一种水稻稻曲病抗性检测方法
【专利摘要】本发明公开一种水稻稻曲病抗性检测方法，本发明选育水稻稻曲病抗性品种杂交种F1，并对杂交种F1通过分子标记得到抗水稻稻曲病的基因位点，并确定水稻稻曲病在第11号染色体上的位置。本发明涉及的水稻稻曲病抗性检测方法，通过检测水稻品种第11号染色体上引物标记的带型数据，评估其对水稻稻曲病的抗性，大大提高抗稻曲病水稻的选择效率。
【专利说明】
一种水稻稻曲病抗性检测方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种水稻稻曲病抗性检测方法，具体涉及在水稻稻曲病抗性品种的11 号染色体上分子标记出水稻稻曲病抗性基因的方法，属于农业生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 水稻稻曲病别名青粉病、伪黑穗病，是一种由稻曲病菌引起的水稻穗部谷粒病害。 稻曲病不仅影响水稻产量，而且对人类健康构成重大威胁。感稻曲病水稻的穗粒内形成菌 丝块膨大后形成大于谷粒数倍的稻曲球，逐渐膨大，内外颖裂开，增加水稻的秕谷率、青米 率和碎米率，局部地块甚至减产20%~30 %。稻曲病菌能产生稻曲毒素，当稻谷中含有 〇. 5 %的病粒时，能使人畜中毒。
[0003] 稻曲病是一种世界性的病害，在美洲、非洲和亚洲等许多国家和地区都有大面积 的发生，病害严重时，发病率可高达40%以上。在我国，随着一些矮杆紧凑型水稻品种的推 广以及栽培方式、技术条件的改变，水稻稻曲病的发生愈来愈突出，成为我国水稻生产的主 要病害，在一些稻区，稻曲病甚至超过稻瘟病而成为水稻生产的重大病害。
[0004] 在历史上，稻曲病一直属于为害较轻的次要病害，只是近十多年的迅猛发展，才上 升为水稻生产的重大病害。由于历史上未能获得足够的重视，稻曲病防治的有关基础研究 仍然薄弱。现有技术防治水稻稻曲病主要方法是利用化学药剂，化学药剂的使用不可避免 地对环境造成污染和破坏。现有技术还有的通过在生产过程中改进栽培技术条件对水稻稻 曲病进行防治的措施，但收效甚微。
[0005] 现有技术在水稻生产上对水稻稻曲病的防治对策在一定程度上增加了水稻生产 的成本，并且加重了环境压力。
[0006] 利用水稻品种抗性被认为是目前防治稻曲病最经济、有效的手段。将栽培水稻或 野生稻中的水稻稻曲病抗性基因转育到主栽稻品种中，是获得安全的水稻稻曲病抗性品种 的最有效方法，但现有技术育种的进程缓慢且未有专门针对水稻稻曲病抗体的育种方法。
【发明内容】
[0007] 基于现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种水稻稻曲病抗性检测方法，选育 水稻稻曲病抗性品种杂交种Fl，并运用SSR分子标记从水稻稻曲病抗性品种中在11号染色 体上标记出水稻稻曲病抗性基因。
[0008] 具体步骤如下：
[0009] (1)杂交种Fl的获得：以水稻稻曲病抗源湘优66为母本，水稻稻曲病高感品种红莲 优6号为父本，二者正季播种，于实验秧田，单株移栽，株行距为30 X 30cm; -般大田肥水和 病虫草害管理，至植株正常生长到扬花期，将湘优66植株的稻穗浸入39~46°C的温水中，浸 泡6~10分钟后取出，自然冷却30分钟，剪去1/3颖壳及未开颖的小花，用纸袋将湘优66植株 的稻穗套好并作标记，待用。当红莲优6号植株进入开花期时，将红莲优6号植株上稻穗的花 药均匀落到纸袋中湘优66植株稻穗的柱头上，人工授粉完成后将纸袋继续套好，等待杂交 稻穗的籽粒成熟，即获得杂交种Fl。
[0010] (2)杂交种Fl的花药愈伤诱导：杂交种Fl正季播种，稻穗中部花药位置占颖壳的1/ 2为标准取穗，取穗后用70 %乙醇表面消毒，然后用塑料薄膜包住整个稻穗，保持稻穗湿润 放入冰箱中，在4°C下低温预处理3天;剪去1/3颖壳及未开颖的小花，在85%的酒精中消毒 处理2~10分钟，晾干后用剪开花药上部，将花药置于第一培养基中，进行诱导培养，在22~ 28°C下暗培养2~3天后，转移至第二培养基中，于25~29°C、光周期16h75001x光照8h黑暗 下进行继代培养，50天后将获得的杂交种Fl的花药愈伤组织，继续培养出花培苗、育苗、移 植到大田，等待稻穗籽粒成熟，通过筛选即获得水稻稻曲病抗性品种。
[0011] 所述第一培养基的成分为:N6基础培养基1900mg/L、甘氨酸2.0mg/L，烟酸0.5mg/ L，琼脂7.5g/L;激动素 KT 2. Omg/L，山梨醇25g/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺500mg/L，丙氨酸 0 · 6mg/L，叶酸0 · 5mg/L，秋水仙碱 0 · 3mg/L; pH 值为6 · 0。
[0012]所述第二培养基的成分为:1^基本培养基190〇1^/1、肌醇10〇11^/1，甘氨酸2.〇1^/ L，维生素 BI 0.4mg/L，维生素 B6 0.5mg/L，鹿糖25g/L，萘乙酸NAAO · 5mg/L，生物素0 · lmg/L， 甲基亚硝基脲0 · 8mg/L，调环酸钙0 · 4mg/L，水解蛋白1 · Og/L;以及浓度20%的水稻稻曲病菌 粗毒素提取液，pH值为6.0。
[0013] 所述水稻稻曲病菌粗毒素提取液的制备方法为:将感染水稻稻曲病水稻的穗颈部 剪下，清洁表面后置于湿润培养皿中，在30°C条件下暗培养，在菌丝产生后加入营养琼脂继 续培养，得到菌株;将菌株接种到液体培养基中30 °C下摇床培养30天，超声振荡15~60分 钟、过滤、以500~1500rpm的速度离心5~10分钟，得到的上清液即水稻细菌性基腐病菌粗 毒素。
[0014] (3)预处理:取新鲜水稻叶片加入液氮研磨成细粉，加入体积百分比2%的β-巯基 乙醇，震荡，加入50mM的三(羟甲基）氨基甲烷Tris-HCl、30mM的乙二胺四乙酸EDTA、质量体 积百分比为2%的聚乙烯吡咯烷酮PVP以及质量体积百分比为5%的十六烷基三甲基溴化铵 CTAB，混合均匀，将混合物加热到50~60 °C并保持该温度，在水浴摇床上摇摆50~80min，将 混合物离心分散15~30min，提取上清液，在-20°C环境中沉淀120~480min，离心分散后弃 上清液得到DNA沉淀物。
[0015] 所述水稻叶片与β-疏基乙醇、Tri s-HCl、PVP、CTAB的质量体积比mg/yLAxL/yLAiL 为1:1 ~5:1 ~5:3~8:8~12,优选为1:3:3:5:10。
[0016] 所述两次离心分散的速率为800~1600rpm，优选为900rpm。
[0017] (4)SSR引物：用实验室已有的大体平均分布于水稻12条染色体的296对SSR引物， 所述296对SSR引物含54对自行合成引物。
[0018] (5)PCR反应:PCR反应体系为：总体积为10yL，0.5yL15mM的脱氧核糖核苷三磷酸 dNTP，1 · 2yLl0 X PCR buffer，上下游引物各 1 · 5yL，5U/yL的Taq酶0 · 2yL，补水至IOyL; PCR扩 增程序为：94°C预变性5min ;94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin，共35个循环；最后 得到的PCR扩增产物4 °C保存Ih。
[0019] (6)染色：向PCR扩增产物加入2yL上样缓冲液，混合均匀后加入10%的聚丙烯酰胺 PAGE的点样孔，恒压180V电泳2~3h，PAGE在硝酸银溶液和蒸馏水中银染15min，在显影液作 用下染色。
[0020] (7)检测：根据定位群体各单株分子标记多态性检测结果，并结合其抗性表型参 数，进行基因和分子标记位点的遗传连锁分析；检测水稻稻曲病的抗性数量性状基因座 QTL，LOD值的阈值定为2.5~3.0，按P = 0.005的概率值检测抗性QTL的数目及其在染色体上 的位置。
[0021 ]本发明涉及的一种水稻稻曲病抗性检测方法，以水稻稻曲病抗源湘优66为母本， 水稻稻曲病高感品种红莲优6号为父本，选育水稻稻曲病抗性品种杂交种F1。通过对杂交种 Fl通过花药愈伤诱导培育的新品种进行分子标记得到抗稻曲病基因位点qRBSDV17,位于第 11号染色体分子标记RM4504与RM3133之间。本发明涉及的水稻稻曲病抗性染色体的分子标 记方法，可以通过检测某一品种第11号染色体上下游两个引物标记的带型数据，评估其对 水稻稻曲病的抗性，大大提高抗稻曲病水稻的选择效率。
[0022]本发明通过分子标记的方法对水稻稻曲病的抗性进行评估，避免使用化学药剂增 加水稻生产的成本且避免对环境造成污染和破坏，无需多世代重复杂交回交，缩短了育种 周期。
【附图说明】
[0023]图1为11号染色体上抗稻曲病基因位点qRBSDV17在染色体上的位置。
[0024] 图2为11号染色体上抗稻曲病基因位点评估水稻品种对水稻稻曲病的抗性的电泳 图谱。M: Mark; 1:湘优66; 2:红莲优6号;3 :F1;4-11 :抗病单株;12-20:感病单株。
【具体实施方式】
[0025] 下面通过具体实施例，进一步对本发明的技术方案进行具体说明。应该理解，下面 的实施例只是作为具体说明，而不限制本发明的范围，同时本领域的技术人员根据本发明 所做的显而易见的改变和修饰也包含在本发明范围之内。
[0026] 实施例1
[0027] (1)杂交种Fl的获得:正季收集来源于15个省份共225份水稻品种进行抗水稻稻曲 病田间诱发鉴定，结果表明，不同省区水稻品种对稻曲病的抗性存在明显差异，品种湘优66 水稻稻曲病抗性较好，大田发病率仅有5%，属于高抗水平。以水稻稻曲病抗源湘优66为母 本，水稻稻曲病高感品种红莲优6号为父本，二者正季播种，于实验秧田，单株移栽，株行距 为30 X 30cm; -般大田肥水和病虫草害管理，至植株正常生长到扬花期，将湘优66植株的稻 穗浸入39~46°C的温水中，浸泡6~10分钟后取出，自然冷却30分钟，剪去1/3颖壳及未开颖 的小花，用纸袋将湘优66植株的稻穗套好并作标记，待用。当红莲优6号植株进入开花期时， 将红莲优6号植株上稻穗的花药均匀落到纸袋中湘优66植株稻穗的柱头上，人工授粉完成 后将纸袋继续套好，等待杂交稻穗的籽粒成熟，即获得杂交种Fl。
[0028] (2)杂交种Fl的花药愈伤诱导：
[0029]杂交种Fl正季播种，稻穗中部花药位置占颖壳的1/2为标准取穗，取穗后用70%乙 醇表面消毒，然后用塑料薄膜包住整个稻穗，保持稻穗湿润放入冰箱中，在4tC下低温预处 理3天;剪去1/3颖壳及未开颖的小花，在85%的酒精中消毒处理2~10分钟，晾干后用剪开 花药上部，将花药置于第一培养基中，进行诱导培养，在22~28°C下暗培养2~3天后，转移 至第二培养基中，于25~29°C、光周期16h75001x光照8h黑暗下进行继代培养，50天后将获 得的杂交种Fl的花药愈伤组织，继续培养出花培苗、育苗、移植到大田，等待稻穗籽粒成熟， 通过筛选即获得水稻稻曲病抗性品种。
[0030] 所述第一培养基的成分为:N6基础培养基1900mg/L、甘氨酸2.0mg/L，烟酸0.5mg/ L，琼脂7.5g/L;激动素 KT 2. Omg/L，山梨醇25g/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺500mg/L，丙氨酸 0 · 6mg/L，叶酸0 · 5mg/L，秋水仙碱 0 · 3mg/L; pH 值为6 · 0。
[0031]所述第二培养基的成分为:15基本培养基190〇11^/1、肌醇10〇11^/1，甘氨酸2.〇1^/ L，维生素 BI 0.4mg/L，维生素 B6 0.5mg/L，鹿糖25g/L，萘乙酸NAAO · 5mg/L，生物素0 · lmg/L， 甲基亚硝基脲0 · 8mg/L，调环酸钙0 · 4mg/L，水解蛋白1 · Og/L;以及浓度20%的水稻稻曲病菌 粗毒素提取液，pH值为6.0。
[0032]所述水稻稻曲病菌粗毒素提取液的制备方法为:将感染水稻稻曲病水稻的穗颈部 剪下，清洁表面后置于湿润培养皿中，在30°C条件下暗培养，在菌丝产生后加入营养琼脂继 续培养，得到菌株;将菌株接种到液体培养基中30 °C下摇床培养30天，超声振荡15~60分 钟、过滤、以500~1500rpm的速度离心5~10分钟，得到的上清液即水稻细菌性基腐病菌粗 毒素。
[0033] (3)预处理:取新鲜水稻叶片加入液氮研磨成细粉，加入体积百分比2%的β-巯基 乙醇，震荡，加入50mM的三(羟甲基）氨基甲烷Tris-HCl、30mM的乙二胺四乙酸EDTA、质量体 积百分比为2%的聚乙烯吡咯烷酮PVP以及质量体积百分比为5%的十六烷基三甲基溴化铵 CTAB，混合均匀，将混合物加热到50~60 °C并保持该温度，在水浴摇床上摇摆50~80min，将 混合物离心分散15~30min，提取上清液，在-20°C环境中沉淀120~480min，离心分散后弃 上清液得到DNA沉淀物。
[0034] 所述水稻叶片与β-巯基乙醇、Tris-HCl、PVP、CTAB的质量体积比mgAiLAiL/yLAiL 为1:3:3:5:10。
[0035] 所述两次离心分散的速率为800~1600rpm。
[0036] (4)SSR引物：用实验室已有的大体平均分布于水稻12条染色体的296对SSR引物， 所述296对SSR引物含54对自行合成引物。
[0037] (5) PCR反应:PCR反应体系为：总体积为I OyL，0.5yL 15mM的脱氧核糖核苷三磷酸 dNTP，1 · 2yLl0 X PCR buffer，上下游引物各 1 · 5yL，5U/yL的Taq酶0 · 2yL，补水至IOyL; PCR扩 增程序为：94°C预变性5min ;94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin，共35个循环；最后 得到的PCR扩增产物4 °C保存Ih。
[0038] (6)检测:PCR扩增产物用10%的聚丙烯酰胺PAGE经硝酸银染色后，再用NaOH显色。
[0039]向PCR扩增产物加入2yL上样缓冲液，混合均匀后加入PAGE的点样孔，恒压180V电 泳2~3h，PAGE在硝酸银溶液和蒸馏水中银染15min，在显影液作用下染色。
[0040] (7)根据定位群体各单株分子标记多态性检测结果，并结合其抗性表型参数，用 Mapmaker/Exp3.0软件进行基因和分子标记位点的遗传连锁分析，利用Kosambi作图函数将 交换率转换为遗传距离(CM)。
[0041 ] (8)米用基于复合区间作图法软件Windows QTL Cartographer V2.5检测水稻稻 曲病的抗性QTL，LOD值的阈值定为2.7，按P = O . 005概率值检测抗性QTL的数目及其在染色 体上的位置。在11号染色体上检测到1个水稻稻曲病抗性QTULOD值为3.88,贡献率为 17.9%，命名为qRBSDV17，位于第ll号染色体分子标记RM4504:SEQIDN0.1/SEQIDN0.2 与分子标记RM3133:SEQ ID N0.3/SEQ ID从).4之间（如图1)。
[0042] (9)用第11号染色体分子标记RM4504引物：如果用分子标记RM4504引物：SEQ ID N0.1/SEQIDN0.2能够扩增出127bp的扩增片段，或用分子标记RM3133:SEQIDN0.3/SEQ ID N O . 4能够扩增出9 8 b p的扩增片段，则标志着水稻材料内存在抗水稻稻曲病位点 qRBSDV17(如图2)，通过检测第11号染色体上该两个引物标记的带型数据，评估该植株对水 稻稻曲病的抗性。
【主权项】
1. 一种水稻稻曲病抗性检测方法，其特征在于:其步骤如下： (1) 杂交种F1的获得：以水稻稻曲病抗源湘优66为母本，水稻稻曲病高感品种红莲优6 号为父本，二者正季播种，于实验秧田，单株移栽，株行距为30 X 30cm; -般大田肥水和病虫 草害管理，至植株正常生长到扬花期，将湘优6 6植株的稻穗浸入3 9~4 6 °C的温水中，浸泡6 ~10分钟后取出，自然冷却30分钟，剪去1/3颖壳及未开颖的小花，用纸袋将湘优66植株的 稻穗套好并作标记，待用；当红莲优6号植株进入开花期时，将红莲优6号植株上稻穗的花药 均匀落到纸袋中湘优66植株稻穗的柱头上，人工授粉完成后将纸袋继续套好，等待杂交稻 穗的籽粒成熟，即获得杂交种F1; (2) 杂交种F1的花药愈伤诱导：杂交种F1正季播种，稻穗中部花药位置占颖壳的1/2为 标准取穗，取穗后用70 %乙醇表面消毒，然后用塑料薄膜包住整个稻穗，保持稻穗湿润放入 冰箱中，在4°C下低温预处理3天;剪去1/3颖壳及未开颖的小花，在85%的酒精中消毒处理2 ~10分钟，晾干后用剪开花药上部，将花药置于第一培养基中，进行诱导培养，在22~28°C 下暗培养2~3天后，转移至第二培养基中，于25~29°C、光周期16h7500lx光照8h黑暗下进 行继代培养，50天后将获得的杂交种F1的花药愈伤组织，继续培养出花培苗、育苗、移植到 大田，等待稻穗籽粒成熟，通过筛选即获得水稻稻曲病抗性品种； (3) 预处理:取新鲜水稻叶片加入液氮研磨成细粉，加入体积百分比2%的β-巯基乙醇， 震荡，加入50mM的三(羟甲基)氨基甲烷Tr i s-HCl、30mM的乙二胺四乙酸EDTA、质量体积百分 比为2 %的聚乙烯吡咯烷酮PVP以及质量体积百分比为5 %的十六烷基三甲基溴化铵CTAB， 混合均匀，将混合物加热到50~60 °C并保持该温度，在水浴摇床上摇摆50~80min，将混合 物离心分散15~30min，提取上清液，在-20°C环境中沉淀120~480min，离心分散后弃上清 液得到DNA沉淀物； 所述水稻叶片与巯基乙醇、Tr i s-HCl、PVP、CTAB的质量体积比mg/WyLAiLAxL为1:1 ~5:1~5:3~8:8~12; 所述两次离心分散的速率为800~1600rpm; (4) SSR引物：用实验室已有的大体平均分布于水稻12条染色体的296对SSR引物，所述 296对SSR引物含54对自行合成引物； (5) PCR反应:PCR反应体系为：总体积为10yL，0.5yL15mM的脱氧核糖核苷三磷酸dNTP， 1 · 2yL10 X PCR buffer，上下游引物各 1 · 5yL，5U/yL的Taq酶0 · 2yL，补水至 10yL; PCR扩增程 序为:94°C预变性5min;94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin，共35个循环；最后得到 的PCR扩增产物4°C保存lh; (6) 染色：向PCR扩增产物加入2yL上样缓冲液，混合均匀后加入10%的聚丙烯酰胺PAGE 的点样孔，恒压180V电泳2~3h，PAGE在硝酸银溶液和蒸馏水中银染15min，在显影液作用下 染色； (7) 检测：根据定位群体各单株分子标记多态性检测结果，并结合其抗性表型参数，进 行基因和分子标记位点的遗传连锁分析;检测水稻稻曲病的抗性数量性状基因座QTL，L0D 值的阈值定为2.5~3.0，按P = 0.005的概率值检测抗性QTL的数目及其在染色体上的位置。2. 根据权利要求1所述的一种水稻稻曲病抗性检测方法，其特征在于:步骤(2)所述第 一培养基的成分为:N6基础培养基1900mg/L、甘氨酸2. Omg/L，烟酸0.5mg/L，琼脂7.5g/L;激 动素 KT2 · Omg/L，山梨醇25g/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺500mg/L，丙氨酸0 · 6mg/L，叶酸0 · 5mg/ L，秋水仙碱Ο · 3mg/L; pH值为6 · 0。3. 根据权利要求1所述的一种水稻稻曲病抗性检测方法，其特征在于:步骤(2)所述第 二培养基的成分为：MS基本培养基1900mg/L、肌醇100mg/L，甘氨酸2 . Omg/L，维生素 B10 · 4mg/L，维生素 B60 · 5mg/L，蔗糖25g/L，萘乙酸NAA0 · 5mg/L，生物素0 · lmg/L，甲基亚硝基 脲0.8mg/L，调环酸钙0.4mg/L，水解蛋白1. Og/L;以及浓度20 %的水稻稻曲病菌粗毒素提取 液，pH值为6.0。4. 根据权利要求3所述的一种水稻稻曲病抗性检测方法，其特征在于:步骤(2)所述水 稻稻曲病菌粗毒素提取液的制备方法为:将感染水稻稻曲病水稻的穗颈部剪下，清洁表面 后置于湿润培养皿中，在30°C条件下暗培养，在菌丝产生后加入营养琼脂继续培养，得到菌 株;将菌株接种到液体培养基中30 °C下摇床培养30天，超声振荡15~60分钟、过滤、以500~ 1500rpm的速度离心5~10分钟，得到的上清液即水稻细菌性基腐病菌粗毒素。5. 根据权利要求1所述的一种水稻稻曲病抗性检测方法，其特征在于:步骤(3)所述水 稻叶片与β-巯基乙醇、Tris-HCl、PVP、CTAB的质量体积比mg/yL/yLAiLAiL为1:3:3:5:10; 所述两次离心分散的速率为900rpm。
【文档编号】A01H1/02GK106086196SQ201610495879
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月29日
【发明人】孟剑华, 许建中, 安剑石
【申请人】无锡南理工科技发展有限公司