一种用于葡萄根瘤蚜抗性的快速鉴定方法
【专利摘要】本发明提供一种用于葡萄根瘤蚜抗性的快速鉴定方法，以待检测的葡萄砧木的DNA为模板，对与葡萄根瘤蚜抗性相连锁的DNA分子标记进行聚合酶链式反应扩增，对扩增获得的产物进行电泳检测，若电泳结果中存在与所述DNA分子标记对应的DNA条带，则说明对应的葡萄砧木具有葡萄根瘤蚜抗性，若电泳结果中不存在与所述DNA分子标记对应的DNA条带，则说明对应的葡萄砧木不具有葡萄根瘤蚜抗性，本发明可以快速区分葡萄砧木有无葡萄根瘤蚜抗性，解决了现有葡萄根瘤蚜抗性鉴定需要特定隔离条件、易受环境条件影响且需要年限较长的问题。
【专利说明】一种用于葡萄根瘤蚜抗性的快速鉴定方法
【技术领域】
[0001]本发明属于葡萄育种【技术领域】，涉及对毁灭性害虫葡萄根瘤蚜抗性的快速检测。【背景技术】
[0002]葡萄根瘤蚜是葡萄的一种毁灭性虫害，主要通过取食根系危害葡萄，常规的植保技术难以防治。目前最有效的预防方法是采用葡萄根瘤蚜抗性砧木，进行嫁接栽培。然而在葡萄砧木育种过程中，选育的砧木是否具有根瘤蚜抗性，需要进行砧木对葡萄根瘤蚜抗性的鉴定，通常采用葡萄砧木根系人工接种葡萄根瘤蚜后统计感染形成的根瘤数量进行鉴定，无根瘤形成或根瘤形成数量少的为具有抗性，根瘤数量多的为感性。但该抗性鉴定需要在特殊的隔离 条件下进行以避免虫害扩散，此外鉴定需要2年以上的重复试验鉴定，耗费时间较长，操作过程中的环境条件可能会影响鉴定结果的准确性。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种用于葡萄根瘤蚜抗性的快速鉴定方法。
[0004]为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案。
[0005]以待检测的葡萄砧木的DNA为模板，对与葡萄根瘤蚜抗性相连锁的DNA分子标记进行聚合酶链式反应扩增，对扩增获得的产物进行电泳检测，若电泳结果中存在与所述DNA分子标记对应的DNA条带，则说明对应的葡萄砧木具有葡萄根瘤蚜抗性，若电泳结果中不存在与所述DNA分子标记对应的DNA条带，则说明对应的葡萄砧木不具有葡萄根瘤蚜抗性。
[0006]所述DNA分子标记为微卫星分子标记。
[0007]所述聚合酶链式反应扩增采用寡聚脱氧核苷酸序列SeqOl和Seq02作为引物对，SeqOl具有如SEQ.1D.N0.1所示的核苷酸序列，Seq02具有如SEQ.1D.N0.2所示的核苷酸序列。
[0008]所述DNA条带的大小约为169bp。
[0009]本发明提供了一种在DNA水平上快速鉴定葡萄砧木对葡萄根瘤蚜有无抗性的方法，可以快速区分葡萄砧木有无葡萄根瘤蚜抗性，解决了现有葡萄根瘤蚜抗性鉴定需要特定隔离条件、易受环境条件影响且需要年限较长的问题。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1为具有根瘤蚜抗性葡萄砧木和不具有根瘤蚜抗性葡萄砧木采用本方法检测的结果图；图1中1、2、3泳道为已知不具有根瘤蚜抗性的葡萄砧木经检测的结果，4、5、6泳道为已知有根瘤蚜抗性的葡萄砧木经检测的结果，M泳道为分子量标准，数字250、200以及150表示DNA条带大小,单位为碱基对(base pair, bp)。
【具体实施方式】
[0011]下面结合附图对本发明作详细说明。[0012]本发明提供一种通过检测与葡萄根瘤蚜抗性性状基因紧密连锁的DNA分子标记来判断葡萄根瘤姆抗性是否存在的方法。本发明基于微卫星(Simple sequencerepeat, SSR)分子标记技术，以本发明提供的寡聚脱氧核苷酸序列SeqOl和Seq02作为SSR引物对，以待检测的葡萄砧木的DNA为模板，对与葡萄根瘤蚜抗性相连锁的特定DNA片段即DNA分子标记进行聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction, PCR)扩增，对扩增获得产物进行电泳检测后，筛选出了大小约为169bp的特定DNA条带(品种间长度无差异)，与葡萄根瘤蚜抗性存在紧密连锁关系，即具有该特定DNA条带的待检测葡萄砧木具有葡萄根瘤蚜抗性，无该特定条带的待检测葡萄砧木无葡萄根瘤蚜抗性。
[0013]本发明的具体步骤如下:
[0014](I)采用常规的CTAB法或SDS法分别提取待检测葡萄砧木的叶片、茎段或根系部位的基因组DNA (即样品DNA)，CTAB法提取样品中DNA的步骤如下:①0.4g左右叶片经液氮冷冻快速研磨成粉末状，转入2mL离心管中；②立即加入65°C预热的CTAB提取缓冲液700 μ L以及β -巯基乙醇20 μ L，剧烈震荡至充分混匀，置65°C水浴中保温30min，取出后冷却至室温；③加等体积的氯仿/异戊醇=24:1，轻轻地颠倒混匀，于室温下12000rpm离心10min，转移上清液至新的离心管中；④经过③后，向上清液中加等体积的氯仿/异戊醇=24:1，轻轻地颠倒混匀，于室温下12000rpm离心10min，转移上清液至新离心管中；?经过④后，向上清液中加入等体积经_20°C预冷的异丙醇，轻轻地颠倒混匀至有白色絮状沉淀出现后，静置于_2(TC 30min使沉淀生成，于4? 12000rpm离心10min,倒掉上清液,保留沉淀物(DNA);⑥加入50 0 μ L预冷的70%乙醇洗涤沉淀物(13000rpm离心lmin)，倒掉上清液，保留沉淀，并重复本步骤一次；⑦加入500 μ L预冷的无水乙醇洗漆沉淀(13000rpm离心lmin)，倒掉上清液，沉淀静置风干后溶于40 μ L ddH20中4°C过夜取溶解后的样品DNA0.5 μ L用琼脂糖凝胶电泳法检测DNA浓度、纯度和降解程度。经检测样品DNA的0D260/280介于1.8-2.0之间、经0.7%的琼脂糖核酸电泳检测DNA样品无杂质、无明显降解的条件下，将各待检测葡萄砧木样品DNA加水稀释至终浓度为lOOng/uL待用；
[0015](2)将按照本发明提供的寡聚脱氧核苷酸序列seqOl和seq02合成的单链寡聚DNA，分别加水稀释成lOumol/L水溶液，序列分别为:
[0016]SeqO1:5 ’ -TGTTGGTGTGTGTTTGTACGTG-3，
[0017]Seq02:5，-TGTTATTGAGTTAGAATGAAGTGTTGG-3，
[0018](3)在每个 0.2mL 薄壁 PCR 管中加入:2uL2mmol/L 的 dNTP, 1.7uL25mmol/L 的MgCl2, 2ullOX taq缓冲液，步骤(2)配制的seq01、seq02溶液各2.0uL,步骤(1)配制的待测样品DNA溶液2uL,加入Taq聚合酶I个单位,加水至总体积20ul，轻微震荡混匀，瞬时离心；
[0019](4)把上述PCR管置于PCR仪上，执行下述程序:94度，5分钟；94度，60秒，55度，90秒，72度，90秒，循环35次；72度，5分钟；程序结束；
[0020](5)把PCR管中的产物进行6%的聚丙烯凝胶电泳或2.5%的琼脂糖凝胶电泳，检查不同待测样品DNA PCR反应中产生的DNA条带；
[0021 ] 本发明选择了已知具有根瘤姆抗性的葡萄站木品种(包括Ric1、Boerner、V.Riparial81g等)和已知无根瘤蚜抗性的葡萄砧木品种(包括华佳8号、山葡萄、刺葡萄等)共计30余种进行了试验，其中一次试验中(参见图1 )，泳道I~3依次为华佳8号、山葡萄、刺葡萄；泳道4~6依次为Ric1、Boerner> V.Riparial81g,以上材料均米集于西北农林科技大学葡萄种质资源圃；
[0022](6)根据试验结果可以确定，具有根瘤蚜抗性的葡萄砧木能够产生图1中箭头所示位置的特定大小(169bp)的DNA片段所形成的条带，不具有根瘤蚜抗性的葡萄砧木不能产生相应的所示位置的特定大小DNA片段所形成的条带；若加入了某一待检测DNA的泳道有169bp这一特定大小的DNA条带产生，则该待测样品DNA为来源于具有根瘤蚜抗性的葡萄砧木植株，若无特定大小(169bp)的DNA条带产生，则该待测样品DNA为来源于无根瘤蚜抗性的葡萄砧木植株。
[0023]采用无性繁殖的葡萄砧木可以用叶片、根系、茎段在任何季节提取DNA进行检测，取样部位不影响检测结果的一致性，取样部位和取样时间不影响检测结果。
[0024]本发明可以用 于葡萄根瘤蚜抗性性状的DNA分子标记辅助选择育种，用于葡萄根瘤蚜抗性育种中的抗性材料的早期选择和非抗性材料的淘汰；同时，以该特定的DNA条带为路标，可以进行葡萄根瘤蚜抗性基因的精细定位或通过染色体步移法接近葡萄根瘤蚜抗性基因，从而为葡萄根瘤蚜抗性基因的克隆打下基础。
【权利要求】
1.一种用于葡萄根瘤蚜抗性的快速鉴定方法，其特征在于:包括以下步骤: 以待检测的葡萄砧木的DNA为模板，对与葡萄根瘤蚜抗性相连锁的DNA分子标记进行聚合酶链式反应扩增，对扩增获得的产物进行电泳检测，若电泳结果中存在与所述DNA分子标记对应的DNA条带，则说明对应的葡萄砧木具有葡萄根瘤蚜抗性，若电泳结果中不存在与所述DNA分子标记对应的DNA条带，则说明对应的葡萄砧木不具有葡萄根瘤蚜抗性。
2.根据权利要求1所述一种用于葡萄根瘤蚜抗性的快速鉴定方法，其特征在于:所述DNA分子标记为微卫星分子标记。
3.根据权利要求1所述一种用于葡萄根瘤蚜抗性的快速鉴定方法，其特征在于:所述聚合酶链式反应扩增采用寡聚脱氧核苷酸序列SeqOl和Seq02作为引物对，SeqOl具有如SEQ.1D.N0.1所示的核苷酸序列，Seq02具有如SEQ.1D.N0.2所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述一种用于葡萄根瘤蚜抗性的快速鉴定方法，其特征在于:所述DNA条带的大小为 169bp。
【文档编号】C12Q1/68GK103937887SQ201410131800
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月2日 优先权日:2014年4月2日
【发明者】张军科, 张娟 申请人:西北农林科技大学