微滴；
[0014]表1微滴PCR水相成分
[0015]
【权利要求】
1.一种基于多重微滴PCR偶联荧光分光光度法的生物基因定性、定量、高通量检测方法，其特征在于，包括以下步骤: 第一步，针对待测生物样品分别设计PCR特异性引物，并选择性对特异性引物进行不同荧光基团标记；所述荧光基团的激发光谱与发射光谱的带宽之和大于该荧光基团的斯托克斯位移； 第二步，使用上述已标记荧光基团的特异性引物对在水油乳化剂中对相应的DNA模板进行多重微滴PCR扩增； 第三步，PCR产物分离及纯化； 第四步，用荧光分光度法对微滴PCR产物进行定性、定量、高通量检测分析:用不同的荧光基团标记不同的特异性引物，因而不同的PCR产物被不同荧光基团标记即待测生物样品由不同的荧光识别，用荧光分光度法根据荧光基团的发射波长对待测生物样品进行定性检测；同时，测量荧光的强度，通过标准曲线对待测生物样品进行定量检测；上述微滴PCR扩增过程中在等同的PCR参数下同时进行多重PCR反应，同时检测出至少7种待测生物样品，实现高通量检测。
2.根据权利要求1所述的生物基因定性、定量、高通量检测方法，其特征在于，所述待测生物样品和对应的特异性引物对及其标记的荧光基团如下所示:
3.根据权利要求1所述的生物基因定性、定量、高通量检测方法，其特征在于，所述水油乳化剂具体配制方法为:25°C下，取200μ I微滴如下表所示的PCR水相在1.5分钟内逐滴加入到400 μ I微滴PCR油相中，混合后形成均匀的水油乳化剂，所述水油乳化剂中微滴的直径为1~8 μ Μ，每微升的水油乳化剂包含3 X IO6到I X IO7个微滴； 微滴PCR水相成分
4.根据权利要求1所述的生物基因定性、定量、高通量检测方法，其特征在于，所述微滴PCR油相的成分如下所示:
5.根据权利要求1所述的生物基因定性、定量、高通量检测方法，其特征在于，第四步荧光分光度法中利用荧光分光度计或荧光酶标仪检测微滴PCR产物。
6.根据权利要求1或5所述的生物基因定性、定量、高通量检测方法，其特征在于，所述荧光分光光度法中利用Thermo VarioSkan Flash多功能荧光酶标仪检测微滴PCR产物，此时，第一步中所述荧光基团的斯托克斯位移大于17nm;两个不同的荧光基团的激发波长间隔大于等于10nm，发射波长间隔大于等于24nm。
【文档编号】C12Q1/68GK103757115SQ201410022452
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月17日 优先权日:2014年1月17日
【发明者】赵凯, 施伟, 唐雪明, 赵笑, 任方方, 吴洋洋, 胡瑞丽 申请人:上海市农业科学院