一种发酵生产微分子量右旋糖酐的方法
【专利摘要】本发明公开了一种发酵生产微分子量右旋糖酐的方法。该方法采用在菌种生长对数期向发酵体系添加右旋糖酐水解酶，同时流加蔗糖溶液，有效提高了蔗糖的转化效率，从传统工艺的24小时转化390g蔗糖提高到36小时转化750g蔗糖；流加结束后再次向发酵罐内添加右旋糖酐水解酶，可根据需要控制微分子右旋糖酐产物的分子量（20000Da以下），可实现一步法生产微分子量右旋糖酐，无需酸水解和酒精分级沉淀，简化了生产工艺。本发明对于蔗糖转化效率的提高和微分子右旋糖酐分子量的有效控制效果显著，是一种发酵制备微分子量右旋糖酐的有效方法。
【专利说明】一种发酵生产微分子量右旋糖酐的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种发酵方法，特别涉及一种发酵生产微分子量右旋糖酐的方法。
【背景技术】
[0002]右旋糖酐(dextran),又称葡聚糖,是一种由若干葡萄糖聚合而成的高分子聚合物，是最早发现的微生物多糖，也是美国FDA批准的第一种可用于食品的微生物胞外多糖，是较早作为血浆应用的微生物多糖。
[0003]右旋糖酐-70是目前公认的优良血浆代用品之一，已经广泛用于医疗临床；右旋糖酐-40和右旋糖酐-20具有改善微循环作用，同时也具有补充一定血容量的作用。除了作血浆代用品之外，微分子量右旋糖酐(分子量为20000Da以下)还可以形成一系列用途极为广泛的衍生物，如右旋糖酐铁(右旋糖酐分子量为5000-7500Da)、右旋糖酐-阿霉素复合物(S.Mitra, U.Gaur, P.C.Ghosh, etal.Tumour targeted delivery of encapsulateddextran - doxorubicin conjugate using chitosan nanoparticles as carrier.Journal ofControlled Release, 2001，74:317_323)、丝裂霉素C-右旋糖酐(齐春莲.丝裂霉素C-右旋糖酐及其制备方法[P].中国.CN1097767A.1995-1-25)等具有多种药理活性的物质，应用也极为广泛。
[0004]右旋糖酐的制备方法主要有生物发酵法和固定化酶法。固定化酶法具有产品易分离、可连续给料、酶可重复使用等优点，但是存在纯化酶难于得到、价格昂贵、产物分子量难以控制等问题，还没能应用于右旋糖酐的工业化生产。目前国内商业化生产右旋糖酐工艺主要采用微生物发酵法，即经肠膜明串珠菌(leuconstoc mesenteroides)发酵鹿糖产生，通过细菌分泌的右旋糖酐蔗糖酶催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖，并聚合葡萄糖生成右旋糖酐。但微生物发酵法生产右旋糖酐过程粘度很大，物料交换不充分，致使蔗糖转化效率低；且产物分子量很大，无法直接应用，通常需要经酸水解后进行乙醇分级沉淀得到不同分子量的右旋糖酐，再制取临床所需的右旋糖酐。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种发酵生产微分子量右旋糖酐的方法。
[0006]本发明所采取的技术方案是:
一种发酵生产微分子量右旋糖酐的方法，包括接种、发酵罐培养，发酵罐培养时，在接种的肠膜状明串珠菌进入对数生长期后，初次添加右旋糖酐水解酶，降低发酵液粘度，同时开始流加蔗糖溶液至设定的总加入量，在蔗糖流加的过程中或流加完毕后，根据所需产物分子量，再次向发酵罐内添加一定量的右旋糖酐水解酶，继续发酵得分子量在20000Da以下的右旋糖酐。
[0007]作为上述方法的进一步改进，发酵罐培养基中蔗糖的初始浓度为80~150g/L，总的蔗糖添加量为200~300 g/L。
[0008]作为上述方法的进一步改进，流加的蔗糖溶液中，蔗糖的浓度为不低于300g/L，更佳的，蔗糖的浓度为300~900g/L。
[0009]作为上述方法的进一步改进，蔗糖的流加速度为10~20g/L.h。
[0010]作为上述方法的进一步改进，初次为降低发酵液粘度而添加的右旋糖酐水解酶在发酵液中的终浓度为0.1~0.5U/ml。
[0011]作为上述方法的进一步改进，再次添加右旋糖酐水解酶的时间为发酵结束前6~12小时，添加量为0.2~1.0U/ml。
[0012]作为上述方法的进一步改进，发酵罐中发酵温度为26~28°C，搅拌速度为50~100 rpm, pH 为 6.0 ~7.0。
[0013]本发明的有益效果是:
本发明方法，可以一次发酵得到微分子量右旋糖酐，右旋糖酐的分子量范围在5000~20000Da可调，无需酸水解和酒精分级沉淀，简化了生产工艺。
[0014]本发明方法的发酵周期短，不超过32小时即可完成发酵。发酵效率高，可将传统工艺的24小时转化130g蔗糖提高到32小时转化210g蔗糖，单位时间蔗糖平均转化可提闻28%以上。
[0015]同时本发明方法的发酵液粘稠度低，流动性好，传质、传热性能好，有利于发酵过程控制。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1~4分别是对照例I~4的发酵曲线；
图5~7分别是实施例1~3的发酵曲线。
【具体实施方式】
[0017]—种发酵生产微分子量右旋糖酐的方法，包括接种、发酵罐培养，发酵罐培养时，在接种的肠膜状明串珠菌进入对数生长期后，初次添加右旋糖酐水解酶，降低发酵液粘度，同时开始流加蔗糖溶液至设定的总加入量，在蔗糖流加的过程中或流加完毕后，根据所需产物分子量，再次向发酵罐内添加一定量的右旋糖酐水解酶，继续发酵得分子量在20000Da以下的右旋糖酐。
[0018]初次添加右旋糖酐水解酶，将发酵液部分水解，使其粘度降低，便于传质，同时使得流加蔗糖溶液变得可能。
[0019]作为上述方法的进一步改进，发酵罐培养基中蔗糖的初始浓度为80~150g/L，总的蔗糖添加量为200~300 g/L。
[0020]作为上述方法的进一步改进，为保证不过分增加发酵液的体积，流加的蔗糖溶液中，蔗糖的浓度为不低于300g/L。更进一步的，蔗糖的浓度为300~900g/L。
[0021]作为上述方法的进一步改进，蔗糖的流加速度为10~20g/L *h。流加的速度可以根据蔗糖的消耗速度、蔗糖的总添加量和目的右旋糖酐的分子量进行调整。
[0022]作为上述方法的进一步改进，初次为降低发酵液粘度而添加的右旋糖酐水解酶在发酵液中的终浓度为0.1~0.5U/ml。 [0023]作为上述方法的进一步改进，再次添加右旋糖酐水解酶的时间为发酵结束前6~12小时，添加量为0.2~1.0U/ml。[0024]作为上述方法的进一步改进，为使肠膜状明串珠菌处于良好的生长环境，发酵罐中发酵温度为26~28°C，搅拌速度为50~100 rpm, pH为6.0~7.0。
[0025]下面结合实施例，进一步说明本发明的技术方案。
[0026]以下实施例中所使用的肠膜状明串珠菌为商品化的肠膜状明串珠菌?eseflieroiofes),菌株保藏编号:GSICC 31208。本领域技术人员可以根据需要选择其他的肠膜状明串珠菌生产菌。
[0027]菌种的活化和放大培养如下:
菌种活化:斜面培养基的组成为=Na2HPO41.4 g/L, KH2PO4 0.3 g/L，蛋白胨2 g/L，蔗糖13(^/1，琼脂158/1，灭菌前？!1值为6.4。121 °C灭菌20min。待冻存于_80°C冰箱的菌种融化后，用接种环挑取少量菌液在斜面培养基中划线，于26°C，静置于全温度恒温培养振荡器中活化培养24h，得到斜面菌种(活化种子液)。
[0028]一级摇瓶种子:将活化种子液以5%的接种量接种于装有47.5mL 一级种子培养基的250 mL摇瓶中，于温度26°C,以IOOrpm培养24h,得到一级种子液。一级摇瓶种子培养基组成为 Na2HPO41.4 g/L, KH2PO4 0.3 g/L，蛋白胨 2 g/L，蔗糖 130 g/L, pH 6.4，121°C灭菌 20
mirio
[0029]二级摇瓶种子:将一级种子液以10 %的接种量接种于3瓶装有90mL —级种子培养基的500mL摇瓶中，于温度26°C，以100 rpm培养24 h，得到二级种子液。二级摇瓶种子培养基组成为 Na2HPO4 1. 4 g/L, KH2PO4 0.3 g/L，蛋白胨 2 g/L，蔗糖 130 g/L, pH 6.4，121 V灭菌20 min。
[0030]以下发酵生产中接种的肠膜状明串珠菌菌液均为上述步骤活化、扩大得到的二级种子液。
[0031]对照例I
发酵培养基的组成为Na2HPO4 1.4 g/L, KH2PO4 0.3 g/L，蛋白胨2 g/L，蔗糖100 g/L, pH
6.4，121°C灭菌 20 min。
[0032]发酵培养条件:将肠膜状明串珠菌菌液以10%的接种量接种于装有2.7 L发酵培养基的5L发酵罐中发酵，温度为26°C，发酵前期，转速为50rpm，在发酵进行至生长对数期16h时向发酵罐内添加右旋糖酐水解酶，使其终浓度为0.6U/mL，pH通过lmol/L的NaOH溶液调节控制在6.5，持续通入微量无菌空气。发酵周期为24h。
[0033]由图1的发酵结果可知，最终的蔗糖转化率为83.7% ;经GPC检测所得的右旋糖酐的重均分子量为8180Da，分布系数(Mw/Mn)为1.59。
[0034]对照例2
发酵培养基的组成为Na2HPO4 1.4 g/L, KH2PO4 0.3 g/L，蛋白胨2 g/L，蔗糖130 g/L, pH
6.4，121 °C灭菌 20 min。
[0035]发酵培养条件:
发酵培养条件:将肠膜状明串珠菌菌液以10%的接种量接种于装有2.7 L发酵培养基的5L发酵罐中发酵，温度为26°C，发酵前期，转速为50rpm，在发酵进行至生长对数期16h时向发酵罐内添加右旋糖酐酶，使其终浓度为0.6U/mL，pH通过lmol/L的NaOH溶液调节控制在6.5，持续通入微量无菌空气。发酵周期为24h。
[0036]由图2的发酵结果可知，最终的蔗糖转化率为90.9% ;经GPC检测所得的右旋糖酐的重均分子量为7474Da，分布系数(Mw/Mn)为1.57。
[0037]对照例3
发酵培养条件:发酵培养基的组成为Na2HPO4 1.4 g/L, KH2PO4 0.3 g/L，蛋白胨2 g/L，蔗糖 150 g/L, pH 6.4，121°C灭菌 20 min。
[0038]发酵培养条件:将肠膜状明串珠菌菌液以10%的接种量接种于装有2.7 L发酵培养基的5L发酵罐中发酵，温度为26°C，发酵前期，转速为50rpm，在发酵进行至生长对数期16h时向发酵罐内添加右旋糖酐酶，使其终浓度为0.6U/mL，pH通过lmol/L的NaOH溶液调节控制在6.5，持续通入微量无菌空气。发酵周期为26h。
[0039]由图3的发酵结果可知，最终的蔗糖转化率为81.7% ;经GPC检测所得的右旋糖酐的重均分子量为7756Da，分布系数(Mw/Mn)为1.60。
[0040]对照例4
发酵培养条件:发酵培养条件:发酵培养基的组成为Na2HPO4 1.4 g/L, KH2PO4 0.3 g/L,蛋白胨 2 g/L,鹿糖 210 g/L, pH 6.4,121°C灭菌 20 min。
[0041]发酵培养条件:将肠膜状明串珠菌菌液以10%的接种量接种于装有2.7 L发酵培养基的5L发酵罐中发 酵，温度为26°C，发酵前期，转速为50rpm，在发酵进行至生长对数期16h时向发酵罐内添加右旋糖酐酶，使其终浓度为0.6U/mL,随着菌体的生长以及右旋糖酐的生成，发酵液再次粘稠，将转速逐渐提升至IOOrpm, pH通过lmol/L的NaOH溶液调节控制在6.5，持续通入微量无菌空气。发酵周期为44h。
[0042]由图4的发酵结果可知，最终的蔗糖转化率为89.6% ;经GPC检测所得的右旋糖酐的重均分子量为153224?a，分布系数(Mw/Mn)为3.37。
[0043]从对照例1、2、3、4的检测结果可知，蔗糖浓度为130g/L时，蔗糖转化率和转化效率均高于其他蔗糖浓度；提高蔗糖浓度时，底物浓度升高，对菌体生长产生抑制，当浓度提高至210g/L时，抑制作用尤为明显，在后期的发酵过程中，发酵液粘度增大，传质、传热性差，蔗糖转化效率低，发酵周期长达44h。因此，以130g/L作为蔗糖流加时的最适初始浓度，而且该浓度发酵对数生长期16h后的蔗糖平均消耗速率约为10g/h/l，该数据可作为下一步流加速度的参考。
[0044]实施例1:
发酵培养基的组成为Na2HPO4 1.4 g/L, KH2PO4 0.3 g/L，蛋白胨2 g/L，蔗糖130 g/L, pH
6.4，121°C灭菌 20 min。
[0045]发酵培养条件:
将肠膜状明串珠菌菌液以10%的接种量接种于装有2.7 L发酵培养基的5L发酵罐中发酵，温度为26°C,发酵前期,转速为50rpm,随着菌体的生长,逐渐增大转速至IOOrpm, pH通过lmol/L的NaOH溶液调节控制在6.5，持续通入微量无菌空气；
发酵16h后，菌体进入对数生长期，向发酵体系中添加右旋糖酐水解酶，使其终浓度为0.2U/mL,同时以45g/h的流速流加浓度为600g/L的蔗糖240g ；
流加完毕后，再次向发酵罐内添加右旋糖酐水解酶，使其终浓度为0.4U/mL，继续发酵至蔗糖不再消耗，发酵结束，整个发酵周期为32h。
[0046]由图5的发酵结果可知，最终的蔗糖转化率为92.3% ;经GPC检测所得的右旋糖酐的重均分子量为5699Da，分布系数(Mw/Mn)为1.48。[0047]实施例2:
发酵培养基的组成为Na2HPO4 1.4 g/L，KH2PO4 0.3 g/L，蛋白胨2 g/L，蔗糖130 g/L，pH6.4，121°C 灭菌 20 min。
[0048]发酵培养条件:
将肠膜状明串珠菌菌液以10%的接种量接种于装有2.7 L发酵培养基的5L发酵罐中发酵，温度为26°C,发酵前期,转速为50rpm,随着菌体的生长,逐渐增大转速至IOOrpm, pH通过lmol/L的NaOH溶液调节控制在6.5， 持续通入微量无菌空气；
发酵16h后，菌体进入对数生长期，向发酵体系中添加终浓度为0.2U/mL的右旋糖酐水解酶，同时以45g/h的流速流加浓度为600g/L的蔗糖360g ；
流加完毕后，再次向发酵罐内添加右旋糖酐水解酶，使其终浓度为0.4U/mL，继续发酵至蔗糖不再消耗结束，整个发酵周期为36h。
[0049]由图6的发酵结果可知，最终的蔗糖转化率为91.2% ;经GPC检测所得的右旋糖酐的重均分子量为9792Da，分布系数(Mw/Mn)为1.75。
[0050]实施例3:
发酵培养基的组成为Na2HPO4 1.4 g/L, KH2PO4 0.3 g/L，蛋白胨2 g/L，蔗糖130 g/L, pH
6.4，121°C灭菌 20 min。
[0051]发酵培养条件:
将肠膜状明串珠菌菌液以10%的接种量接种于装有2.7 L发酵培养基的5L发酵罐中发酵，温度为26°C,发酵前期,转速为50rpm,随着菌体的生长,逐渐增大转速至IOOrpm, pH通过lmol/L的NaOH溶液调节控制在6.5，持续通入微量无菌空气；
发酵16h后，菌体进入对数生长期，向发酵体系中添加终浓度为0.2U/mL的右旋糖酐水解酶，同时以45g/h的流速流加浓度为600g/L的蔗糖360g ；
流加完毕后，再次向发酵罐内添加右旋糖酐水解酶，使其终浓度为0.6U/mL，继续发酵至结束，整个发酵周期为36h。
[0052]由图7的发酵结果可知，最终的蔗糖转化率为91.8% ;经GPC检测所得的右旋糖酐的重均分子量为8433Da，分布系数(Mw/Mn)为1.67。
[0053]实施例1、2、3的发酵结果说明在菌体对数生长期16h时添加终浓度为0.2U/mL的右旋糖酐水解酶，可降低发酵液粘度，增加发酵液的传质、传热性能，有利于流加的蔗糖扩散均匀，更容易被菌体利用。从检测数据可以看出，通过流加蔗糖的方法发酵可将传统工艺的24小时转化390g蔗糖提高到36小时转化750g，单位时间蔗糖平均转化可提高28%以上，可见此方法对提高蔗糖的转化效率效果十分显著；流加结束后再次向发酵罐内添加右旋糖酐水解酶，降解较大分子的右旋糖酐为微分子量的右旋糖酐，从GPC检测结果可以看出，将右旋糖酐水解酶的添加量由0.4U/mL提高至0.6U/mL时，最终获得的右旋糖酐的重均分子量由9792Da相应的降低为8433Da，可见通过改变右旋糖酐酶的添加量来调控所需要的右旋糖酐的分子量，从而实现一步合成所需的微分子量右旋糖酐。
【权利要求】
1.一种发酵生产微分子量右旋糖酐的方法，所述方法包括接种、发酵罐培养，其特征在于:发酵罐培养时，在接种的肠膜状明串珠菌进入对数生长期后，初次添加右旋糖酐水解酶，降低发酵液粘度，同时开始流加蔗糖溶液至设定的总加入量，在蔗糖流加的过程中或流加完毕后，根据所需产物分子量，再次向发酵罐内添加一定量的右旋糖酐水解酶，继续发酵得分子量在20000Da以下的右旋糖酐。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:发酵罐培养基中蔗糖的初始浓度为80~150g/L，总的蔗糖添加量为200~300 g/L。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:流加的蔗糖溶液中，蔗糖的浓度为不低于 300g/L。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于:流加的蔗糖溶液中，蔗糖的浓度为300~900g/L。
5.根据权利要求1、2或4所述的方法，其特征在于:蔗糖的流加速度为10~20g/L*h。
6.根据权利要求1、2或4所述的方法，其特征在于:初次为降低发酵液粘度而添加的右旋糖酐水解酶在发酵液中的终浓度为0.1~0.5U/ml。
7.根据权利要求1、2或4所述的方法，其特征在于:再次添加右旋糖酐水解酶的时间为发酵结束前6~12小时， 添加量为0.2~1.0U/ml。
8.根据权利要求1、2或4所述的方法，其特征在于:发酵罐中发酵温度为26~28°C，搅拌速度为50~100 rpm, pH为6.0~7.0。
【文档编号】C12P19/08GK103993052SQ201410131918
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年4月2日 优先权日:2014年4月2日
【发明者】梁达奉, 曾练强, 张九花, 蚁细苗, 黎志德, 常国炜, 吴兆鹏, 李雨虹, 黄曾慰, 柳颖 申请人:广州甘蔗糖业研究所