专利名称：制造抗钙化抗性生物修复组织的方法
发明的背景本发明总地涉及对体内钙化作用有抗性的材料，特别是涉及制备钙化抗性生物材料如适于在活体内植入的生物修复组织的方法。
每年要在病人体内植入100,000个以上心瓣膜修复物。瓣膜置换外科通常只是指治疗心脏瓣膜疾病。目前使用的置换瓣膜包括可由整体合成聚合材料如聚氨酯组成的机械瓣膜、衍生于牛心包膜或猪主动脉瓣的瓣膜、以及主动脉同种移植物。
使用机械瓣膜常常并发血栓形成和组织过度生长而使瓣膜功能不全。与机械瓣膜修补物相比，生物修复心脏瓣膜改善了血栓形成性和血液动力学性质。然而，钙化是导致从猪主动脉瓣或中心包膜制造的生物修复心脏瓣膜之临床功能不全的最常见原因。人主动脉同种移植移植物既使比生物修复心脏瓣膜速率较慢，但也已观察到涉及瓣膜组织及相邻主动脉壁的病理性钙化。病理性钙化导致狭窄和/或回流形成的瓣膜功能不全，因而需要重新移植。因此，由于生物修复心脏瓣膜和同种移植物是经受钙化的主体，而使这些组织的使用受到限制。事实上，已发现儿科病人有加速的钙化速率，因而这一年龄组病人忌用生物修复性心脏瓣膜。
不幸的是，病理性钙化还进一步累及合成的血管移植物及其他人工心脏装置和心室辅助系统的使用，因为它影响用于生产该装置的合成聚合物的柔曲性。
有关心血管组织病理性钙化的机制尚不完全明了。总地说来，术语“病理性钙化”是指磷酸钙矿物盐的不希望的沉积。钙化可能是由于宿主因素、移植物因素及机械压力等外在因素导致的。有某些证据提示，钙的沉积与失去生命力的细胞，特别是细胞膜有关，其中负责维持低细胞内钙水平的钙泵(Ca+2-Mg+2-ATPase)不再发挥功能或者是功能低下的。已观察到钙化随着作为羟基磷夹石存在的钙和磷的积聚而开始，其发展成小节结并最终导致瓣膜功能不全。
在移植前制备生物修复组织一般包括对组织上和组织中的分子特别是胶原进行交联处理，以使之稳定化而足以对抗继后的体内酶降解。已为此目的使用了各种醛类物质如乙醛酰、甲醛和戊二醛。但优选的是戊二醛。除了固定组织外，戊二醛还是好的稳定剂，并且可降低组织的抗原性。迄今为止，戊二醛只是用于制备植入组织，可在含水和生理pH条件下使用的有效交联剂。不幸的是，现已知道戊二醛可促进钙化。因此，本技术领域中需要一种逆转交联剂如戊二醛之钙化促进作用的方法。特别值得期望的是，在制备临床级生物材料的已有程序中加入抗钙化剂。
已研究了非醛交联剂例如聚环氧化物(如由Nagasi Chemicals，Osaka，Japan以商标Denacol出售的聚甘油聚缩水甘油醚)，但还没有获得足以证明聚环氧化物交联之组织的体内效力的研究结论。
有关抑制生物修复组织钙化的研究主要集中于用去污剂或二膦酸盐抗钙化剂预处理组织上。已证明用非共价连接的去污剂如十二烷基硫酸钠(SDS)，和共价连接的去污剂如氨基油酸进行去污剂预处理，对于暴露于循环血液的材料是有效的。但由于血液-材料相互作用，去污剂和二膦酸盐趋向于洗去被植入的生物修复组织。因此，这些处理只不过是延迟不可避免的钙化过程的发生。所以也需要提供一种能使经受体内病理性钙化作用的生物修复性心脏瓣膜及其他可植入的生物材料长期有钙化抗性的方法。
另外，去污剂对组织的不利影响可导致作为材料强度、有用期限和完整性的重要测量标准的胶原变性温度或皱缩温度(Ts)的降低。在某些情况下，使用去污剂可导致局部毒性。因此，需要有一种赋予生物修复组织以不伴有去污剂之有害作用的抗钙化性质的有效方法。
再者，如根据被植入样品的钙含量所测知的，所有前述技术仍导致某种程度的体内病理性钙化。因此，需要有一种在更大程度上抑制钙化的处理方法。
在处理生物材料过程中使用醇是已知的，但一般都是限于将其用作溶剂和/或灭菌剂。例如，已将醇用于灭菌冲洗中并用作贮存溶剂。但以前从没有教导或提高乙醇对防止病理性钙化有任何作用。在已有处理方法中使用这种已知的化合物使生物修复组织具有钙化抗性应是有利的。
因此，本发明的一个目的提供一种处理生物材料，特别是戊二醛预处理的生物修复组织，以使该生物材料对体内病理性钙化具有抗性的方法。
本发明的另一个目的是提供一种处理生物材料以使之具有长期的或延长的抗体内病理性钙化抗性的方法。
本发明的再一个目的是提供一种处理生物材料以使该生物材料产生抗体内病理性钙化抗性的方法，其可很容易并入已有的处理这些材料的方法中，例如将允许继续使用交联剂戊二醛。
本发明的再一个目的是提供一种处理生物材料以使之对体内病理性钙化具有抗性的方法，该方法对组织的物理或机械性质只有很小(如果有的话)的有害影响。
本发明的再一个目的是提供适于植入哺乳动物体内的改善了抗体内病理性钙化作用之抗性的生物材料。
发明的概要本发明实现了前述和其他一些发明目的，其提供了用醇处理生物材料，特别是戊二醛预处理的生物修复组织，如猪主动脉瓣组分或牛心包膜，以使该生物材料产生抗钙化抗性的方法。醇较好是低级脂族醇(C1至C3)，如甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇。在一优选实施方案中，醇是乙醇。
术语“生物材料”是指可得自不同动物，特别是哺乳动物的胶原材料。生物材料一般是适于移植的材料，如生物修复组织等，但本发明不只限于这些。特定实例包括但不只限于心脏瓣膜特别是猪心脏瓣膜、主动脉根、壁、和/或小片；牛心包膜；结缔组织衍生的材料如硬脑膜；同种移植组织如主动脉同种移植物和隐静脉旁路移植物；肌腱、韧带、皮肤瓣、动脉、静脉等。当然，任何其他已知的或将会已知适于在活体内留置使用的生物衍生材料均将包括于本发明实践范围内。
根据本发明的优选实施方案，用戊二醛预处理生物材料。因此，可将本发明的醇处理步骤并入制备可植入之生物修复组织的已有方法和已知的标准方法学中。当然，用其他交联剂预处理生物材料也将包括于本发明范围内。在那些用戊二醛交联生物材料的实施方案中， 可使用任何一种进行戊二醛预处理的技术。在一典型戊醛预处理方法中，在适于交联生物材料上或材料中之分子的条件下，使生物材料暴露于和/或贮存在缓冲的戊二醛溶液中。例如，可使生物材料在适当温度(大约4℃至25℃)和pH(大约6至8，较好是7.1至7.4)条件下暴露于戊二醛。预处理溶液中典型的戊二醛浓度范围为大约0.2％至0.8％(W/V)或更高，但较好是0.6％。
根据本发明的方法，处理溶液中醇的量大于约50％(V)，较好为60％至80％。生物材料与醇接触一段足可使生物修复组织具有抗体内病理性钙化之抗性的时间，例如从大约20分钟(即乙醇扩散到生物修复组织中所需的时间)到96小时以上。对于某些生物材料，过长时间接触醇可导致醇之抗钙化作用的降低，或者可能使组织再水合。
本文所述实施方案中指出的暴露时间是作为举例提出的，并可以由本领域技术人员加以改变。对于本发明的将生物材料浸于醇的液体处理溶液中的实施方案来说，接触时间较好为大约24至96小时。但如下文将要述及的如提供适当的贮存条件，较长的接触时间也是本发明所预期的。应提到的是，在所提示的期间内没有观察到对生物修复组织的有害影响。
生物材料暴露于醇的方式包括但不只限于醇的蒸气、等离子体、液体和/或冷冻应用。无论使用什么暴露方法，时间都应足以促进抑制钙化所需的醇-胶原的相互作用，只要不因醇引起组织的不可恢复的再水合即可。
按照本发明的方法，醇处理溶液较好是液体，并且是水基的，即含有50％以上醇，较好含有60％至80％醇(体积)的，缓冲到pH6.0-8.0，较好pH7.0至7.6，更好pH7.4的水溶液。或者，在本发明实践中可利用两种或多种有机溶剂的混合物，条件是有机溶剂的合并体积大于约45％，较好大于约50％。例如，已证明约40％乙醇和约40％丙酮的混合物是有效的(参见实施例7)。
用于本发明实践的适当缓冲液是具有足以保持生理上可接受之pH的缓冲容量，并且不引起对生物材料之有害作用或干扰处理过程的缓冲液。可以举例的缓冲液包括但不只限于磷酸盐缓冲盐水和有机缓冲液，如N-N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙烷磺酸(HEPES)或3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)；以及包括硼酸盐、碳酸氢盐、碳酸盐、可卡酸盐的缓冲液。
在本发明的优选实施方案中，当生物材料暴露于醇处理溶液期间要振荡或搅动该生物材料。可用任何方式，例如使用轨道摇动器或摇动器台架完成振荡。一般在室温(25℃)下完成醇处理过程。但不会对组织造成损害的任何温度，例如4℃至大约37℃均适于完成本发明。
虽然本文的讨论涉及到处理溶液中的醇浓度例如为50％或更高，但应理解为，醇例如乙醇可迅速扩散到组织中，从而溶液中的醇浓度大约是与醇在组织中的区域浓度相同的。因此，术语“暴露”应被广义理解为足以包括例如由于四乙酯的水解作用所产生的醇在被移植组织中的原位释放。
在本发明的优选实施方案中，应在移植贮存之前清洗为减低钙化作用而用醇处理过的生物材料，以便除掉多余的醇或在生物材料处理过程中产生或使用过的其他有害成分，例如在戊二醛预处理中产生的醛片段。本文所使用的术语“清洗”包括使生物材料经受清洗溶液处理，包括连续地或分批地处理，其中将生物材料置于可以定期去掉并在预定间隔期更换成新鲜溶液的清洗液中。在清洗期间，最好摇动组织或断续地搅拌之，以确保清洗液的均匀分布。为完成清洗，可以使生物材料经受清洗液使用pH7.4的HEPES缓冲液的处理。举例来说，清洗可包括将生物材料浸入可在大约5至15分钟期间更换3次的新鲜清洗液中。另外，也可以在24小时清洗期间，以至8小时或更短的间隔期更换清洗液。在一优选实施方案中，24小时清洗期间里每1小时换一次HEPES缓冲液。本文中将较长时间清洗称为“洗涤”。
可举例的清洗溶液包括生理上适用的溶液，例如水、盐水、PBS、HEPES缓冲盐水、林格氏乳酸盐溶液(pH7.4)、碳酸氢钠溶液(pH7.4)、Tris(pH7.4)和咪唑溶液(pH7.4)。
清洗之后，即准备将经过处理的生物修复组织用于移植，或者可将其灭菌并贮存备用。在常规用于长期贮存临床级生物修复物的标准戊二醛溶液中贮存，可以部分地损害由本发明的醇处理所达到的有利效果(参见图2)。根据本发明的某些实施方案，较好以足以维持钙化抑制作用和/或无菌的量储存于戊二醛的乙醇溶液中。在一优选实施方案中，将经过处理的生物材料贮存于含有戊二醛的缓冲醇溶液中，其中醇含量一般大于约60％，较好大约60％至80％，并且戊二醛含量小于约0.5％，较好大约0.2％到0.5％。在一特别优选的实施方案中，贮存溶液含60％乙醇和0.2％戊二醛(参见表6)。
在本发明的其他实施方案中，将已按照本发明的方法处理的生物材料贮存于无醛环境中。在优选实施方案中，将经过处理的生物修复材料放在无菌袋内并对其进行灭菌照射如γ射线照射。当然，本发明的乙醇处理是与许多其他灭菌防腐剂和/或已知的，或可由本领域技术人员建立的技术相配合的。
根据本发明的其他方法实施方案，醇处理溶液也可含有一种或多种附加抗钙化剂，其中包括但不只限于浓度范围在0.1M至0.001M的金属阳离子如Al+3或Fe+3的可溶性盐。例如，适合用作为本发明实践中其他抗钙化剂的水溶性铝盐包括但不只限于氯酸铝、乳酸铝、硫酸钾铝、硫酸钠铝、硫酸铝、硝酸铝和氯化铝。在一优选实施方案中，可溶性盐是浓度为0.1M的AlCl3。另外，可溶性铁盐，如氯化铁、硝酸铁、溴化铁、乙底酸钠铁、硫酸铁和甲酸铁也包括在本发明实践范围内。当然，可溶于处理溶液之溶剂系统中的任何铝盐或铁盐均可用于本发明的实践。
本发明的另一个实施方案包括已按本发明的方法生产的生物材料。在本发明的优选实施方案中，这些生物材料表现出改善的抗钙化性质，和/或对体内病理性钙化的长期抗性。
附图的简述描述结合下述附图阅读下文中给出的详细说明将有利于理解本发明，附图中
图1显示在按本发明方法处理的猪主动脉瓣样品(尖端)的大鼠皮下模型中猪主动脉瓣膜钙化的抑制作用；图2显示按本发明方法处理的猪主动瓣样品在大鼠皮下植入21天后的钙含量(μg/mg)。
图3显示各种猪主动脉瓣样品植入羊体内150天后的钙含量(μg/mg)。
图4显示戊二醛预处理的猪主动脉瓣膜的14C-胆固醇含量(μg/mg)，并与已按照本发明的方法用乙醇水溶液(40％和80％)或去污剂(1％十二烷基硫酸钠，SDS)处理的戊二醛预处理的主动脉瓣膜相比较。
图5显示已经受各种已知可从组织中除去脂肪的溶剂处理的戊二醛预处理的猪主动脉瓣样品的钙化程度；图6显示经受各种乙醇处理和贮存过程的猪主动脉瓣样品的Ts(℃)。
发明的详细描述给出下述几个按照本发明的原则生产钙化抗性生物材料的特定举例说明性技术。虽然所给出的实施例都是针对制备钙化抗性心瓣膜的，但本文所描述的技术也适用于产生各种其他生物材料，特别是适于移植的修复或生物修复组织。
再者，虽然这些结果是以大鼠皮下移植物和羊生物修复心脏瓣膜置换研究的形式提出的，但应说明的是这些动物模型系统可产生与见于人体组织临床病理移植物者十分相似的钙化沉积物。已有文献报告，光学显微镜和电子显微镜研究证明这些动物模型与人类病理学是一致的。
从St.Jude Medical，Inc.，St.Paul.MN和Medtronic，Inc.，Irvine，CA得到伸展或自然外形(无伸展)的戊二醛预处理的猪主动脉心脏瓣膜，并用于下文给出的实施例中。一般说来，生物材料在收获后经稳定化处理并保存于戊二醛中，例如加在缓冲液中的0.5％戊二醛溶液中。
实验部分实施例1进行剂量反应研究并将结果图解显示于图1中。将戊二醛预处理的猪主动脉瓣样品在浓度范围为0％(对照)至80％的乙醇水溶液中浸渍24小时。用HEPES(0.05M)将乙醇溶液缓冲到pH7.4。将经过处理的猪主动脉瓣样品植入在断奶大鼠(雄性，CD，Sprague-Dawley，体重50-60g)腹壁中切开的两个皮下小袋中。21天后，除去样品并测定样品中Ca+2离子水平以检查钙化程度。与戊二醛预处理的对照样品相比，50％或更大浓度的乙醇实质上消除了猪主动脉瓣样品中的钙积聚。
实施例2对猪主动脉瓣膜样品进行研究，以确定为达到最佳抗钙化效果所必需的暴露于乙醇处理溶液的时间。图2显示在移植到大鼠皮下小袋中21天后，已暴露于80％乙醇24小时和72小时的，戊二醛预处理的猪主动脉瓣膜尖端样品的钙含量(μg/mg)。一般说来，暴露于乙醇72小时比暴露24小时产生更多的钙积聚。然而，暴露于乙醇72小时后钙化水平依然总是低于对照组(戊二醛预处理的猪主动脉瓣膜尖端)。对照组样品的钙含量为178.2±6.166μg/mg干组织，而暴露于80％乙醇24小时的样品，在于大约10至15分钟内每次用100ml HEPES缓冲盐水(pH7.4)清洗3次后，钙含量为2.248±0.186μg/mg。此代表99％抑制率，即实质性抑制。
参见图2，还显示继后清洗并贮存于含戊二醛溶液中的乙醇处理的猪主动脉瓣样品的钙含量。在一个例子(″Glut.Rinse″)中，将乙醇处理的样品在3份100ml 0.2％戊二醛缓冲溶液(pH7.4，HEPES)中清洗约15分钟。在第二个例子(″Glut.Storage″)中，将乙醇处理的样品在0.2％戊二醛缓冲溶液(pH7.4，HEPES)中贮存30天，再于移植前用HEPES缓冲盐水冲洗。与没有继续暴露于戊二醛的保存的样品相比，在含戊二醛溶液中贮存或与该溶液接触的样品有更多的钙积聚。
实施例3如下示表1中报告的，在1天和60天大鼠皮下移植物研究中发现，清洗或洗涤对钙化水平有显著的影响。表1给出了一组猪主动脉心脏瓣膜样品在移植到大鼠皮下小袋中后的钙含量。未处理的但经戊二醛预处理的猪主动脉心脏瓣膜样品得自St.Jude Medical，Inc.(对照)，经过处理的戊二醛预处理的猪主动脉心脏瓣膜已与80％乙醇接触24小时。然后对80％乙醇处理的样品进行最后的“洗涤”(在pH换一次洗涤溶液)或“清洗”(限定为清洗3次，每次用100ml pH7.4 HEPES缓冲盐水洗1分钟)。将用80％乙醇附加处理的样品贮存在80％乙醇和缓冲到pH7.4(HEPES)的2％戊二醛的溶液中贮存一个月，然后进行“清洗”或“洗涤”。
表1处理组 21天Ca+2(μg/mg) 60天，Ca+2(μg/mg)对照 183.15±0.03236.3±6.1480％乙醇/清洗11.1±6.04 14.6±10.580％乙醇/洗涤5.16±1.72 1.87±0.2980％乙醇/3.13±1.67 22.9±8.14戊二醛贮存/清洗80％乙醇/4.11±2.4 18.3±8.31戊二醛贮存/洗涤将戊二醛预处理的牛心包膜样品在80％乙醇中处理后洗涤24小时。21天后皮下移植物的钙含量为2.95±0.78μg/mg。相对的，未经处理的对照样品的钙含量为121.16±7.49μ/mg。
实施例4对戊二醛预处理的猪主动脉心脏瓣膜样品进行研究，以估计本发明的方法对抗体内组织钙化的效力。戊二醛预处理的猪心脏瓣膜样品得自St.Jude Medical，Inc.(St.Jude和Medtronic，Inc.，(HancockI)。对照样品没有经受醇处理。对实验样品进行72至96小时的80％乙醇处理。对照和实验样品作为二尖瓣移植物移植到幼羊体内。移植后5个月，切掉瓣膜并分析钙含量。结果示于图3中，该解显示在150天时被移植样品的钙含量(μg/ml)。显示乙醇处理完全抑制了钙化。为了进行比较，其中显示了新鲜的，未经处理的猪主动脉心脏瓣膜样品的钙含量。
实施例5虽然不希望拘泥于特定理论，但推测是乙醇不可逆地改变戊二醛预处理之生物修复组织的无生命力的膜。中子NMR研究显示了乙醇处理后改变了与水的联系。表2显示对新鲜猪主动脉心脏瓣膜样品，以及戊二醛预处理的样品和已按照本发明的原则在80％乙醇中处理的戊二醛预处理的样品进行中子NMR检测(7.5Tesla装置)的T1和T2松弛时间。用乙醇处理显著地延长了T1和T2松弛时间，表明存在一个很不利于磷酸钙沉淀的富水环境。
表2处理 T1(秒) T2(毫秒)未处理的1.84±0.190.14±0.1戊二醛 1.78±0.310.30±0.05乙醇2.36±0.360.42±0.027
猪主动脉心脏瓣膜片分别为未经处理的；用0.6％戊二醛处理的；用80％乙醇处理的。所有处理溶液均缓冲到pH7.4。'实施例6乙醇处理几乎完全除去了组织中的所有胆固醇和磷脂，并阻止血浆脂蛋白摄入生物材料中。在40％乙醇、80％乙醇和去污剂(1％SDS)中将戊二醛预处理的猪主动脉瓣膜(尖端)的样品处理24小时。使用未经处理的，戊二醛预处理的猪主动脉瓣样品作为对照。将样品放在含牛血清的14C-胆固醇溶液中保持24小时。图4显示可经处理的样品和对照样品的胆固醇含量(μg/mg)。发现经受80％乙醇处理24小时的样品减少了胆固醇的摄入，表明乙醇处理对材料摄取血浆脂蛋白的持久性影响。去污剂处理的组织则表现有高得多的胆固醇摄入量。
表3中给出在缓冲的乙醇水溶液或氯仿-甲醇混合物中处理24小时之戊二醛预处理的猪主动脉瓣样品的总胆固醇(CS)和磷脂(PL)含量。
表3组总CS*(nmole/mg) PL*(nmole/mg)对照(戊二醛) 13.34±0.4117.24±0.8540％乙醇 13.96±0.7116.5±1.4960％乙醇 0.30±0.05 4.93±1.9180％乙醇 0.14±0.02 1.08±0.111％SDS 1.40±0.1 0.94±0.052∶1CHCl3∶甲醇0.10±0.0 0.57±0.0780％甲醇 0.28±0.02 2.62±0.3680％丙酮 0.12±0.02 1.94±0.3280％乙腈 0.16±0.04 2.76±0.28*平均值土SEM(N＝5)如表3中所示，接触80％乙醇实际上可除去猪主动脉瓣组织中含有的所有胆固醇和磷脂。与60％或更大浓度的乙醇相比，去污剂(SDS)对组织胆固醇和磷脂含量具有显著的降低作用。
实施例7还研究了已知能萃取胆固醇和脂类物质的其他溶剂的可能的抗钙化作用。使戊二醛预处理的猪主动脉瓣尖端样品(对照)与80％甲醇、80％异丙醇、80％乙醇、氯仿/甲醇(2∶1)、80％乙腈及80％丙酮接触24小时。将样品移植到大鼠的腹壁皮下袋中，21天后检测其中钙含量。结果图解显示于图5中。虽然甲醇和丙酮表现有与乙醇差不多的抗钙化作用，但使用这些溶剂存在一些问题。其中残余的甲醇在移植环境中有潜在毒性，而丙酮则可能是致癌的。令人惊奇地发现，用于提取脂类的氯仿/甲醇标准溶液的作用比乙醇小得多。
在另一相关研究中，用40％乙醇和40％丙酮观察了联合的浓度影响。这些溶剂的45％浓度个别使用均无效(参见图1中所示45％乙醇的效力)。经受了40％丙酮处理的猪主动脉心脏瓣膜样品，在移植到大鼠皮下袋中21天后，钙含量为141.07±28.91μg/mg。而经受40％乙醇和40％丙酮混合物处理之样品的钙含量为1.54±0.16μg/mg。在本发明实践中可利用两种或多种溶剂的混合物，条件是有机溶剂的合并体积大于50％。
实施例8如图6中所示，作为材料强度，使用期限及完整性之重要测量标准的Ts，几乎完全不受本发明的乙醇处理的影响。图6中同样显示经受各种的处理，特别是24小时暴露于乙醇(80％或100％)和去污剂(SDS)之戊二醛预处理的猪主动脉瓣(尖端)样品的胶原变性温度(℃)。这些处理程序包括80％乙醇没有清洗；100％乙醇没有清洗；100％乙醇处理后用HEPES缓冲盐水洗涤1小时；80％乙醇处理后用HEPES缓冲盐水清洗并在0.2％戊二醛中贮存24小时；1％SDS处理后用HEPES缓冲盐水清洗；1％SDS处理后用HEPES缓冲盐水洗涤1小时。对照组是由St.Jude Medical，Inc.提供的戊二醛预处理的猪主动脉瓣样品，得到后直接使用(“Glut.”)或经过冲洗并在PH7.4 HEPES缓冲盐水中贮存24小时后用于实验(“Glut./缓冲液”)。使用差分扫描量热法获得数据。乙醇处理，然后用合水溶液清洗及适当的贮存条件对Ts均没有影响，而去污剂处理则显著降低Ts。
使用差分扫描量热法确定使与80％乙醇接触24小时后的猪主动脉瓣样品再水合所需要的时间。本文使用的术语“再水合”是指使Ts恢复到对照组(在PH7.4 HEPES缓冲盐水中清洗24小时的戊二醛预处理的猪主动脉瓣样品)的值。经过乙醇处理的样品与HEPES缓冲盐水(PH7.4)接触不同的时间，即从淋洗(即倾倒清洗液使之流过样品)及1小时浸渍。结果示于表4中。2分钟清洗使被处理样品的Ts回复到与对照样品的Ts值在统计学上没有明显差异的值。
表4处理清洗时间 Ts(℃)对照24hrs 88.33±0.5680％EtOH*清洗84.06±0.3280％EtOH1min. 84.49±0.3980％EtOH2min. 87.41±0.2380％EtOH5min. 87.8580％EtOH10min. 87.5480％EtOH1hr 87.38±0.26*EtOH＝乙醇实施例9如完全氨基酸分析和化学分析用电子能谱法(ESCA)所证明的，醇处理没有影响猪主动脉瓣的总蛋白质组成和瓣膜形态学。事实上，醛处理提高猪主动脉瓣小片的表光光滑度和畸型改变，导致与新鲜小片差不多的表面化学改变。相反，戊二醛预处理(对照)或去污剂(SDS)处理的组织显示有明显差异。下列表5给出了在所指出的溶液中浸渍24小时的猪主动脉瓣样品表面碳(Cls)、氮(Nls)和氧(Ols)浓度(％)的ESCA数据。
表5组 原子浓度(％)OlsNlSCls新鲜组织20.41 10.06 69.5280％乙醇21.89 11.93 66.1840％乙醇16.45 7.78 75.76戊二醛固定的14.46 7.22 78.321％SDS 19.03 7.37 73.62∶1CHCl3/甲醇 22.71 15.85 61.44将乙醇处理的，戊二醛预处理的猪主动脉瓣与戊二醛预处理的猪主动脉瓣的全氨基酸分析结果相比较，表明乙醇处理没有真正影响氨基酸组成，即乙醇处理没有从生物修复组织中提取任何有意义量的任何蛋白质成分。
对机械和生理瓣膜功能的体外功能试验证明，按照本发明用乙醇处理可改善瓣膜的机械性能。
实施例10在举例说明本发明其他一些实施方案的一系列实验中，以各种程序用60％乙醇处理戊二醛预处理的猪主动脉瓣膜样品。虽然术语“猪主动脉瓣膜”总地包括瓣膜前尖或小片，以及主动脉壁部分，但上文报告的前述实验基本上是用瓣前尖组织进行的。本实验中，已分离了两种类型的组织并分别在表6中给出了有关数据。
使用得自St.Jude Medical，Inc.的戊二醛预处理的生物修复心脏瓣膜样品作为对照。然后使戊二醛预处理的组织样品经受60％乙醇，或60％乙醇和0.1M AlCl3处理24小时。乙醇处理后，在中性缓冲液特别是PH7.4 HEPES中淋洗组织。清洗后，将组织样品除菌并贮存4天。在一定贮存过程中，使组织包在中性缓冲液中并进行灭菌照射。在其他贮存程序中，则将组织贮存于60％乙醇和戊二醛(0.2％或0.5％)中。在另一些贮存过程中，贮存溶液可另外含有0.1M AlCl3。
将按上述方法制备的组织样品移植到大鼠皮下的小袋中并于21天后分析钙含量。结果示于下列表6中。
表6
Glut.＝戊二醛 EtOH＝乙醇如表6中所示，在生物材料特别是主动脉壁组织的处理溶液或贮存溶液内加入Al+3，可比用乙醇溶液处理对钙化有更大的抑制作用。
实施例11使戊二醛预处理的猪主动脉壁组织样品经受0.1M FeCl3、0.01M FeCl3、80％乙醇、80％乙醇和0.1M FeCl3、80％乙醇和0.01M FeCl3之含水(PH7.4 HEPES缓冲的)处理溶液的24小时处理。处理后，在三份100ml中性缓冲液特别是PH7.4的HEPES中清洗组织。使用得自St.Jude Medical，Inc.的戊二醛预处理的猪主动脉壁组织样品作为对照。将按上述方法制备的组织样品移植到腹部皮下小袋中并于21天后分析钙含量。结果示于下列表7中。
表7
表7表示结果证明，在醇处理和/或贮存溶液中掺入Fe+3离子可使猪主动脉壁样品产生改善的抗钙化抗性。
虽然已在特定实施方案和应用方面描述了本发明，但本领域技术人员可基于这些教导在不超出本发明权利要求范围或背离本发明精神的前提下得出其他实施方案。因此，应明确的是，本公开中给出的附图和文字描述旨在有利于理解本发明，而不构成对本发明范围的限制。
权利要求
1.处理生物材料的方法，该方法包括使生物材料暴露于醇的步骤，暴露时间足以使生物材料产生抗钙化抗性。
2.权利要求1的方法，其中使生物材料产生抗钙化抗性是使它产生抗体内病理性钙化的抗性。
3.权利要求1的方法，其中所说的暴露步骤包括将生物材料浸于醇的液体处理溶液中。
4.权利要求3的方法，其中醇是以大于处理溶液体积大约50％的量存在的。
5.权利要求3的方法，其中醇是以约占处理溶液体积60％至80％的量存在的。
6.权利要求3的方法，其中处理溶液是水基的。
7.权利要求3的方法，其中处理溶液包括有机溶剂。
8.权利要求3的方法，其中处理溶液进一步含有抗钙化剂。
9.权利要求8的方法，其中抗钙化剂是选自一组可溶于处理溶液的Al+3和Fe+3盐的多价金属阳离子。
10.权利要求9的方法，其中抗钙化剂是浓度范围为大约0.1M至0.001M的AlCl3。
11.权利要求1的方法，其中醇是水溶性脂族醇。
12.权利要求12的方法，其中水溶性脂族醇含有1-3个碳并选自甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇。
13.权利要求12的方法，其中水溶性低级脂族醇是乙醇。
14.权利要求1的方法，其中生物材料是得自哺乳动物的胶原材料。
15.权利要求14的方法，其中胶原材料选自牛心包膜、猪主动脉心脏瓣膜、隐静脉旁路移植物、主动脉同种移植物和硬脑膜。
16.权利要求14的方法，其中生物材料是已被交联的。
17.权利要求16的方法，其中生物材料是与戊二醛交联的。
18.权利要求1的方法，其中足以使生物材料产生抗钙化抗性的时间是至少约20分钟。
19.权利要求18的方法，其中足以使生物材料产生抗钙化抗性的时间是约24至96小时。
20.权利要求1的方法，其中提供了进一步清洗被处理的生物材料以除去过多乙醇或其他有害材料的步骤。
21.权利要求1的方法，其中提供了进一步在无菌的、无戊二醛环境中贮存被处理之生物材料的步骤。
22.权利要求1的方法，其中提供了进一步在低级脂族醇和戊二醛的贮存溶液中贮存被处理之生物材料的步骤。
23.权利要求22的方法，其中贮存溶液是含有大约60％至80％体积乙醇和大约0.2％至0.5％戊二醛的水溶液。
24.权利要求1的方法，其中生物材料是主动脉瓣前尖，且醇是乙醇。
25.权利要求8的方法，其中生物材料是主动脉瓣壁，且抗钙化剂是加在乙醇中的铝盐。
26.权利要求1的方法，其中提供了进一步灭菌处理生物修复组织的步骤。
27.制造在人或动物体内使用的抗钙化抗性生物材料的方法，该方法包括以下步骤a)使戊二醛预处理的生物修复组织经受含大约60％至80％乙醇之溶液的大约20分钟至96小时时间的处理；以及b)清洗该生物修复组织。
28.权利要求27的方法，其中提供了进一步的步骤c)在含有大约0.2％至0.5％戊二醛和至少60％乙醇的无菌缓冲溶液中贮存该生物修复组织。
29.权利要求28的方法，其中所说的步骤包括使生物材料暴露于加入有机溶剂中的醇的处理溶液。
30.权利要求29的方法，其中醇和有机溶剂的量至少约为处理溶液的50％。
31.权利要求29的方法，其中处理溶液包括约40％醇和40％有机溶剂。
32.权利要求27的方法，其中生物材料是主动脉瓣前尖，且醇是乙醇。
33.权利要求27的方法，其中溶液进一步含有抗钙化剂，其为选自Al+3和Fe+3盐的多价金属的阳离子。
34.权利要求33的方法，其中生物材料是主动脉瓣膜壁，且抗钙化剂是加在乙醇中的铝盐。
35.按权利要求1或27的方法生产的生物材料。
全文摘要
使生物材料与醇接触处理胶原生物材料如猪主动脉瓣膜或牛心包膜以抑制体内钙化的方法。将生物材料，更好是戊二醛预处理的生物材料用60％至80％低级脂族醇如乙醇的水溶液处理至少20分钟，较好24至72小时。淋洗生物材料，然后在无戊二醛环境或戊二醛的乙醇溶液中贮存之。
文档编号A61L27/54GK1136780SQ94194232
公开日1996年11月27日 申请日期1994年10月20日 优先权日1993年10月21日
发明者罗伯特·J·莱维, 丹尼尔·赫什 申请人:密执安大学