一种胃液中幽门螺杆菌多重实时荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种胃液中幽门螺杆菌多重荧光定量PCR检测方法，本发明所述方法包括用于检测幽门螺杆菌的特异性引物、探针，其核苷酸序列分别如SEQ?ID?NO:1，SEQ?ID?NO:2，SEQ?ID?NO:3，内参基因人上皮细胞核糖核酸酶P（Rnase?P）特异性引物、探针，其核苷酸序列分别如SEQ?ID?NO:4，SEQ?ID?NO:5，SEQ?ID?NO:6，幽门螺杆菌阳性对照、内参基因阳性对照、阴性对照。本发明所述方法仅需要待检者提供胃液，属于非侵入性检测，患者依从性好，检测快速准确、样品需求量小（仅需10-500μl胃液），特异性强、灵敏度高，简便快速的优点，具有良好的临床标本检测能力。
【专利说明】—种胃液中幽门螺杆菌多重实时荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种胃液中幽门螺杆菌多重实时荧光定量(Real Time) PCR检测试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002]1983年澳大利亚学者Warren和Marshal I首次从人胃黏膜标本中分离出幽门螺杆菌(Helicobacter pylroi,简称H.pylori或HP),是一种呈S形或弧形弯曲的革兰氏阴性菌。研究表明，HP感染与慢性胃炎、胃溃疡、胃腺癌、胃黏膜相关性淋巴瘤有着密切的联系。1994 年国际癌症研究中心(international agency for research on cancer, IARC)将 HP列为I类致癌物。流行病学调查显示，HP感染在世界各地均较为常见，具有很高的发病率。我国HP感染率40%-90%，平均59%。因此，HP感染的快速准确诊断对于下一步针对性的临床治疗具有重要意义。
[0003]目前HP感染的检测主要分为侵入性和非侵入性两类。(I)侵入性检查:通过内窥镜获取胃粘膜组织作为实验材料，进行微生物学培养、病理组织学检测、快速尿素酶试验和基因诊断等；(2)非侵入性检查:不需获得胃粘膜组织，采用胃液、血清、唾液、粪便等标本，方法有粪便幽门螺杆菌抗原检测、血清中幽门螺杆菌抗体检测、尿素呼气试验和其他标本中幽门螺杆菌基因的测定。以上方法各有利弊，侵入性检查方法在儿童不易接受及普及，非侵入性检查方法中，粪便抗原检测对于已经进行临床治疗的病例，不能得到满意的结果；尿素呼气试验中，尿素酶的活性常受口咽部尿素酶阳性细菌的影响；由于幽门螺杆菌感染后数周血中才会出现特异抗体，且细菌根除后血中抗体可维持6个月以上，因此血清幽门螺杆菌抗体检测不主张用于临床诊断。
[0004]实时荧光定量PCR因`其高灵敏度和高特异性的特点被广泛应用于各种病原体的检测，该方法能够有效控制PCR产物的实验室污染，更适合临床实验室常规检测。目前，没有报道针对胃液标本的实时荧光定量PCR的成熟、系统的检测方法。本发明旨在提供一种通过实时荧光定量PCR方法从胃液标本中检测HP的感染情况，包括胃液标本的预处理方法以及检测所需最小胃液量。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于解决现有技术的不足，提供一种实时荧光定量PCR检测胃液中幽门螺杆菌的方法，该方法仅需10-500 μ L的胃液，即可快速、准确、灵敏地检测出胃液中幽门螺杆菌的存在。
[0006]为实现上述目的，本发明通过对GenBank中已知幽门螺杆菌核苷酸序列的比对分析，找到幽门螺杆菌的cag PAI上的一段保守区cagH作为靶基因。这段基因的筛选来源于中国⑶C传染病所诊断室对全国来源的74株HP菌株的cagPAI测序分析。这些菌株代表了中国的流行菌株。同时本发明选择人上皮细胞核糖核酸酶P (Rnase P)作为内参基因。Rnase P基因常被用作从人体标本中检测病原微生物的内参基因。这一基因的成功扩增，可以保证试验中模板提取的正确性和初步估计模板的浓度。
[0007]幽门螺杆菌特异性引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2所示，与之配套的特异性探针序列如SEQ ID N0:3所示。Rnase P内参基因引物序列如SEQ ID N0:4和SEQ IDNO:5所示,与之配套的特异性探针序列如SEQ ID N0:6所示。
[0008]所述用于实时荧光定量检测幽门螺杆菌的引物的核苷酸序列为:
[0009]HP cag H 上游引物:5’ -TTATGTTAGAAATCGCTTGAGTGTCA-3’ (SEQ ID NO:1)
[0010]HP cag H 下游引物:5’ -CGCTTCTCAAATGATACTTAATCAATC-3’ (SEQ ID NO: 2)
[0011]与上述引物配合使用的探针核苷酸序列为:
[0012]HP cag H 荧光探针:5’ -FAM-AGGTGCTAGTAGCTAATC-BHQ1-3，(SEQ ID NO: 3)
[0013]该探针5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记荧光淬灭基团BHQ
[0014]所述用于实时突光定量检测Rnase P内参基因的引物的核苷酸序列为:
[0015]RnaseP 上游引物:5’-AGATTTGGACCTGCGAGCG-3’ (SEQ ID NO:4)
[0016]RnaseP 下游引物:5，-GAGCGGCTGTCTCCACAAGT-3，(SEQ ID NO:5)
[0017]与上述引物配合使用的探针核苷酸序列为:
[0018]RnaseP 荧光探针:5’-HEX-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-BHQ1-3’ (SEQ ID NO: 6)该探针5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记荧光淬灭基团BHQ1。
`[0019]本发明提供一种胃液中幽门螺杆菌的实时荧光定量PCR检测方法，包括前处理:取10yL-500yL胃液，加入等量的Tris缓冲液(0.67M，PH7.4)，振荡均匀，室温孵育2h。13000rpm离心5min，弃上清留沉淀。QIAGEN DNA提取试剂盒进行核酸提取，以样品总DNA为模板，以本发明提供的相应的引物和探针进行实时荧光定量PCR，同时设立阳性对照和阴性对照，根据扩增曲线判定结果。
[0020]在有效扩增的情况下，样品检测结果可信，否则试验需要重复；在检测中两种对照为有效扩增时，样本结果判断标准如下:
[0021]Ct值小于等于38的标本为阳性结果；
[0022]Ct值大于40的标本为阴性结果；
[0023]Ct值在38-40之间的标本需要重复，重复试验如Ct值依然低于40判定为阳性扩增，超过40判定为阴性扩增。
[0024]本发明的实时荧光定量PCR扩增反应体系，当为20 μ I反应体系时，其优选配置为:
[0025]表1多重实时荧光定量PCR最优体系
【权利要求】
1.一种多重实时荧光定量PCR检测胃液中幽门螺杆菌的试剂盒，其特征在于，每一体系包括两条探针，一种用于检测幽门螺杆菌的特异性探针，其具有SEQ ID N0.3所示的序列；一种用于检测人上皮细胞核糖核酸酶P (Rnase P)特异性探针，其具有SEQ ID N0.6所示的序列。
2.一种如权利要求1所述的试剂盒，包括荧光定量反应试剂、特异性引物和探针、阳性质控品以及阴性质控品； 所述特异性引物和探针由幽门螺杆菌特异基因cag H和内参基因人上皮细胞核糖核酸酶P (RNase P)的特异性引物和探针组成:
3.如权利要求1所述的试剂盒，阳性质控品包括幽门螺杆菌特异基因cagH和内参基因人上皮核糖核酸酶P (RNase P)的标准品，阴性质控品为大肠杆菌，浓度均为I X IO6Copies/ μ I ； 所述阳性标准品的序列如下: 幽门螺杆菌特异基因cag H标准品:
4.根据权利要求1-3任一项的试剂盒，其检测方法包括:取10-500μ I胃液提取核酸，操作步骤按QIAGEN QIAamp DNA mini kit说明书； 以该核酸作为模板进行实时荧光定量PCR，根据扩增曲线判定结果。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，胃液提取方法为: 前处理:取10yL-500yL胃液，加入等量的Tris缓冲液(0.67M，PH7.4)，振荡均匀，室温孵育2h ;13000rpm离心5min,弃上清留沉淀； 提取:QIAGEN DNA提取试剂盒进行核酸提取。
6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，实时荧光定量PCR反应体系为:
7.如权利要求4-6任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的反应程序为:95°C预变性10min，l个循环;95°C变性10s，58。。退火45s，45个循环。
8.前述任一项的试剂盒，其特征在于，根据扩增曲线判定结果: 在有效扩增的情况下，样品检测结果可信，否则试验需要重复；在检测中两种对照为有效扩增时，样本结果判断标准如下: Ct值小于等于38的标本为阳性结果； Ct值大于40的标本为阴性结果； Ct值在38-40之间的标本需要重复，重复试验如Ct值依然低于40判定为阳性扩增，超过40判定为阴性扩增。
【文档编号】C12Q1/68GK103866034SQ201410131855
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年4月2日 优先权日:2014年4月2日
【发明者】彭贤惠, 张建中, 何利华, 刘杰, 闫笑梅, 赵飞, 张茂俊, 顾一心 申请人:中国疾病预防控制中心传染病预防控制所