专利名称：水稻隐性抗白叶枯病主效基因xa25和它在水稻抗病改良中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及一个水稻抗白叶枯病隐性基因xa25 的分离克隆、功能验证和应用研究。抗病隐性基因xa25能够赋予水稻抵抗由白叶枯病菌引起的病害。抑制xa25基因的表达能够进一步增强水稻对白叶枯病的抗性。
背景技术：
植物在生长的过程中，受到多种病原物的侵害。植物病原物的种类繁多，包括病毒、细菌、霉菌和线虫等。病原物侵入植物导致两种结果(1)病原体成功的在寄主植物内繁殖，引起相关的病症；( 寄主植物产生抗病反应，杀死病原物或阻止其生长。利用抗性基因资源改良植物的抗病性，是预防病害同时又保护环境的根本出路。植物的抗病反应是多基因参于调控的复杂过程。参于植物抗病反应的基因分为两大类(Kou和Wang，2010)。第一类是受体(receptor)基因，包括抗病(disease resistance) 主效基因，又称R基因和宿主模式识别受体(host pattern recognition receptor)基因。 第二类是抗病相关(defense-related 或 defesne-responsive)基因。根据目前人们对抗病基因功能的认识，抗病基因的产物主要是作为受体，直接或间接与病原蛋白相互作用，启动植物体内的抗病信号传导路径(Chisholm等，2006)。抗病基因介导的抗病反应抗性强，是很好的基因资源。但是农作物中抗病基因的资源有限。水稻白叶枯病是一种非常严重的病害，由稻黄单孢杆菌中的致病变种 Xanthomonas oryzaepv. oryzae (Xoo)侵染引起，是世界上对水稻危害最大的细菌性病害之一(过崇俭，19卯)。受侵染的水稻一般减产20-30%，严重时能够达到50% (0u，19^)。白叶枯病造成米质松脆，发芽率降低。如果在分蘖期出现凋萎型白叶枯，则造成稻株的大量枯死，损失会更大。水稻中抗病主效基因的资源非常有限。如目前命名的抗白叶枯病主效基因只有大约30多个，其中只有6个被分离克隆了(储昭晖和王石平，2007)。每一个抗白叶枯病主效基因只对部分白叶枯病菌生理小种有抗性，即不同的抗病主效基因具有不同的抗
■i並曰O控制白叶枯病害流行的最好的方法是利用抗性基因资源改良水稻品种的抗性。转基因技术为品种改良提供了高效途径。但利用这一途径的前提是必须具有优良抗性基因克隆。
发明内容
本发明的目的是分离克隆水稻中的隐性抗白叶枯病主效基因xa25，并采用RNA干扰技术(RNA interference，RNAi)、利用人工微小RNA(artificial microRNA)，通过使xa25 基因沉默，高效利用这个基因改良水稻品种抵御病害的能力。本发明涉及分离和应用包含xa25基因的DNA片段，它的核苷酸序列如序列表 SEQ IDNO :1所示，它编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO 1中第201-252、1201-1237、1352-1562、1804-1965、2095-2214和2330-2635位所示。该基因(片段)赋予水稻对由白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)所引起的病害产生特异性的抗病反应。这一发明适用于所有对该病原菌敏感的植物。这些植物包括单子叶植物和双子叶植物。除上述所述的如SEQ ID NO :1所示的DNA片段外，本发明所定义的基因还包括基本上相当于SEQID NO 1所示的DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID NO=I所示序列的亚片段。对序列表SEQ ID NO :1所示序列进行生物信息学分析表明，该DNA序列编码的蛋白质属于MtN3/saliva家族。可以采用已经克隆的xa25基因作探针，从cDNA和基因组文库中筛选到本发明的基因或同源基因。同样，采用PCR(polymerase chain reaction)技术，也可以从基因组、 mRNA和cDNA中扩增得到本发明的xa25基因以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段 DNA。采用以上技术，可以分离得到包含xa25基因的序列或者包含一段xa25基因的序列， 将这一序列与合适的载体连接，可以转入植物细胞抑制其自身的xa25基因的表达，产生高抗白叶枯病的转基因植物。采用这种转基因技术创造抗病植物是传统育种技术所不能达到的。本发明为增强水稻对白叶枯病菌的抗性提供了一种新的方法。这种方法包括将 xa25基因的部分片段和与能够表达人工微小RNA (artificial microRNA, amiRNA)的载体连接、转入水稻，通过抑制其自身xa25基因的表达进一步提高水稻对白叶枯病的抗性。在本发明的实施例部分，我们阐述了隐性抗病主效基因xa25的分离、功能验证和应用过程以及该基因的特点。
序列表SEQ ID NO 1.本发明分离的隐性水稻抗白叶枯病主效基因xa25的核苷酸序列，该基因来源于抗病水稻品种明恢63。序列表SEQ ID NO 2.本发明分离的隐性水稻抗白叶枯病主效基因xa25编码的氨基酸序列。序列表SEQ ID NO 3.本发明分离的隐性水稻抗白叶枯病主效基因xa25的显性等位基因)Ca25的核苷酸序列，该基因来源于感病水稻品种珍汕97。序列表SEQ ID NO 4.本发明分离的隐性水稻抗白叶枯病主效基因xa25的显性等位基因)Ca25编码的氨基酸序列。图1.本发明鉴定和分离克隆水稻抗白叶枯病隐性基因xa25和它的等位显性基因 Xa25、以及xa25和)(a25基因功能验证的流程图。图2.从珍汕97/明恢63F3群体中随机选择255个F3单株分析对白叶枯病菌菌株 PX0339的病斑分布。图3.利用4个分子标记初步将隐性抗白叶枯病主效基因xa25定位在水稻12染色体的着丝粒区。分子标记间的数值表示遗传距离，实心黑色圆圈示着丝粒区。图4.精细定位隐性抗白叶枯病主效基因xa25。分子标记间的数值表示遗传距离。 括号中的数字代表xa25位点与相应的分子标记间检测到的重组事件数量。图5.用于遗传转化的感病品种珍汕97中的包含显性基因)Ca25候选基因 (0sl2g29220)的DNA片段和)(a25候选基因(0sl2g^220)的结构。图中长粗横线条代表长5213个核苷酸(nt)的遗传转化片段。横柱条表示外显子，其中黑色部分代表编码序列， 白色部分代表5’端和3’端的非翻译区；横线条代表内含子；数字表示各个结构的碱基数； “ATG”和“TAG”分别是翻译起始密码和终止密码。图6.遗传转化载体pCAMBIA1301的结构。图7.对明恢63遗传背景(D1750MH7)和中花11遗传背景(D1750ail)的遗传转化T1代家系进行基因型和表型共分离分析。说明与)Ca25候选基因与感病表型共分离。病斑面积为苗期接种白叶枯病菌菌株PX0339两周后的数据。图8.抗病水稻品种明恢63中隐性抗白叶枯病主效基因xa25的结构。图中横柱条表示外显子，其中黑色部分代表编码序列，斜线部分是5’ -和3’ -UTR;横线条代表内含子；数字表示各个结构的碱基数；“ATG”和“TAG”分别是翻译起始密码和终止密码。图9.在苗期和成株期(孕穗期)，抗病水稻品种明恢63的隐性基因xa25和感病水稻品种珍汕97的显性基因)Ca25在接种病原菌菌株PX0339之后的表达模式。看家基因 actin的表达量作为样品量一致性的参照。ck 未接种；1、2、3 接种PX0339后1、2、3天。
具体实施例方式本发明的前期研究结果显示籼稻(Oryza sativa L. ssp. indica)品种明恢63特异性抗白叶枯病菌菌株PX0339，而明恢63所具有的这一特异性抗性可能是由它携带的、位于12号染色体着丝粒区段的一个抗白叶枯病主效基因)Ca25(t)(临时命名)调控的(Chen 等，2002)。这个基因就是本发明中的隐性抗白叶枯病主效基因xa25。以下实施例中进一步定义本发明。图1描叙了遗传定位和分离克隆隐性抗白叶枯病主效基因xa25和它的等位显性基因)(a25、验证xa25和)(a25基因功能和高效利用隐性基因xa25改良水稻抗性的流程。根据以下实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。实施例1 精细定位隐性抗白叶枯病主效基因xa251.实验材料和接种方法用携带隐性抗白叶枯病主效基因xa25的抗病水稻品种明恢63为父本、携带这个隐性基因的等位显性基因)(a25的感病水稻品种珍汕97 (Oryza sativa L. ssp. indica)为母本，构建F2群体。明恢63还携带抗白叶枯病主效基因等，2004)。为了排除基因对精细定位隐性抗白叶枯病主效基因xa25的影响，本发明研究人员利用 Xa3/Xa26 基因的特异性 PCR 引物(5，-AACTCCAACAGTATGTCCACCTTT-3，)和 Xa26PR( 5‘ -GCATTGGCAGCAAGAGTAT-3‘)检测这个F2群体中的单株，选取了 60个在位点为珍汕97纯合带型(不携带基因)，在xa25位点两侧的分子标记RM179和R1C8172 为杂合带型的单株。这60个F2单株后代组成珍汕97/明恢63F3群体，由5816个F3单株组成。在该群体中随机选取255个&单株，用于初步定位隐性抗病主效基因xa25。进一步利用该群体中的795个极端抗病F3单株精细定位xa25。白叶枯病菌接种采用剪叶法对苗叶)期和成株(孕穗)期的水稻进行接种 (Sun等，2004)。白叶枯病菌株由菲律宾国际水稻研究所惠赠(Sim等，2004 ；Wu等，2008)。 白叶枯病菌的培养遵循已经公开发表的方法(Sim等，2004)。接种14天后调查病斑长度(厘米)或病斑面积(病斑长度/病叶长度X 100% )。2.初步定位隐性抗白叶枯病主效基因xa25为初步定位隐性基因xa25，对5816个单株组成的珍汕97/明恢63F3群体在苗期接种白叶枯病菌菌株PX0339，从中随机选择255个单株组成随机群体，分析病斑长度。在该随机群体中病斑长度呈现一个明显的双峰分布，两峰的峰谷处于3. 3cm的位置(图2)。 以这个峰谷为抗病和感病单株的分界线，将病斑长度< 3. 3cm视为抗病单株，将病斑长度 ^ 9. 5cm的视为感病单株。按照这一分类标准，这个随机群体中的抗病个体有55株，感病个体有200株。抗病单株数和感病单株数之比符合1 3 ( χ 2 = 1.698，P >0.05)分离比，证明明恢63对PX0339的抗性由单一隐性抗病主效基因调控。根据本发明研究人员的前期工作基础，明恢63中调控对PX0339抗性的主效基因位于水稻12号染色体的两个分子标记R887和G1314之间(Chen等，2002)。本发明研究人员选取了 R887和G1314这两个分子标记附近的 3 个 SSR(simple sequence r印eat)分子标记 RM179、RM511、RM28172 和一个Indel (insertion/deletion)分子标记MZ2对这个由255个F3单株组成的随机群体进行分析。其中的SSR标记为国际上的通用分子标记(http //www. Gramene. org ； International Rice Genome Sequencing Project 2005) ；Indel 丰示i己贝Ut艮SItR禾禾中曰月恢63和珍汕97的基因组序列(Xie等，2010)设计。Indel标记MZ2是PCR标记，用引物 MZ2F(5，-CCTAATGCAACGCTGAAGTG-3，)和 MZ2R(5，-AATGAGTTCTCCGTGGGTTG-3，)扩增检测。 利用这4个分子标记将该隐性基因定位到12号染色体着丝粒区，同本发明研究人员前期定位的fe25(t)基因位置在同一区段(Chen等，2002)。因为该隐性抗病主效基因与)Ca25 (t) 基因可能为同一个基因，我们将其命名为xa25。xa25基因与分子标记RM511共分离，距分子标记MZ2为1. 2cM，距分子标记RM28172为0. 4cM(图3)。3.精细定位隐性抗白叶枯病主效基因xa25对5816个单株组成的珍汕97/明恢63F3群体在苗期接种白叶枯病菌菌株PX0339， 从中选取795个极端抗病单株(平均病斑长度< 2cm)用于精细定位隐性基因xa25。先用位于该基因两侧Indel标记MZ2和SSR标记R1C8172来筛选其中的重组单株。在基因的一侧，用MZ2检测到6个重组单株(图4)。在基因的另一侧，用R1C8172检测到另外6个重组单株(图4)。为更进一步精细定位xa25，利用位于MZ2和R1C8172之间的两个hdel标记 MZ4、MZ7和一个SSR标记RM511来检测这12个重组单株。Indel标记MZ4和MZ7根据水稻品种明恢63和珍汕97的基因组序列(Xie等，2010)设计。MZ4和MZ7都是PCR标记，分别用引物 MZ4F(5，-GCGAATGATGTGAGAGGTGA-3，)禾口 MZ4R(5，-CGGAGATCAATCTGCAACCT-3，)以及引物 MZ7F(5，-GGAACCCATCCACCTAATCC-3，)和 MZ7R(5，-GAATGGTGCCCTAACGTTCT-3，)扩增检测。用MZ7检测在R1C8172 —侧的6个重组单株中发现一个重组事件(图4)。MZ4和 RM511在这个12个重组单株中没有检测到重组事件(图4)。为确认该定位结果，对这12 个重组单株进行了后代(F4)验证。来源于每个F3重组单株分别种植20个F4单株个体，苗期接种PX0339，所有后代均表现出抗病。进一步验证了 xa25定位的准确性。因此xa25被定位到分子标记MZ2和MZ7之间。实施例2 显性基因)(a25的分离和功能验证1.显性)(a25候选基因的确定根据Gramene数据库的信息(http://www, gramene. org/Oryza sativa japonica/
6mapview ？ chr = 12)，分子标记MZ2和MZ7间的物理距离大约为1，2331Λ。根据水稻基因 [Rice Genome Annotation Project(RGAP) :http: //rice, plantbiology. msu. edu/1的信息，该1233-1Λ区段包含一个MtN3/saliva基因家族的成员(RGAP位点编号为0sl2g^220)。0sl2g29220基因与水稻中已经报道的隐性抗白叶枯病主效基因xal3同属一个基因家族(Chu 等，2006 ；Yuan 等，2010)。采用 PCR 引物 seF3 (5，-TCACTAAATTGGCTAT GGCTAG-3，)、seF5(5，-CTTGTGGAGCAAACATTCG-3，)、seF8(5，-CTCCCTCGGCTGGGTCTGC-3，)、 seF13(5，-GGAGGAGACAAGCTACCA-3，)、美国 Perkin Elmer 公司的测序试剂盒(Big Dye Kit)，根据试剂盒说明书以双脱氧核苷酸末端终止法分别对感病品种珍汕97和抗病品种明恢63中的0sl2g29220基因进行测序，发行这两个水稻品种中的0sl2g29220基因的编码区有3%的变异(序列表SEQ ID NO 1和序列表SEQIDN0 2)。故将感病品种珍汕97中的 0sl2g29220基因视为显性基因)(a25的候选基因。2. Xa25候选基因的分离和功能验证本发明研究人员采用长链PCR的方法，利用PCR引物)(a25F3 (5，-CGCGGATCCAAACGT ATGGCAGAGGTTCAGGTAGCC-3 ’)和 Xa25R3 (5 ’ -CGGGGTACCCAGTCATGGAAGTACGAAATCAGGAAA-3 ’) 从感病水稻品种珍汕97中扩增了包含显性基因)Ca25的候选基因(0sl2g29220)、长大约 5. 21Λ的DNA片段(图5)。该片段包含了候选基因的自身启动子区(1569个核苷酸)、候选基因(3102个核苷酸)和候选基因下游序列(542个核苷酸)。本发明所遗传转化载体是pCAMBIA1301 (图6)，它是常用的水稻遗传转化载体 (Sum等，2004)。将上述DNA片段经BamHI、KpnI双酶切处理，与同样用BamHI、ΚρηΙ双酶切处理的农杆菌介导的遗传转化载体PCAMBIA1301连接。通过酶切验证阳性克隆，获得的重组质粒被命名为D1750。采用农杆菌介导的遗传转化方法，将D1750分别转入携带隐性抗白叶枯病主效基因xa25的抗病水稻品种明恢63和中花11中。分别获得20株和19株遗传转化植株。将在明恢63、中花11背景中获得的转化植株分别命名为D1750MH和D1750ZH。在苗期对所有Ttl代转化植株接种白叶枯病菌菌株PX0339，接种14天后调查病斑面积。同时取样抽取DNA，采用遗传转化载体所携带的报告基因GUS(i3-葡萄糖酸酸酶)的 PCR 引物 GusF (5，-CCAGGCAGTTTTAACGATCAGTTCGC-3，)和 GusR(5‘-GAGTGAAGATCCCTTTCTT GTTACC-3’)扩增检测阳性遗传转化植株。在明恢63背景中，15株遗传转化阳性植株的病斑面积为30. 6士7. 4%至50. 6士3. 9%，抗病对照明恢63的病斑面积为6.5士 1. 1%，感病对照珍汕97的病斑面积为49. 9士7. 6% (表1)。在中花11 背景中，15株遗传转化阳性植株的病斑面积为19. 7士2. 9%至31. 3士7. 4%，抗病对照中花 11的病斑面积为4. 3 士 1.0% (表2)。表1. T0代遗传转化植株(D1750MH，明恢63背景)对白叶枯病菌菌株PX0339的反
应
权利要求
1.一种分离的对白叶枯病产生抗性的隐性基因Xa25，它的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO 1 所示。
2.一种分离的对白叶枯病产生抗性的隐性基因xa25，它的编码序列如序列表SEQ ID NO 1 中第 201-252、1201-1237、1352-1562、1804-1965、2095-2214、2330-2635 位所示。
3.权利要求1或2所述的基因在增加水稻对白叶枯病抗性中的应用。
4.权利要求3所述的应用，其特征包括通过抑制隐性基因xa25的表达，培育高抗白叶枯病水稻的方法。
全文摘要
本发明涉及植物生物技术领域。具体涉及包含水稻隐性抗白叶枯病主效基因xa25以及xa25的等位显性基因Xa25的两条DNA片断的分离克隆、功能验证和应用。利用基于人工微小RNA(artificial microRNA，amiRNA)干扰技术原理的转基因技术，将隐性基因xa25的部分DNA片段与外源调节序列连接并转入水稻，抑制水稻中隐性基因xa25的表达，可进一步增强水稻对白叶枯病的抗性。
文档编号C07K14/415GK102559698SQ20101059588
公开日2012年7月11日 申请日期2010年12月14日 优先权日2010年12月14日
发明者刘沁松, 王石平, 袁猛 申请人:华中农业大学