专利名称：一种白叶枯病抗性相关蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种植物抗病性相关蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一种白叶枯病抗性相关蛋白及其编码基因与应用。
背景技术：
生长在自然界中的植物会经常受到各种细菌、真菌和病毒等侵害，在长期演化过程中形成了各种应答机制。对植物抗病性和抗病机制的研究一直是植物病理学和抗病育种界十分关注的课题。在早期的研究中建立了著名的“基因对基因”学说，它能阐述多种植物-病原菌之间的作用关系，已成为克隆病原菌无毒基因和植物抗病基因的理论基础。自1992年从玉米中克隆到第一个抗病基因Hm1以来，现在已有40多个植物抗病(R)基因被克隆了，它们编码的蛋白质产物多数具有某一特定的结构域，如NBS(Nucleotide binding site，核苷酸结合位点)，LRR(Leucine-rich repeat，富亮氨酸重复)，TM(Transmembrane domain，跨膜结构域)，PK(Protein kinase，蛋白激酶)，LZ(Leucine zipper，亮氨酸拉链)，CC(Coiled Coil，卷曲螺旋)和TIR(Toll-Interleukin-1 Receptor，Toll白介素-1区域)等。根据抗病基因是否含有这些结构域，可将它们分为LZ(CC)-NBS-LRR，TIR-NBS-LRR，TM-LRR，TM-LRR，LRR-TM-STK 5类。但是还有其它特殊类型的R基因不含有这些结构域，如大麦的隐性抗白粉病(Erysiphe graminis f.sp.Hordei)mlo基因编码一个至少含有6个跨膜螺旋(Membrane spanning helices)的膜蛋白；胡椒的隐性抗马铃薯Y病毒(PVY)基因pvr2则编码真核转录起始因子4E(elF4E)。这些隐性抗病基因都无法用“基因对基因”学说来解释它们的抗病性，它们的具体作用机理也不清楚，只有再克隆更多的隐性抗病基因，才有助于全面解析植物的抗病机制。
白叶枯病是世界范围内水稻最严重的病害之一，也是我国的主要病害。迄今为止，国内外至少已经鉴定了26个白叶枯病抗性基因，其中有显性基因，也有隐性基因。近年来，水稻在显性抗白叶枯病基因的克隆与研究方面有了很大突破，先后图位克隆了三个显性抗白叶枯病基因Xa21、Xa1和Xa26。Xa4和xa5一直是我国水稻生产上利用的主要抗源，其中Xa4是显性基因对我国大多数白叶枯病菌型都有全生育期抗性，它的克隆即将完成(Wang WM，Zhai WX，Luo MZ，Jiang GH，Chen XW，LiXB，Wing RA，Zhu LH.Chromosome landing at the bacterial blight resistancegene Xa4 locus using a deep coverage rice BAC library.Molecular GeneralGenetics.2001.265118-125；Sun X，Yang Z，Wang S，Zhang Q.Identificationof a 47-kb DNA fragment containing Xa4，a locus for bacterial blightresistance in rice.Theor Appl Genet.2003.106(4)683-687)；而xa5是隐性广谱抗白叶枯病基因，通过回交育种构建的xa5基因与其它显性抗白叶枯病基因Xa21和Xa4的聚合系，对白叶枯病抗性水平(比单基因系)显著增强，抗谱拓宽(HuangN.，Augetes E.R.，Domingo J.，Magpantay G.，Singh S.，Zhang G.，KumardivelN.，Bennett J.and Khush G.S.(1997)Pyramiding of bacterial blight resistancegene in ricemarker-assisted selection using RFLP and PCR.Theor.Appl.Genet.95313-320)。最新研究表明xa5基因是通过调节水稻防卫途经来增加对白叶枯病的抗性，对一些白叶枯病病原小种有部分显性效应或加性效应(Li ZK，Sanchez A，Angeles E，et al.Are the Dominant and Recessive Plant Disease ResistanceGenes Similar？A Case Stude of Rice R Genes and Xanthomonas oryzae pv.OryzaeRaces.Genetics.2001，159757-765。)。克隆出xa5基因并通过基因工程将其与其它不同类型的抗病基因聚合有望培育出持久高抗白叶枯病的水稻品种。因此，xa5基因的图位克隆一直是国内外研究的热点，隐性抗白叶枯病基因xa5对菲律宾的几个生理小种呈广谱抗性，最初由Petpisit et al(Petpisit V.，Khush G.S.，KauffmanH.E.(1977)Inheritance of resistance to bacterial blight in rice.Crop Sci.17551-554)鉴定，并被初步定位在第5染色体上(Yang D.，Sanchez A.，Khush G.S.，Zhu Y.，Huang N.(1998)Construction of a BAC contig containing the xa5 locusin rice.Theor Appl Genet.971120-1124)。
发明创造内容本发明的目的是提供一种白叶枯病抗性相关蛋白及其编码基因。
本发明所提供的白叶枯病抗性相关蛋白，名称为xa5，它是具有序列表中SEQ ID№3氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID №3的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且与白叶枯病抗性相关的由SEQ ID №3衍生的蛋白质。
序列表中的序列3是由106个氨基酸残基构成的一个具有保守的氨基端和羧基端结构域的基本转录因子IIA(TFIIA)小亚基。序列3中，自氨基端第2-50位氨基酸残基序列为氨基端保守结构域，具有4个螺旋束；第52至101位氨基酸残基序列是羧基端保守结构域，有12个β折叠。
上述白叶枯病抗性相关蛋白的编码基因(名称为xa5)也属于本发明的保护范围。
上述白叶枯病抗性相关蛋白的编码基因包括其cDNA基因和基因组基因。其基因组基因，可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的多核苷酸；2)编码序列表中SEQ ID №3蛋白质序列的多核苷酸3)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID №1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
序列表中的序列1由13228个碱基组成，其读码框为自5’端第3080到第8589位碱基。自5′端的第2739-2834位碱基为该基因组基因的第一个外显子，自5′端的第2968-3208位碱基为该基因组基因的第二个外显子，自5′端的第3303-3354位碱基为该基因组基因的第三个外显子，自5′端的第8450-8965位碱基为该基因组基因的第四个外显子，自5′端的第3080-3082位碱基为该基因的基因组DNA起始密码子ATG，自5′端的第8587-8589位碱基为该基因的基因组DNA终止密码子TAA；自5′端的第2835-2967位碱基为该基因组基因的第一个内含子，自5′端的第3209-3302位碱基为该基因组基因的第二个内含子，自5′端的第3355-8449位碱基为该基因组基因的第三个内含子。
其cDNA序列具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的多核苷酸；2)编码序列表中SEQ ID №3蛋白质序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID №1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
序列表中的SEQ ID №2由905个碱基组成，该cDNA序列的编码序列为序列表中SEQ ID №2的自5′端第209-529位碱基。
上述高严谨条件为在含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％ SDS的溶液中，65℃下杂交并洗膜。
实验证明，白叶枯病抗性相关蛋白基因xa5为组成型表达。
含有本发明基因的表达载体、细胞系及宿主菌也属于本发明的保护范围。
扩增xa5中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。
本发明的第二个目的是提供一种利用上述白叶枯病抗性相关蛋白编码基因培育抗白叶枯病植物的方法。
本发明所提供的培育抗白叶枯病植物的方法，是将上述白叶枯病抗性相关蛋白编码基因导入目的植物。
可利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的白叶枯病抗性相关蛋白编码基因导入植物细胞，可获得抗病的或抗病增强的转基因细胞系及转基因植株。本发明的白叶枯病抗性相关蛋白编码基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种一般性启动子、增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物或转基因植物细胞进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入可选择性标记(GUS基因、GFP和荧光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记基因(庆大霉素，卡那霉素等)。为了转基因植物释放的安全性，在构建植物表达载体时也可不携带任何标记基因，在苗期接种白叶枯病菌种进行筛选。含有本发明的白叶枯病抗性相关蛋白编码基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导或基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。该方法特别适合于培育抗白叶枯病的水稻。
在育种中，也可通过辅助选择育种方法获得抗白叶枯病水稻，如利用抗白叶枯病水稻品种IRBB5和感病水稻品种杂交得到F1代植株，F1代植株自交得到F2代植株，对得到的F2代植株接种白叶枯病致病菌进行抗性鉴定和利用分子标记K5或K8或SSR3进行PCR检测，确定含有来自IRBB5中较大的渐渗片段的抗性植株，所述含有来自IRBB5材料中较大的渐渗片段的抗性植株自交产生的F3代抗性植株，即为xa5基因纯合型的抗白叶枯病水稻。
本发明的另一个目的是提供一种利用该白叶枯病抗性相关蛋白编码基因的片段检测植物白叶枯病抗性的方法。
本发明所提供的检测植物白叶枯病抗性的方法，是用由序列表中SEQ ID №4和SEQ ID №5的核苷酸序列组成的一对引物对待测植物的基因组DNA进行PCR扩增，然后对得到的PCR扩增产物进行下述1)和2)中的至少一种检测1)对所述PCR扩增产物进行单核苷酸多态性检测，确定自序列表中SEQ ID NO6的5′端第21-22位碱基是否为AG；2)用XhoI酶切所述PCR扩增产物，确定酶切片段中是含有一条145bp带。
序列表中的SEQ ID NO6由165个碱基组成。
如果PCR扩增产物的单核苷酸多态性检测结果是自序列表中SEQ ID NO6的5′端第21-22位碱基(自序列表中序列1的5′端第3195-3196位碱基；自序列表中序列2的5′端第324-325位碱基)为AG，则待测植物抗白叶枯病。
如果用XhoI酶切所述PCR扩增产物，得到的酶切片段中含有一条145bp条带，则待测植物抗白叶枯病。
该检测植物白叶枯病抗性的方法尤其适合于水稻。
本发明对培育抗病植物品种，扩大作物种植范围，提高农作物产量具有重要意义。
下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。
图1为xa5基因被初步定位于RFLP标记S1546和RG556之间图2a为23个阳性克隆的Hind III酶切模式图2b为23个Hind III酶切阳性克隆与BAC克隆40I13 DNA作探针进行的分子杂交图2c为跨叠的9个阳性克隆的Sma I酶切模式图3为xa5基因位点的精细遗传图和物理4为xa5基因的分离图5为与其它生物的TFIIA小亚基氨基酸序列比较图6为本发明的白叶枯病抗性相关蛋白的氨基酸序列保守区域分析图7a-图7b为Xa5和xa5基因在接种P1的感病和抗病材料中的表达情况图8为NIP/IRBB5F3R的SSR3标记检测结果图9为互补实验表达载体pCAMBIA1301Xa5的物理图谱图10a为转基因植株接种病原菌后的表现图10b为T0代转基因植株具体实施方式
下述实施例中提到的实验方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、本发明的白叶枯病抗性相关蛋白及其编码基因的获得1、隐性抗白叶枯病基因xa5的遗传分析及初步定位利用含有xa5基因的抗病亲本IRBB5同近等基因系(感病亲本)IR24进行杂交，所得F1代接种白叶枯病致病菌小种P1(Kauffman H.E.，Reddy A.P.K.，Hsieh S.P.Y.and Merca S.D.(1973)An improved technique for evaluating resistance of ricevarieties to Xanthomonas oryzae.Plant Dis.Rep.57537-547)两周后，测量病斑长度，均鉴定为感病植株。分单株种植F2群体，在植株孕穗期用剪叶法接种同样小种，再根据细菌生长曲线确定感抗植株，病斑长度＜5cm确定为抗性植株，病斑长度≥5cm为感病植株。在640株F2群体中，共有165株感病，475株抗病，感抗比例近似3∶1，表明IRBB5抗病性状确实为隐性的单基因控制。根据先前的研究结果，xa5基因位于RFLP标记RG207、RZ390、RG556和C597附近(Blair M.W.，McCouchS.R.(1997)Microsatellite and sequence-tagged site markers diagnostic forthe rice bacterial blight resistance gene xa5.Theor Appl Genet.95174-184；Yang D.，Sanchez A.，Khush G.S.，Zhu Y.，Huang N.(1998)Construction of aBAC contig containing the xa5 locus in rice.Theor Appl Genet.971120-1124)。由于发现RG207、RZ390标记在IR24和IRBB5亲本间无多态性，发明人根据Harushima等人建立的水稻遗传图谱(Harushima Y，Yano M，Shomura A，Sato M，Shimano T，Kuboki Y，Yamamoto T，Lin SY，Antonio BA，Parco A，Kajiya H，Huang N，YamamotoK，Nagamura Y，Kurata N，Khush GS and Sasaki J1998..A high-density ricegenetic linkage map with 2275 markers using a single F2 poulation.Genetics.148479-494)，用位于C597到S12936区间的6个日本RFLP标记进行亲本间多态性分析，其中C597、C919、S1546、S14158、S12936在亲本间多态性非常明显，随后用RG556、S1546、C597、C919、S14158和S12936这6个有多态的标记对F2群体进行连锁分析，用MAPMAKER软件确定它们同xa5之间的位置关系。将xa5基因定位于S1546和RG556之间(图1)，距S1546与RG556的遗传距离分别为0.8cM和0.5cM。
2、xa5基因位点BAC跨叠群的构建用C597、S1546、RZ390、C919、S12936、S14158和RG556这7个探针对含xa5基因水稻品系IRBB56的文库(Wang WM，Zhai WX，Luo MZ，Jiang GH，Chen XW，LiXB，Wing RA，Zhu LH.Chromosome landing at the bacterial blight resistancegene Xa4 locus using a deep coverage rice BAC library.Molecular GeneralGenetics.2001.265118-125)进行筛选，共获得88个阳性克隆，在这88个阳性克隆中，有23个为RG207、C597和S14158共同检出，其中BAC克隆28N23、100N7、109H1和124H1同时被S12936检出，28N23、100N7、109H1、40I23、64G4、30N9、111B20、97B18和124H1同时由RG556筛到。由于RG207、C597和S14158共同筛到的这23个阳性克隆也包含了其它探针筛到的克隆，故重点对这23个克隆加以分析。将这些BAC克隆DNA用Hind III酶切，根据酶切电泳带型(图2a，Marker为λDNA/HindIII分子量标准)和与BAC克隆40I13 DNA作探针的分子杂交指纹图谱(图2b)，可以把这些BAC克隆分成两组跨叠克隆。第1组28N23、100N7、109H1、124H1、40I23、64G4、111B20、30N9和97B18；第2组112G9、133O22、34G21、55J16、68F20、78H9、85N2、107P23、114I23、118M13、125I13、139M6、70P2和133J8。用C597和RG207作探针杂交，两组克隆分别给出特异的杂交带型；用S14158和RZ390作探针杂交，两组克隆也分别给出特异的杂交带型，但64G4克隆无杂交带；用RG556作探针杂交，只有第1组克隆给出一条杂交带，而第2组克隆不产生杂交带；用S12936作探针杂交，只有第1组的28N23、100N7、109H1和124H1四个克隆产生2条杂交带。根据以上结果推断第1组跨叠克隆群来自第5染色体上xa5位点区域。将这一组9个克隆进行Sma I酶切，根据Sma I酶切电泳图谱(图2c，Marker为λDNA/HindIII分子量标准)确定了这组克隆的相互跨叠关系，得到一个覆盖第5染色体上从C597到S12936包含xa5基因的长约213Kb的跨叠克隆群(图3)。图3中，图片(a)为覆盖xa5基因位点区域的精细遗传图谱，xa5基因定位于K5和T4之间且与T2共分离，横线下面的数字表示该标记在4892个单株中检测到的交换株数，Marker指图谱上的RFLP，SSR和CAPS标记；图片(b)为筛查水稻品系IRBB56BAC文库构建的xa5基因位点的跨叠克隆群和SmaI的酶切图谱(小于3kb的片段忽略不计)，将xa5限定在24kb区域内，▲代表xa5的候选基因。
3、xa5基因的精细定位随着国际水稻基因组(http//www.genome.arizona.edu/fpc/rice/)和中国超级杂交稻基因组计划(http//btn.genomics.org.cn/rice/)的顺利进行，越来越多的序列被锚定在水稻染色体上。根据第5染色体短臂上的序列以及xa5位点跨叠BAC克隆的部分测序设计出一系列的SSLP和CAPS标记(表1)，这些以PCR为基础的标记有效地加速了xa5基因的精细定位。利用这些标记对扩大的含4892单株的F2定位克隆群体(Zhong Y.M.，Jiang G.H.，Chen X.W.，Xia Z.H.，Li X.b.，Zhu L.H.and Zhai W.X.(2003)Identification and gene prediction of a 24kb regioncontaining xa5，a recessive bacterial blight resistance gene in rice(Oryzasativa L.).Chinese Science Bulletin，48(24)2725-2729)进行分析，获得含xa5基因位点区域的高密度遗传图。xa5基因被定位于CAPS标记K8和T25之间且与T2共分离，其中K8标记检测到1个交换单株，T25标记检测到3个交换单株，它们之间的遗传距离约为0.3cM(图4(a))。图4(b)为来自30N9或44B4 BAC克隆的13.2kb HindIII片段，它含有完整的xa5或Xa5基因；(c)xa5基因的结构及其在抗病和感病材料里的碱基替换的位点。
为了确定xa5的物理位点，用所设计的CAPS和SSLP标记引物对组成跨叠克隆群的9个BAC克隆(28N23、100N7、109H1、124H1、40I23、64G4、111B20、30N9和97B18)进行扩增，并用Sma I酶切的BAC克隆Sma I片段进行验证，从而确定出xa5位点区域的各标记物理位置与Sma I内切酶图谱(图3b)。分析结果表明所有跨叠的9个BAC克隆都包含K5和T4标记，但30N9最小。根据K8-T25区间的部分序列测定，并与国际水稻基因组计划提供的序列(http//www.genome.arizona.edu/fpc/rice/)比较，发现K8和T25均位于国际水稻基因组AC129716克隆上，二者之间的序列长度约为10.9kb。
为了验证定位结果，利用日本晴和IRBB5的杂交组合，又构建了包含近2万单株的F2群体。其定位结果先前的定位结果一致。
表1 本发明过程中所创制的标记和引物
用Genescan软件(http//genes.mit.edu/GENSCAN.html)对10.9kb的序列进行基因预测，发现1个明显的开放阅读框(ORF)，编码转录因子TFIIA小亚基；并将此10.9kb序列对日本已测序的水稻28,000多个cDNA克隆进行同源搜索(http//cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA)，得到1个编码TFAII小亚基的cDNA克隆AK065182，它包括4个外显子(大小分别为96bp，241bp，52bp和516bp)和3个内含子(大小分别为133bp，94bp和5095bp(图4(c))。
根据预测的候选基因设计引物对抗病材料IRBB5，IRBB56，IRBB4以及感病材料IR24，IR64的cDNA和基因组DNA进行扩增和测序，发现抗病材料的候选基因TFIIA小亚基的编码区，与Xa5相比，在氨基端内(自序列表中序列1的5′端第3195-3196位碱基；自序列表中序列2的5′端第324-325位碱基)有两个碱基的替换(TC变成AG)，造成一个氨基酸的改变(序列表中序列3的自氨基端第39位缬氨酸残基变成谷氨酸残基)(图4(c))。将该位置为谷氨酸的蛋白质命名为xa5，它具有序列表中序列3的氨基酸残基序列，具有序列表中序列1的基因组序列，具有序列表中序列2的cDNA序列。
为了进一步确定这两个碱基的替换在抗病材料和感病材料里的一致性，根据IRBB5的序列设计了一对CAPS引物D5对IRBB5、NIP/IRBB5F3R和20多种感病品种(Nipponbare、IR24、MH63、K2908、ShuHui(蜀恢)527、Sdg、WP、Chuanghui(创恢)11、ZYQ(窄叶青)、MH(明恢)86、Lijiang(丽江)、PA64S、NJ(南京)6、Zhonghua(中花)11、NJ(南京)11、D62B、Zhi(制)7、9311、TP(台北)309、JingXi(京系)17、MianHui(绵恢)725(以上感病材料购于中国农业科学院品质所和中国水稻所)进行扩增和XhoI(识别位点为CTCGAG)酶切，图4c中xa5基因的部分序列是CAAGTTCTTGAG，但所设计的D5正向引物3‘端序列是CAAGTTCTCG，因此抗性材料的DNA扩增出的PCR产物含有XhoI的识别位点CTCGAG)酶切，结果显示只有IRBB5和NiP/IRBB5F3R的PCR产物被切开产生一条145bp的带，其它感病材料的PCR产物不能被切开，表现为一条165bp的带，表明这两个碱基在抗病和感病材料里的替换与它们的抗病和感病是相关的(图4(d))。说明xa5是白叶枯病抗性相关蛋白。
其中，抗白叶枯病水稻NIP/IRBB5F3R(即用于Xa5基因功能互补验证的转化体系)的获得方法如下利用感病材料Nipponbare(粳稻)和抗病材料IRBB5(籼稻)杂交得到F1代植株，F1代植株自交得到F2代植株，对得到的F2代植株接白叶枯病致病菌小种P1进行抗性鉴定和利用13.2kb DNA片段两侧分子标记(K5，K8和SSR3)进行PCR检测，确定含有来自IRBB5材料中较大的渐渗片段(因为分子标记K5，K8和SSR3在IR24(Nipponbare)和IRBB5两亲本之间是有多态的，即这些标记的PCR产物酶切后或直接经过琼脂糖凝胶电泳能显示出两个亲本之间的带型不一样，那些F3植株的DNA用K5，K8，SSR3标记进行PCR检测后能显示出IRBB5的带型，这个较大的渐渗片段指这些植株具有来自IRBB5，且含有从K5到SSR3标记这一段较大的DNA片段)的抗性植株，这些含有来自IRBB5材料中较大的渐渗片段的抗性植株自交产生的F3代抗性植株，对白叶枯病菌P1(PXO61)和P2(PXO86)均具有抗性，该F3代抗性植株即为粳稻背景下含纯合的xa5基因材料NIP/IRBB5F3R(图8显示了SSR3标记检测的结果)。
对序列表中序列3的氨基酸残基序列进行序列分析，发现它是基本转录因子IIA(TFIIA)的小亚基，由TFIIA_gamma_N，TFIIA_gamma_C 2个保守区域组成，全长106个氨基酸中，第2至第50个氨基酸为TFIIA_gamma_N保守区，有4个螺旋束；第52至101为TFIIA_gamma_C保守区，有12个β折叠。突变位点位于TFIIA_gamma_N保守区(图6)。其与其它生物的TFIIA小亚基序列，如074948(Fission Yeast)，Q39236(Arabidopsis)，008950(Rat)，P52656和Q9W5B9((Fruit fly)，XP_510452(Human)，NP_012865(Baker’s yeast)相比，具有高度的保守性(图5)(以上字母数字均为各种生物的TFIIA小亚基的蛋白质代号，可从www.ncbi.nlm.nih.gov搜寻到它们的蛋白质序列。图5中的“○”显示与抗性有关的谷氨酸。)实施例2、功能互补实验在构建xa5基因位点跨叠克隆群时，还用K8，T2，T23，T25，T4和SSR3等标记筛查了含xa5显性等位基因Xa5的水稻品系IR64 BAC文库，获得一个阳性BAC克隆44B4，并显示在44B4上有相对应的13.2kb等位片段，用HindIII酶切44B4 BAC克隆后，得到一个13.2kb片段，核苷酸序列测定结果表明它含有完整的xa5显性等位基因Xa5，从IR64基因组DNA中分离了一个含Xa5基因的长13.2kb HindIII片段，将它克隆入pCAMBIA1300的两个HindIII位点之间，得到重组表达载体pCAMBIA1300-Xa5(图9)。并用它来转化含xa5基因纯合隐性位点的水稻抗性品种NiP/IRBB5F3R，获得了42株呈潮霉素抗性的T0代转基因植株，经过苗期接种P1鉴定和用与xa5基因共分离的标记T2或S5(S5是xa5基因内部标记)进行PCR检测(如图10a-图10b)，确定有37株表现为感病并含有转入目标片段，而未转入目标片段的植株仍表现为抗病，初步证明了本发明的白叶枯病抗性相关蛋白编码基因为隐性基因。随后，在海南播种了它们的自交后代，这些T1代转基因植株表现为3:1感抗分离。图10a中，1，IRBB5；2，IRBB5和日本晴杂交F3代中的抗病植株NiP/IRBB5F3R；3，Nipponbare；4，T0代转基因植株；图10b是xa5基因内部标记S5/NcoI对转基因植株的检测结果，将转基因植株的PCR产物经过NcoI酶切，表明具有IRBB5和IR24两种亲本带型的植株都含有完整的13.2kb转基因片段。
实施例3、xa5基因的表达分析用白叶枯病生理小种P1对抗病材料IRBB5(含xa5基因)和感病材料日本晴(Nipponbare)(含Xa5基因)在苗期进行剪叶法接种处理，并以水处理作为对照，然后按处理后0，12，24，48，96小时取样提取RNA，并对各样品RNA进行RT-PCR分析。引物为基因xa5或Xa5内的一对特异性扩增引物J5(此引物在cDNA中能扩出614bp的片段，在基因组DNA中能扩增出1024bp，它的正向引物位于第二个外显子，反向引物位于第四个外显子，包含2个内含子)，用Actin引物作为对照。结果如图7a-图7b(M为DL2000；数字显示接种时间；图7a接种P1；图7b，注射水作为对照)所示，表明xa5或Xa5基因不受P1的诱导。表明该xa5基因如同所克隆的其他多数植物抗性基因(如Xa21等)一样，为组成型表达。(J5是根据xa5或Xa5基因序列设计的标记，用于检测它们的表达情况(xa5或Xa5基因表达序列中只有两个碱基的不同)。
实施例4、培育抗白叶枯病的水稻以IRBB5的cDNA为模板，以xa5F 5’-GTTCTAGAATCGCCCATGGCCACC-3’和xa5R5’-GTCCCGGGGAGACTAACAAATACC-3’为引物(序列中含有将其克隆入含35S启动子的pZh01(Xiao H，Wang Y，Liu D，Wang W，Li X，Zhao X，Xu J，Zhai W，Zhu L.(2003)Functional analysis of the rice AP3 homologue OsMADS16 by RNA interference.Plant Mol Biol.52(5)957-966.)的限制性内切酶识别位点，在正向引物中有XbaI位点TCTAGA；在反向引物中有SmaI位点)，PCR扩增xa5基因的cDNA。其中，反应体系1ng基因组DNA，正反向引物各0.25μM，1.5mM MgCl2、20mMTris-HCl(pH8.4)、50mM KCl、0.8mM dNTP混合物，以及0.5个单位的pfu聚合酶(上海生工生物工程技术服务有限公司)。反应条件先94℃5分钟；再94℃30秒，55℃1分钟，72℃3分，共30个循环；最后72℃5分钟。将扩增得到的389bpDNA片段用凝胶回收试剂盒(北京天纬时代科技有限公司科技有限公司)按供应商提供的方案回收该片段，利用限制性内切酶将其连接入含35S启动子的pZh01相应的XbaI和SmaI位点，将得到的连接产物转化大肠杆菌DH5α，经克隆筛选和酶切鉴定，得到含有xa5基因cDNA的重组表达质粒pZh01-xa5。将pZh01-xa5通过农杆菌LBA4404的介导转入感病材料Nipponbare的愈伤组织，将该愈伤组织用选择培养基(N6培养基的无机盐，B5培养基的微量元素和维生素，水解酪蛋白1g/L，脯氨酸500mg/L，蔗糖30g/L，2，4-D 2mg/L，植物凝胶2.0g/L，羧苄青霉素500mg/L，潮霉素50mg/L pH 5.8)培养21天后继代第一次，以后每14天继代一次，一个月左右，在褐色或黑色的愈伤组织上长出白色的抗性愈伤组织；该抗性愈伤组织经过常规培养分化出芽与根，得到幼苗。对得到的幼苗利用dCAPS标记D5/XhoI进行PCR鉴定，得到37株转xa5基因植株。将转xa5基因植株分别接种白叶枯病菌P1和P2，结果显示转基因植株叶片病斑长度远小于对照(未转入xa5基因的Nipponbare)，说明转xa5基因高表达植株对白叶枯病菌P1和P2均具有抗性。
实施例5、培育抗白叶枯病能力增强的水稻按照实施例2将来自BAC克隆30N9的13.2kb DNA片段插入pCAMBIA1300，构建成pCAMBIA1300-xa5质粒；然后将其导入抗病材料IRBB4，IRBB3，IRBB13和IRBB21，得到转xa5基因植株。将转xa5基因植株分别接种白叶枯病菌P1，P2，T3和P6，结果表明转基因植叶片病斑长度明显小于对照，说明转xa5基因植株对白叶枯病菌P1、P2、T3和P6均具有抗性，且抗病力更强的，抗谱更宽。
序列表<160>6<210>1<211>13228<212>DNA<213>水稻属水稻(Oryza sativa var.Lansheng)<400>1agcttcctat ctcgactata acgctttgga tttgttaaaa aaaacttgaa tcgtgggata 60cgctattttt aaatgagaac tggaacatct gagttgaatg cttgacaaat tgagttgtaa 120gttttcttga gttataagat gacatctaaa ggtttagttt ttttttcttt taatttgaat 180ttcctcgcta aaaataaggt tgaatttaat ctcaaatttt agctgaacat tgcaccgcta 240cccattcatt gtatcaaatt agactgctac atacagctac tgtagtgtga caatgcccat 300ctgttttctg aagaagaaac aaaagaatgc ttagctgtct gtcgtttctt aatcaccctc 360ttcgtttatc cagctttatc tttctccaaa ttctcatcac ctgataaaat ccgtatgttg 420gatttcatgc atgagcctgc aaattacagg cgtatgtttt ccttgaaaac actcaattcc 480tttctgatta gaatttcaca gaattctata aaaccctgca gaattcatat taaatcgatg 540gcttaaactg ctgaccgcta attaatgctt cataattgga agtgcttatt gtatgacaaa 600aatgacaata gcgatggctg gtactggagc ttccaactac aatccttgaa catggttagt 660tgcctaatac ctcccctgat gtgcctctgc gatctaattg cttgcctgca gtgaccatct 720aattattcaa gtgtatatac accttgtcgg tcggctatat ctctatttag tttatatttt 780gcaaccttaa ttacacgtaa cacatatacg aacacgcaac catatcatca agcacagggc 840ggcacgcatc tacagcctgc agttcatgct gtgttgttta agaaggaaaa tgattttttt 900ttaaaaaaaa agaagaggaa gaagatatga ttatctatct actgtagtga aagtgtcaac 960atgacgacgt gcagcggaat agtacatcaa acataaagta gtacacctaa ttatattggt 1020accaaaagat aacccgtagc agtaacaagt tgttaattgt tgattctaaa ttttgaggac 1080atatgccgtg aaaacgagtt aagtattgaa aactcgtgaa aaatcatgaa aaaaattaca 1140ttctcaccga atcttatgtt caaacttagc tttattcgag agtaaaaata aatatttttt 1200aggtgaatag taactatttt caggtgaatg gtaaaaaaga caaataaact caactttatt 1260tgggaatgaa aatccacttg aaatttgtca tttttattac tctcaaatga agctgagttt 1320ggacttgaca tttggtgaga atgtacttca aatctacaca tatctctagc aaatgtttca 1380tgaatttact aaacttttag gtatgatttc acgagttttc aacacttagc tcgttttcac 1440agagtatttc cctagtcgtc gctatgcccg cgtatacttc gtcccccctg gatgtcaagg 1500tctccatgga tgtgcacaga tgataaactg tagtgtgctt agcatatcgc gagactatcg 1560ggtaatggac aactcatatt taattgtgct agagaaaaaa aaaagataaa ttgcagtttg 1620tactatatat tcttgaaagt gttcatatta tatcatcgtt taaccatttt tttcatatac 1680acaacatcta actttacatt tcattttgga ctaccccatt ctatccatct tcaaggccgg 1740
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<210>5<211>20<212>DNA<213>水稻属水稻(Oryza sativa var.Lansheng)<400>5tgctcttgac ttggttctcc 20<210>6<211>165<212>DNA<213>水稻属水稻(Oryza sativa var.Lansheng)<400>6gctcgccatt caagttcttg agcagtttga taaggtatct actttaccat atctccttcc60acctattact atctatacta ttgaaaaatt cgactcctca ttttgtttgt tatcatctat120gtgattagtc tatgacggaa gccttggaga accaagtcaa gagca16权利要求
1.白叶枯病抗性相关蛋白，它是具有序列表中SEQ ID №3氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID №3的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且与白叶枯病抗性相关的由SEQ ID №3衍生的蛋白质。
2.权利要求1所述的白叶枯病抗性相关蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于所述编码基因具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的多核苷酸；2)编码序列表中SEQ ID №3蛋白质序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID №1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
4.根据权利要求2所述的基因，其特征在于所述编码基因具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的多核苷酸；2)编码序列表中SEQ ID №3蛋白质序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID №1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
5.含有权利要求2或3或4所述基因的表达载体，细胞系和宿主菌。
6.培育抗白叶枯病植物的方法，是将权利要求2或3或4所述白叶枯病抗性相关蛋白编码基因导入目的植物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述植物为水稻。
8.一种获得抗白叶枯病水稻的方法，是利用抗白叶枯病水稻品种IRBB5和感病水稻品种杂交得到F1代植株，F1代植株自交得到F2代植株，对得到的F2代植株接种白叶枯病致病菌进行抗性鉴定和利用分子标记K5或K8或SSR3进行PCR检测，确定含有来自IRBB5中较大的渐渗片段的抗性植株，所述含有来自IRBB5材料中较大的渐渗片段的抗性植株自交产生的F3代抗性植株，即为xa5基因纯合型的抗白叶枯病水稻。
9.检测植物白叶枯病抗性的方法，是用由序列表中SEQ ID №4和SEQ ID №5的核苷酸序列组成的一对引物对待测植物的基因组DNA进行PCR扩增，然后对得到的PCR扩增产物进行下述1)和2)中的至少一种检测1)对所述PCR扩增产物进行单核苷酸多态性检测，确定自序列表中SEQ ID NO6的5′端第21-22位碱基是否为AG；2)用XhoI酶切所述PCR扩增产物，确定酶切片段中是含有一条145bp条带。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述植物为水稻。
全文摘要
本发明公开了一种白叶枯病抗性相关蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的白叶枯病抗性相关蛋白，它是具有序列表中SEQ ID №3氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID №3的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且与白叶枯病抗性相关的由SEQ ID №3衍生的蛋白质。可利用该白叶枯病抗性相关蛋白编码基因的片段检测植物白叶枯病抗性，如用由序列表中SEQ ID №4和SEQ ID №5的核苷酸序列组成的一对引物对待测植物的基因组DNA进行PCR扩增，然后对得到的PCR扩增产物进行检测。本发明对培育抗病植物品种，扩大作物种植范围，提高农作物产量具有重要意义。
文档编号C12N15/63GK1807453SQ200510002390
公开日2006年7月26日 申请日期2005年1月19日 优先权日2005年1月19日
发明者翟文学, 朱立煌, 江光怀, 夏志辉 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所