专利名称：Rank1,来自与疾病抗性相关的水稻的含锚蛋白重复序列的肽的制作方法
技术领域：
在农作物中，真菌，细菌和病毒疾病导致产量和产品质量下降，并且造成农民的实际损失。例如，估计稻瘟病，发生在世界范围内大多数水稻生长地区的常见破坏性疾病，每年使农民损失50亿美元(Moffat，1994)。该疾病特别是在中度洪涝和热带干旱的水稻生态系统中明显降低水稻产量。利用抗性栽培品种是最经济和有效的控制该疾病的方法。在过去的十年中，关于对稻瘟病真菌的抗性的遗传学已经研究了许多。已经鉴定并且在育种工程中广泛利用了许多主要的抗性基因。但是，对这一致病原的寄主抗性的分子机制几乎还是未知。
当植物受到致病原如稻瘟病真菌的攻击时，大多数情况中，它通过增强一连串防御应答抵抗感染(Lindsay等人，1993)。植物防御功能的活化发生在致病原识别基础上，导致致病原侵入停止。系统获得性抗性(SAR)是植物用于保护自身抵抗致病原的复杂系统一个重要成分(Ryals等人，1996)。对无毒性致病原的局部超敏应答(HR)可以引发SAR，这给予植物的未感染部分对各种正常毒性致病原的抗性。SAR是植物致病原应答的特别重要的方面，因为它是抗广谱致病原的致病原可诱导的系统抗性。
在解读SAR的分子学方面，最近已经取得了明显的进步。利用基于图谱的方案已经克隆了拟南芥基因NPR1/NIM1(Cao等人，1997；Ryals等人，1997)。在NPRI/NIM1含有缺陷的突变体不能应答各种诱导SAR的处理，致病原相关(PR)基因很少表达和展示出对感染的敏感性增强。该基因编码含有锚蛋白重复序列的新蛋白质并且展示了与哺乳动物信号转导因子IkB亚类a的同源性，表明RPN1/NIM1可以与NF-kB相关转录因子相互作用诱导SAR基因表达和引发疾病抗性(Ryals等人，1997)。
锚蛋白重复序列是存在于许多多样功能的蛋白质包括转录因子，细胞分化分子，和结构蛋白质中的33个氨基酸的基序(Bennet，1993)。锚蛋白基序共有序列含有下面的氨基酸序列-D----G-TPLH-AA-------V--L--GA-(LaMarco，1991)。已经显示，这一基序介导了蛋白质的相互反应，并且存在于4个到7个拷贝的串联排列中(Michaely和Bennett，1993)。已经显示含有锚蛋白重复序列的蛋白质具有各种功能并且参与蛋白质—蛋白质的相互反应。在哺乳动物中的这些蛋白质的一些是转录调节蛋白质，如NF-kB，抑制因子IkB(Baldwin，A.1996；Whiteside等人，1997)。在哺乳动物和果蝇中，NF-kB/IKβ信号转导途径是保守的。刺激剂如IL-1处理或细菌接种导致了信号转导途径的活化，因为Ikβ或其他的同源物降解和释放NF-kB转导因子到核刺激转录(Baeuerie和Baltimore，1996；Baldwin，1996)。在拟南芥中，与NF-kB抑制因子IkB同源的NPR1/NIM1控制了SAR的启动。NPR1/NIM1靶击的转录因子的作用是SAR基因表达的阻遏物和直接或间接作用的疾病抗性(Ryals等人，1997)。
SAR是抵抗感染性致病原的重要的植物防御机制。例如，证据表明SAR可以保护植物抵抗稻瘟病。发现SAR诱导物苯并-(1，2，3)-噻二唑-7-硫代羟酸-S-甲基酯(“BHT”)在田间条件下控制稻瘟病是有效的。
发明概要从稻瘟病抗性植物已经分离了编码含有锚蛋白重复序列的新蛋白质的基因。命名为RANK1的水稻锚蛋白重复序列基因与拟南芥基因NPR1/NIM1和哺乳动物信号转导因子抑制剂I-kB具有明显的同源性。RANK1基因编码确信在防御稻瘟病致病原感染以及通过SAR应答的其它疾病的水稻防御能力中起重要作用的蛋白质。因为RPN1/NIM1和RANK1基因编码锚蛋白重复序列，确信这些重复可能负责对植物疾病特别是稻瘟病的SAR诱导的抗性。
因此，在本发明的一个实施方案中，提供了具有含有SEQ IDNO1的序列的分离的核酸。
在另一个实施方案中，本发明提供了含有包括SEQ ID NO1的核酸d在植物细胞中起作用的重组DNA表达载体。
第三个实施方案是利用具有SEQ ID NO1的序列的核酸稳定转化的植物细胞。
另一个实施方案提供了用具有包括SEQ ID NO1的序列的核酸转化的转基因植物。
本发明进一步提供了在单子叶植物中赋予疾病抗性的方法，包括将具有编码包括锚蛋白基序序列的蛋白质的序列的核酸稳定地整合进入所述的植物的基因组。
本发明的另一个实施方案提供了在单子叶植物中赋予稻瘟病抗性的方法，包括在所述的植物的基因组中稳定地整合具有编码包括锚蛋白基序序列的蛋白质的序列的核酸。
附图的简要说明
图1显示了RANK1的推测的氨基酸序列与含有锚蛋白重复序列的IKβ-E，Ikβ-α，Cactus和NPR1蛋白质的序列比较。
图2是显示在接种后稻瘟病抗性植物积累的NPR1 RNA的琼脂糖凝胶电泳。利用RANK1特异引物扩增从抗性(C101A51)和敏感(CO39)植物分离的cDNA。
图3显示了RANK1部分cDNA和基因组DNA序列的比较。
图4显示了含有RANK1基因的抗性(C101A51)和敏感(Co39)植物的Southern分析。
图5显示了含有RANK1基因的抗性(C101A51)和敏感(Co39)植物的Northern分析。
本发明的详细说明本发明涉及赋予稻瘟病抗性的分离的核酸。该核酸编码推测为具有锚蛋白重复序列的蛋白质。该核酸有利地具有SEQ ID NO1的核苷酸序列。但是，应认识到的是正如仍然编码同样蛋白质的遗传密码的简并性允许的，该核苷酸序列可以变化。利用核酸插入的植物优先的密码子取代SEQ ID NO1显示的一个或多个密码子可以增强基因在植物中的表达。
利用常规重组DNA技术可以在植物或细菌细胞中掺入该核酸。通常，这样的技术包括在DNA表达载体中插入该核酸。这样的载体有利地含有插入蛋白质编码序列的转录和翻译必要的元件和简化转化细胞或植物的选择的一个或多个标记序列。
许多植物活化启动子是本领域已知的，并且可以用于本文公开的核酸序列的有效表达。适当的启动子包括例如nos启动子，小亚基叶绿素A/B结合多肽，花椰菜花叶病毒的35S启动子，和从植物基因分离的启动子。从待转化的植物类型可以分离启动子。35S或肌动蛋白启动子也可以用于分离的cDNA克隆。这些也可用于测试该基因的过度表达。
一旦已经将本发明的核酸克隆进入表达载体，就容易转化进入植物细胞。术语植物细胞包括任何起源于植物的细胞；这包括未分化的组织如愈伤组织和悬浮培养物，以及植物种子，花粉或植物胚。适于转化的植物组织包括叶组织，根组织，分生组织，原生质体，下胚轴子叶，盾片，茎尖，根，不成熟的胚，花粉和花药。
利用本发明的赋予疾病抗性的核酸转化植物的一项技术是通过将含有本发明的核酸的载体转化的细菌的接种物接触这样的植物的组织。通常，这一方法包括利用细菌的悬浮液接种植物组织并且在25-28℃在没有抗生素的再生培养基上温育组织48到72小时。
可以利用土壤杆菌属的细菌转化植物细胞。这样的细菌的适当种类包括根癌土壤杆菌和发根土壤杆菌。因为它已知的转化植物的能力，根癌土壤杆菌(例如，菌株LBA4404或EHA105)特别有用。
利用本发明的核酸转化植物细胞的另一个途径包括在植物细胞中推进惰性或生物活性颗粒。在授予Sanford等人的美国专利号4,945,050,5,036,006和5,100,792中公开了这一技术，这些专利引入本文作为参考。通常，这一方法包括在有效地渗透细胞的外表面和待掺入其内部的条件下在细胞中推进惰性或生物活性颗粒。当利用惰性颗粒时，通过利用含有赋予疾病抗性的核酸的载体包被颗粒可以在细胞中导入载体。也可以推进生物活性颗粒(例如，干燥的酵母细胞，干燥的细菌或噬菌体，每个含有待导入的DNA)到植物细胞组织中。
转化植物细胞的另一个方法是电穿孔方法。这一方法包括将原生质体和需要的核酸混合，并且通过电脉冲在细胞膜上形成孔以致在细胞中导入DNA，从而转化细胞。这一方法目前具有高再生性，在单子叶植物特别是水稻植物中通过这一方法已经导入各种基因(Toriyama等人，(1988)；Shimamoto等人，(1989)，Rhodes等人，(1988))。
与电穿孔方法相同的方法是混合需要的基因和原生质体并且利用PEG处理混合物因此将基因导入原生质体的方法。这一方法不同于电穿孔方法，该方法利用聚乙二醇(“PEG”)而不是电脉冲。(Zhang W.等人，(1988)，Datta等人(1990)，Christou等人，(1991))。
其它方法包括1)与核酸一起培养种子或胚胎(Topfer R.等人，(1989)；Ledoux等人，(1974))；2)处理花粉管(Luo等人(1988))；3)，脂质体方法(Caboche(1990))；Gad等人(1990)；和4)微注射方法(Neuhaus等人(1987)。
从转化植物细胞再生植物的已知方法可以用于制备本发明的转基因植物。通常，可以将外植体，愈伤组织或悬浮培养物与适当的化学环境接触(例如，细胞激动素和植物生长素)以致新生长细胞可以分化，并且产生胚，然后再生成根和茎。
可以利用本发明的核酸序列赋予单子叶植物对稻瘟病的抗性和其它SAR调节的疾病的抗性。这样的植物包括但不限于水稻，小麦，燕麦，玉米和天门冬。
通过下面的实施例进一步说明了本发明，这些实施例打算用于说明不用于限制。
实施例材料和方法水稻和稻瘟病接种将携带Pi-2基因的抗性等基因系C101A51和敏感的栽培品种CO39用于实验中。利用分离物PO6-6接种三星期大的水稻植物，在26℃，在潮湿的室中保持24小时。在接种后0，4，8，12，24，48，72小时，从两个栽培品种收集叶组织。
RNA分离和RT-PCR从150-200毫克水稻叶组织利用Rneasy mini kit(Qiagen，美国)分离总RNA。在逆转录介导的聚合酶链式反应(RT-PCR)中利用10聚体随机引物(Operon技术公司)，利用从Qiagen Oligotex Spin柱，从总RNA分流的聚(A)+RNA作为模板。根据制造商提供的方案进行RT-PCR(GIBCO-BRL，美国)。然后，在4.5％测序凝胶中分离扩增的cDNA。
克隆和DNA测序特异谱带克隆在pGEM-T载体中(普洛美格，美国)。利用ABIPRISM 377DNA测序仪(Perkin-Elmer，CA，美国)测序克隆。利用软件DNAstar和Sequencer 3.0分析序列。
结果在抗性植物中强烈诱导了RANK1已经利用28个随机引物从C101A51和CO39扩增cDNA。当在RT-PCR反应中利用引物OPF-1(ACGGATCCTG)时，只在接种的抗性植物中观察到特异谱带(约600bp)。它是在早至接种后4小时被强烈诱导的。从测序胶裂解这一谱带，利用相同的引物再扩增，并且克隆进入pGEM-T载体。在SEQ ID NO1中提供了这一cDNA克隆的DNA序列。将它与已知基因的数据库比较寻找与已知基因的同源性。检索表明这一基因(RANK1)编码的蛋白质的推测的氨基酸序列与含有锚蛋白重复序列的包括拟南芥基因RPN1/NIM1和哺乳动物基因家族IkB(图1)的那些蛋白质明显同源。
设计RANK1特异引物对，并且用于扩增从第二个接种实验分离的cDNA。在琼脂糖凝胶上电泳扩增的cDNA。仅在抗性植物中观察到600bp的片段(图2)。
如图4和5所示进行了抗性(C101A5)和敏感(Co39)植物的Southern和Northern分析。
从细菌人工染色体(BAC)文库分离RANK1基因组克隆利用RANK1部分cDNA克隆作为探针筛选从指标栽培品种IR64制备的BAC文库。鉴定了6个阳性BAC克隆，小量制备以便进一步亚克隆。发现2.0kb亚克隆的序列存在600bp cDNA片段跨越的区域中的内含子，命名为RANK1基因。SEQ ID NO2中阐述了RANK1基因组克隆的序列。
序列表序列描述SEQ ID NO1TTGAAGTGTG CCCAAGTACT TCTTGAGGCG GGTGCTGCAG TGGATGCTTTGGACAAGAAC AAGAACACTC CGCTGCATTA CGCCGCTGGC TATGGTATGAAGGGGTGCGT GGATCTTCTG CTGAAGAACG GAGCCGCTGTCACCCTCGAA AACATGGATG GCAAGACGCC CATTGACGTT GCGAAGCTCAACAACCAGGA TGAGGTTCTC AAGTTGCTGG AAAAGGATGC CTTCCTGTAGATCGCCTTTG TTATTCTCAT GGGCGCATGA ACAGTTTGGC TCCAGGATCCGTATACGGATCCT GCTGCACTGA TAAAGTACTG GAATGACCCA GAAACATTTCGAAAGATCAG CCAGGCAATG GGGCCTTTAG GCGGCCCTGA TTTTGCTGAACCTTCTGGAA CTGAAGGAAC AGAGGAAGAA GGTGAATATG AAGATGAATCTATCGTCCAT CACACTGCCA GTGTTGGTGA TGATGAGGGTCTGAAGAA GGCTTTAGAT GGTGGAGCAG ACAAAGACGA AGAAGACTTGGAGGGCAGAA GGGCCTTACA CTTTGTATGT GGATACGGGG AGSEQ ID NO2TTTACTTTGT TGAAGCTAAA ACTTTGTTAG TTTTTCTGGG GCAGTTCATTGATGATAATC CAGACCTCAC AGGTCAACCA ACAGTCCTCG GTTTCAAAAAAAAAAAAAAA TCCCACAGTA ACCTGTCCCG TTGAACATTG CACAAACTTGTCAGATCTGG TGCACCTCTC GTCTAGCTAT AATAGTATCG AACTATGAGTTTCCATAACC CCGCTGTTTG TATAATTGCA GTTGGTGTGC AATGCTAGAGCACAAAAGTT AATGAACGAC AAACTACCTT TTGATTCATT CTCTTGTGGATCTAGAATGT GGTGTGAGAC TTTTTTTTTG GGAGCTGCAT CTGCTCCTTGTTCACTGACT AATCAGGATT TGGGTTAAAC TTTTGTTTTT CAGTTGAAGTGTGCCCAAGT ACTTCTTGAG GCGGGTGCTG CAGTGGATGC TTTGGACAAGAACAAGAACA CTCCGCTGCA TTACGCCGCT GGCTATGGTA TGAAGGGGTGCGTGGATCTT TTGCTGAAGA ACGGAGCCGC TGTGTAAGTT AAACCTGCTCGCTTTGCTAG TTGCGATCAC ATCATTTTTT TTGCATTATA TTATTTGACTGTCTCGAATT GCATCGCAGC ACCCTCGAAA ACATGGATGG CAAGACGCCCATTGACGTTG CGA-GCTCAA CA-CCAGGATGACCCAGAAA CATTTCGAAA GATCAGCCAG GCAATGGGGC CTTTAGGCGGCCCTGATTTT GCTGAACCTT CTGGAACTGA AGGAACAGAG GAAGAAGGTGAATATGAAGA TGAATCTATC GTCCATCACA CTGCCAGTGT CGGTGATGATGAGGTAAGGG GGCAGAGTGC TAAGTAGTAC AGCTAAGGAT TTGAAATTATTACTTCCTCC GTTTCATATT ATAACACTTC CTAGCATTGC CCACATTCATATACATGTTA ATGAATCTAG ACATATATGT GCGCCTAGAT TCATTAATATCTATATGAAT ATGGGCAATG CTAGAAAGTC TTATAACCTGA AACGGAGGTAGTATTGATA TTACTATTTA GTCTCGAGCT TGAGAGTTTG TATATGTTTCTATGTCTTGT TGGTGTGTAA TGTATAATTT ACTAGAGAAG TGTCCATTCGTGTGTGTGTG TATGGTTATA TAATATCTTC AATTACAGTA ATATGCCTCTCCGTTTTGGT TTTGCTCTGA ACAACATGTA TAGGTTTTCG CACAAATTGTGATCTCGATG GCCTTTTCTG TTTCATTGTC AATTCAGCTT GCCTTTCTTTACAAGTTTAA GTCATCTAAT AGGGTCTGAA GAAAGCTTTA GATGGTGGAGCAGACAAAGA CGAACAACAC TTGGAGGGCA GAAGGGCCTT ACACTTTGTATGTGGATATG GGGAGGTATG CAAGTCTGCT TAACTAAACC CAATGACAATTGAAACCTGT GCAAGTAGAA AATGCCGAAT AAATACTACT CCCTCCGTTTCATAATGTAA GTCATTCTAG CATTTTTCAT ATTCATATTG ATGTTTATGAATCTAGAAAG ACATCAATAT GAATGTGGGA AATGCTAGAA TGACTTACATTGTGAAACGG AAGAAGTACT ATTACCTATT TGTTGTTATT GCAAATGACAAGGTTAGCAA CTATAAAAAC ATCTCGTTGC GAATCCTGTG CAAAACGGATTGCATGTATG CGTGACTAGT CTTCAGAAAA TTGCATGTAT GCAATGTGACAGTTCATTAT GCAAAACGGT GAACCTACTG TTGCCATCAG TATCCCCGATACTAATTGAA GTTCTCCTAA TGTTTTCTTT TTTCCTTTTT GGTAATCAGCTAGCGTTGAA TTCAGCTTAG TTGGGGGCTA ACTGTCTTTT TGCATTCTATGATGAGTTTT GACAAATTTA TTAATTTTAT CTTTTTTTTT TTTTGCTTTTAACACACTTC AAGATATTTT TGGTAGATGG AAAGGTGCAG AGCTTGCTGG文献Baeuerie(1996)细胞8713-20。
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权利要求
1.具有SEQ ID NO1的序列的分离的核酸。
2.具有编码由SEQ ID NO1的核苷酸序列编码的蛋白质的序列的分离的核酸。
3.根据权利要求1所述的分离的核酸，可操作地与植物中活化的启动子连接。
4.根据权利要求3所述的分离的核酸，其中植物是单子叶植物。
5.根据权利要求3所述的分离的核酸，其中植物选自水稻，燕麦，玉米，小麦和天门冬。
6.在植物细胞中起作用的含有权利要求1所述的核酸的重组DNA表达载体。
7.根据权利要求6所述的重组DNA表达载体，其中所述的植物是单子叶植物。
8.根据权利要求5所述的重组DNA表达载体，其中所述的植物选自水稻，燕麦，玉米，小麦和天门冬。
9.制备转基因单子叶植物的方法，所述的方法包括在单子叶植物的基因组中稳定地整合含有SEQ ID NO1的核酸，其中所述的序列在所述的植物中表达。
10.赋予单子叶植物疾病抗性的方法，包括在单子叶植物的基因组中稳定转化含有SEQ ID NO1的核酸。
11.赋予水稻稻瘟病抗性的方法，包括在单子叶植物的基因组中稳定转化含有SEQ ID NO1的核酸。
12.根据权利要求9，10，和11的任何一项所述的方法，其中所述的单子叶植物是选自水稻，燕麦，玉米，小麦和天门冬的植物。
13.利用含有SEQ ID NO1的核酸序列的核苷酸序列稳定地转化的植物细胞。
14.转基因植物，包括在植物基因组中稳定地整合的包括含有SEQ ID NO1的核苷酸序列的核酸；和可操作地连接该核酸序列以表达该序列的植物启动子。
15.根据权利要求14所述的转基因植物，其中所述的植物是单子叶植物。
16.根据权利要求14所述的转基因植物，其中所述的单子叶植物选自水稻，燕麦，玉米，小麦和天门冬。
17.赋予单子叶植物疾病抗性的方法，包括在所述的植物的基因组中稳定地整合具有编码包括锚蛋白基序共有序列的蛋白质的序列的核酸。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述的单子叶植物选自水稻，燕麦，玉米，小麦和天门冬。
19.赋予单子叶植物稻瘟病抗性的方法，包括在所述的植物的基因组中稳定地整合具有编码包括锚蛋白基序共有序列的蛋白质的序列的核酸。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述的单子叶植物选自水稻，燕麦，玉米，小麦和天门冬。
21.具有SEQ ID NO2的序列的分离的核酸序列。
全文摘要
本发明涉及具有包括SEQ ID NO:1的序列的分离的核酸,所述核酸编码植物中的疾病抗性。转化的植物细胞可以随即导入植物以再生疾病抗性植物。
文档编号C12N15/82GK1268182SQ9718237
公开日2000年9月27日 申请日期1997年9月15日 优先权日1997年9月15日
发明者何朝族, 王国梁 申请人:分子农业生物学院