专利名称：鸡传染性喉气管炎病毒gJ蛋白的单克隆抗体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及单克隆抗体，尤其涉及一种抗鸡传染性喉气管炎病毒gj蛋白的单克隆抗体以及分泌该抗gj蛋白蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，属于细胞工程领域。
背景技术：
传染性喉气管炎(Infectious Laryngotracheitis，ILT)是鸡的一种急性病毒性呼吸道传染病，在世界范围内爆发，严重流行时发病率达100%，致死率可高达70%。该病是由传染性喉气管炎病毒(InfectiousLaryngotracheitis Virus, I LTV)引起的，以呼吸困难、喘气、咳出血样黏液、喉部和气管黏膜水肿、出血并导致糜烂等为主要特征，可致感染鸡的死亡和产蛋下降，造成严重的经济损失，是危害养禽业的重要疫病之一(Saif， 2005)。自1925年May和Tittster在美国洛岛发现本病以来，现已遍及世界各国。我国在50年代发现本病，1988-1990年曾在许多省份流行，1992年以后在我国一些地区又呈地方性流行。目前国内外使用的ILTV弱毒疫苗毒力偏强，接种后反应大；能引起潜伏感染 (Bagust T J. Laryngotracheitis(Gallid-I)Herpesvirus infection in the chicken Latency establishment by wild and vaccinesstrains of ILT virus.Avian Pathol， 1986，15 581 595.)；弱毒疫苗株在鸡群中传播可能引起毒力返强(Guy JS，Barnes HJ， Smith LG. Increased vir μ Lence ofmodified-live infectious laryngotracheitis vaccine virus following bird-to-birdpassage. Avian Diseases，1991，35 :348 355·)，而成为潜在的传染源(Guy JS，Barnes HJ，Smith LG. ViruLence of infectious laryngotracheitis viruses Comparison of modified—live vaccine viruses and North Carolina field isolates. Avian Diseases，1990，34 :106 113.Guy JS， Barnes HJ, Munger LL, et al. Restriction endonuclease analysis of infectious laryngotracheitis viruses Comparison of modified—live vaccine viruses and North Carolina field isolates. Avian Diseases，1989，33 :316 323.Creelan JL, Calvert VM，Graham DA, et al. Rapid detection and characterization from field cases of infectiouslaryngotracheitis virus by real-time polymerase chain reaction and restrictionfragment length polymorphism. Avian pathology,2006， 35(02) :173 179.)；因此，该疫苗仅限于流行地区使用，清净鸡群一旦发生本病将引起 ILT爆发，导致重大损失，所以本病的防制已成为世界养禽业面临的难题。ILTV基因组是典型的a-疱疹病毒基因组，大小为150kb，由一个长独特区(ML)和一个短独特区(Us)组成，在短独特区两端排列着一个内部反向重复序列(IR)和末端重复序列(TR)，长独特区和短独特区的大小分别为IOSkb和12kb，内部反向重复序列和末端重复序列的大小都为15kb (Veits et al，2003)，两个反向重复序列及其中间的短独特区可以沿轴旋转180度，这样使病毒的基因组呈现两种异构体。到目前为止，已经鉴定了 ILTV 基因组中的21个基因，其中通过与带状疱疹病毒(VZV)比较鉴定了 20个基因，与HSV-I比较鉴定了 19个基因，与Y-疱疹病毒科的EBV比较，仅发现12个基因存在同源性。据推测，ILTV基因组至少可编码70个左右基因，但其中多数基因的功能尚不清楚，一些主要基因已经完成了全序列的测定工作。在ILTV众多的抗原基因中，研究者发现gj基因是一个非保守基因，由986个密码子组成，位于编码糖蛋白gG和gD的ORFs之间，位置上与HSV-I 和HSV-2编码gj蛋白的US5基因同源。预测的基因产物有囊膜糖蛋白的特征，在序列的N 和C末端含有9个推测的N糖基化位点和疏水区，分别作为信号序列和膜锚定元件。DNA序列分析显示gj基因与下游的gD和gl基因形成3'共末端的转录基因簇。Northern blot 分析，仅在感染后很久(16h p. i.)才强烈表达两个大小分为4. 3kb和5. 5kb的病毒特异的 RNAs，但仅5. 5kb的转录本能够编码完整的gj 0RF,更丰富的4. 3kb RNA通过试验证实是 mRNA剪辑的结果。在病毒感染的细胞中，检测到的gj基因翻译的产物大小为85、115、160和 200kD，而转录生成的两个gJmRNAs的推测蛋白大小分别为107和67kD。85kD蛋白是经剪辑形成的4. 3kb的mRNA翻译后，进一步加工而形成的；115kD的蛋白是5. 5kb的mRNA翻译后再加工形成的；160kD的蛋白经蔗糖梯度纯化证明是一种未成熟的加工中间体；200kDa 的蛋白是成熟的糖基化gj蛋白，含有天冬酰氨、丝氨酸和/或苏氨酸相连的糖链，成熟过程可能经过蛋白降解作用(Fuchs，wiesner，et al，2005)。由于完整的gj基因编码的蛋白分子量比较大，不适合于进行原核表达，因此利用生物软件HMMTOP (Tusmidy，1998 ；2001)和 TMpred (Hofmann, 1993)分析其跨膜结构，选择位于胞外的区域，再结合DNAStar分析蛋白的亲水性和抗原性，选择抗原性强的片段进行表达，Westernblot检测结果表明，所表达的蛋白片段都保留了较好的抗原性(何来，等)，可以作为免疫原制备针对gj蛋白的单克隆抗体。
ILTV不同毒株之间存在不同程度的差异，但仍只有一个血清型，因此，常规的血清学方法适合于检测所有的毒株。但由于弱毒疫苗的广泛使用，多种呼吸道病原的混合或交叉感染，以及ILT临床表现的温和化，在诊断上迫切需要解决的问题是不同毒力毒株(如疫苗株与野毒株)的鉴别，ILTV与其它呼吸道病原的鉴别以及持续感染状态ILTV的检测， 这就需要建立鉴别诊断的方法。其中核酸探针技术、聚合酶链式反应(PCR)技术及衍生的 PCR-RFLP技术应用广泛，但这些方法对试验条件及操作人员的要求较高，另外试验成本也非常昂贵，不被养殖户接受，多用于实验室研究，很难进入临床应用阶段。酶免疫测定技术将酶促反应的高效率和免疫反应的高度专一性有机结合起来，具有灵敏度高、特异性强、对仪器设备要求不高、成本低、操作简便快捷、无放射性污染、自动化程度高、试剂保存时间长等优点，适用于大批量现地检测工作，将可能成为极具推广价值的诊断方法。因此研制检测传染性喉气管炎病毒的ELISA诊断试剂盒对该病的疫情监测、流行病学调查及根除均具有重要意义。该检测方法的建立的前提是必须获得针对传染性喉气管炎病毒特定蛋白的单克隆抗体。
发明内容
本发明的主要目的是提供一株稳定分泌抗gj蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本发明的另一目的是一种由上述杂交瘤细胞株所分泌的鸡传染性喉气管炎病毒 gj蛋白的单克隆抗体。本发明的目的之三是将上述单克隆抗体应用于诊断或检测传染性喉气管炎病毒。本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的
本发明采用大肠杆菌表达鸡传染性喉气管炎病毒gj蛋白，纯化后作为免疫原，免疫BALB/c小鼠，取其脾淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经筛选获得1株稳定分泌抗gj 蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其微生物保藏号是CGMCC No. 4337 ；其分类命名为杂交瘤细胞株；保藏时间是2010年11月26日；保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。Western blot检测结果表明，本发明鸡传染性喉气管炎病毒gj蛋白的单克隆抗体(3B1E6F6株单克隆抗体)能与ILTV全病毒发生特异性反应。单克隆抗体的特异性试验表明，本发明鸡传染性喉气管炎病毒gj蛋白的单克隆抗体仅与ILTV全病毒抗原发生反应， 而与NDV、IBV, REV, IBDV和CAV抗体检测试剂盒不发生反应。本发明单克隆抗体可用于检测鸡传染性喉气管炎病毒，为建立一种快速、简易、准确的诊断方法以及区分传染性喉气管炎野毒感染与重组疫苗免疫奠定基础。
图13B1E6F6株单克隆抗体亚类鉴定结果。图2应用Western blot分析单克隆抗体3B1E6F6与ILTV全病毒的反应性；M 预染蛋白质分子量；1 :3B1E6F6 ；2 =ILTV阳性血清3 :SP2/0上清。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。试验材料毒种、细胞、实验动物和生化试剂(1)重组pET32a_gJ、SP2/0细胞均由本实验室保存；(2) 8周龄实验用雌性BALB/c小鼠购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心；(3)标准胎牛血清、培养基DMEM购于Gibco公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐齐IJ、选择性培养基HAT和HT、细胞融合用PEG(MW3350)、单克隆抗体亚型鉴定试剂盒、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG(HRP-IgG)购于Sigma公司；DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物公司。实施例1单克隆抗体的制备1、重组蛋白的纯化与检测将诱导后的蛋白rgj在5h后收获菌液，6，OOOrpm离心IOminJn IOmL的结合缓冲液。重悬菌液，将样品置于冰浴中超声波裂解(30%功率)裂解3s、间隔15s、超声至液体透明。然后11，OOOrpm离心20min，去除细胞碎片，将上清液移入新管中。分别取上清液和沉淀进行SDS-PAGE以确定表达的蛋白是否为可溶性蛋白。利用Bio-RAD公司的电洗脱纯化系统对重组蛋白进行纯化，具体纯化步骤如下
(1).带上手套，将膜杯在60°C洗脱缓冲中浸泡，至少Ih ；(2).将过滤板塞到玻璃管底部(磨沙面)，使其底部齐平，套上白色接头(硅胶)；(3).将玻璃管插入洗脱模块，可将洗脱模块的环孔处打湿，玻璃管较易插入，确保玻璃管上缘与环孔齐平；将不用的环孔用灰色小帽盖上；(4).将浸泡好的膜杯插入硅胶接头，在接头内装满洗脱液，用枪头反复吸取洗脱液以去除透析膜上的气泡；
(5).在玻璃管内装满洗脱液，将要洗脱的凝胶放入管内。为增加回收率，可放入多个凝胶条带，一般凝胶高度为1cm，如超过1cm，需增加洗脱时间；(6).将整个洗脱模块放入洗脱槽，加入约600mL下槽缓冲液，缓冲液液面必须没过接头上缘，否则透析膜上容易产生气泡。在上槽加入约IOOmL缓冲液；(7).在洗脱槽内放入一搅拌子，洗脱过程中剧烈搅拌可防止气泡产生；(8).盖上洗脱槽盖子，接电泳仪(Bio-RadpowerPacl000/3000/Basic/ Universal，红对红，黑对黑接入)；(9).洗脱，每管设电流为8-10mA，洗脱一般3_5h ；(10).洗脱完成后关闭电泳仪，打开盖子，取下灰色小帽，将上槽缓冲液漏掉，或小心取出一个玻璃管，漏掉上槽缓冲液；(11).小心而快速地用枪头吸去玻璃管内的缓冲液至过滤板，确保在整个过程中过滤板下溶液没有被搅动；(12).小心取下整个接头和膜杯，用一新枪头，将膜杯内的液体吸出，体积约为 400 μ L，加入200 μ L新鲜缓冲液，清洗膜杯后收集吸出。试验结果纯化后的rgj蛋白具有较高的纯度、蛋白得率比较高且具有良好的反应活性。2、小鼠免疫以纯化的rgj蛋白作为免疫原，对6周龄雌性BALB/c小鼠进行3次免疫。免疫方案如下首免，每只小鼠用50 μ g的rgj蛋白与等量FCA混合制成乳化剂，颈背部皮下多点和腹腔注射，二免于首免后2周进行，将FCA换成FICA，剂量和方法同上；三免于二免后2周进行，剂量和方法同二免。细胞融合前1周进行加强免疫，方法是腹腔注射100 μ g纯化的 rgj蛋白。3、细胞融合融合前2d准备饲养细胞，按照常规方法取BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞铺于96孔细胞培养板中待用。断颈处死待取脾的小鼠，无菌取其脾细胞，按脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞 5 1的比例用PEG1450进行融合，融合后的细胞铺于准备好的饲养细胞之上(Kohler G， Milstein C. Continuous c μ Ltures of fused cellsecreting antibody of predefined specificity. Nature,1975，256(5517) :495_497.)。4、阳性杂交瘤细胞株的筛选及亚克隆取纯化的ILTV全病毒以1 μ g/孔包被聚苯乙烯板，37°C，3h ；PBST (0. 01M，pH 7. 3， PBS+0. 05% Tween-20)洗涤 3 次，5min/ 次；加 PBST/FCS (0. 01M, pH 7. 3，PBST+10% FCS)， 200 μ L/孔，37°C封闭3h或4°C过夜；PBST洗3次，5min/次，拍干，-20°C或4°C存放备用。 通过方阵试验确定抗原的最佳稀释倍数，即将ILTV全病毒包被96孔板，进行方阵滴定试验，获得抗原的使用浓度及原核表达蛋白rgj免疫鼠阳性血清的稀释倍数。同时设置阴性小鼠血清做为阴性对照。根据反应结果选择抗原的最佳包被浓度。按常规间接ELISA法检测杂交瘤细胞培养上清。将酶标板置于ELISA酶标仪上读值，以S/P > 0. 2作为阳性判定标准。挑选出抗rgj蛋白的杂交瘤细胞克隆孔。按上述筛选方法，将筛选得到的阳性杂交瘤细胞进行亚克隆，亚克隆采用有限稀释法，将原始孔细胞用HT培养基稀释后重新分96孔细胞板，一个原始孔细胞分一块板子。 亚克隆完成后注意观察每个孔的细胞个数及状态。取亚克隆后分泌抗体稳定并且尽可能是单个克隆的孔进行第二次亚克隆。经过三次亚克隆最终筛选获得了 1株能够稳定分泌特异性针对gj蛋白的单克隆抗体(命名为3B1E6F6)的杂交瘤细胞株，其微生物保藏号是 CGMCC No. 4337。5、单克隆抗体的大量制备给10周龄左右的健康BALB/c小鼠腹腔注射液体石蜡，0. 5mL/只，Iw后腹腔注射 IO5个杂交瘤细胞，7-10d后当小鼠腹部极度膨胀时抽取腹水，隔2d抽一次，将抽取的腹水 IOOOOg离心lOmin，去除上层油脂和沉淀，上清分装于_20°C或_70°C保存。试验例1本发明单克隆抗体的鉴定1、抗体的效价测定纯化的ILTV全病毒用包被液稀释后，100 μ L/孔加入ELI SA反应板中，4°C放置过夜。次日倾去空内的液体，洗涤3次，每次3min。每孔加100 μ L封闭液，37°C放置lh， 洗涤3次，每次3min。将含有单克隆抗体的腹水在另一块板上用PBS进行10倍系列稀释， 100 μ L/孔加到已封闭的ELISA板上，每个样品平行做两个重复，PBS做阴性对照，REV阳性血清作为阳性对照。于37°C温箱中温育lh，洗涤3次，每次3min。然后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠(1 8000)的抗体，100 μ L/孔，于37°C温箱中温育lh，洗涤5次，每次 3min。加新鲜配制的底物溶液100 μ L/孔，室温暗处放置15min，再加入50 μ L/孔终止液， 测定OD45tl,以S/P > 0. 2为阳性判定标准，阳性反应的最大稀释度为阳性细胞株培养上清以及腹水进行抗体效价检测。检测结果见表1和表2，诱导小鼠产生的腹水效价为107，细胞上清的效价达到104。表13B1E6F6株单抗腹水效价的测定
稀释倍数
单克隆抗体 -
IO3IO4IO5IO6IO7IO8
3B1E6F6 1.536 1. 273 1. 009 0. 413 0. 321 0. 081表23B1E6F6株单抗上清效价的测定
稀释倍数
细胞上清 -
10°IO1IO2IO3IO4IO5
3B1E6F6 1.325 1.119 1. 001 0. 825 0. 641 0. 172
2、单克隆抗体亚类鉴定使用捕获ELISA试剂盒检测单克隆抗体的亚类(1)将捕获抗体按照1 5，000倍稀释，100 μ L/孔包被，4°C孵育12h ；(2)用 洗涤液PBST洗涤3次，5min/次；(3)用 BSA 封闭 Ih ；(4)用洗涤液PBST洗涤3次，5min/次；(5)每孔加入100 μ L待检测的单抗上清，同时以S/P20细胞上清作阴性对照，37°C 孵育Ih ；(6)用洗涤液PBST洗涤3次，5min/次；(7)用的BSA稀释特异性抗体(1 250)，100 μ L/孔包被，37°C震荡孵育Ih ；(8)用洗涤液PBST洗涤3次，5min/次；(9)每孔加入新鲜配置的底物溶液100 μ L，37°C避光孵育20min。(10)每孔加入50 μ L 2Μ H2S04终止反应。在酶标仪上读取OD405，以OD4tl5明显高于其他各个孔的表位特征性抗体判为其单抗亚类。亚型鉴定结果见图1，本发明单克隆抗体3B1E6F6的重链分别为IgG，轻链为κ 链。3、McAbs免疫活性鉴定Western blot用于分析本发明单克隆抗体的免疫活性，Western blot程序如下 将纯化的ILTV全病毒和预染蛋白Marker进行SDS-PAGE电泳(胶浓度为12% )，电泳产物转印至硝酸纤维素膜(NC)，剪下每个泳道的ILTV全病毒蛋白条带及预染蛋白Marker条带(保存备用)，然后将含有ILTV全病毒蛋白的NC膜条带放入去离子水中清洗lOmin，5 % 脱脂乳室温封闭lh，封闭后的NC膜条带分别与1 100倍稀释的3B1E6F6株杂交瘤细胞株诱生小鼠产生的腹水以及正常SP2/0细胞的培养上清液37°C作用lh，PBST(0. 01mol/L, pH7. 2 ；含 0. 05% 的 Tween-20)洗涤 3 次，然后与 HRP-羊抗鼠 IgG (1 8000) 37°C作用 Ih, PBST洗5次，用3，3' - 二氨基联苯胺(DAB)底物溶液进行显色。Western blot检测结果表明，本发明3B1E6F6株单克隆抗体能与ILTV全病毒发生特异性反应(图2)。4、单克隆抗体的特异性试验分别采用IDEXX公司生产的新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、禽白血病病毒(ALV)及禽网状内皮组织增生症病毒(REV)ELISA 抗体检测试剂盒及传染性喉气管炎病毒(ILTV)抗体ELISA检测方法对本发明所构建的杂交瘤细胞上清进行检测，检验其特异性。结果表明，本发明获得的3B1E6F6单克隆抗体仅与 ILTV全病毒抗原发生反应，而与NDV、IBV、REV、IBDV和CAV抗体检测试剂盒不发生反应，结果见表3。表33B1E6F6株单克隆抗体的特异性鉴定
权利要求
1.一株分泌抗鸡传染性喉气管炎病毒infectious LaryngotracheitisVirus) gj蛋白蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其微生物保藏号是=CGMCC No. 4337。
2.由权利要求1所述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。
3.权利要求2所述的单克隆抗体在制备诊断或检测传染性喉气管炎病毒试剂中的用途。
全文摘要
本发明公开了鸡传染性喉气管炎病毒gJ蛋白的单克隆抗体及其应用。本发明筛选得到一株稳定分泌抗gJ蛋白蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株(3B1E6F6)，其微生物保藏号是CGMCC No.4337。本发明杂交瘤细胞株所分泌的该单克隆抗体能与ILTV WG强毒株发生反应，而与禽类其他相关病原不发生反应。本发明单克隆抗体可用于检测鸡传染性喉气管炎病毒，为建立一种快速、简易、准确的诊断方法以及区分传染性喉气管炎野毒感染与重组疫苗免疫奠定基础。
文档编号C07K16/18GK102154215SQ201010595809
公开日2011年8月17日 申请日期2010年12月20日 优先权日2010年12月20日
发明者王云峰, 王玫, 石星明, 赵妍 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所