全悬浮培养型Marc-145细胞系的驯化方法
【专利摘要】本发明提供全悬浮培养型Marc?145细胞系的驯化方法，步骤如下：（1）贴壁培养型Marc?145细胞的培养；（2）低血清贴壁培养型Marc?145细胞系的驯化；（3）低血清全悬浮培养型Marc?145细胞的驯化；（4）无血清全悬浮培养型Marc?145细胞的驯化。应用本发明的细胞驯化方法能够得到悬浮培养的Marc?145细胞，该细胞适应低血清和无血清全悬浮培养，在7.5L的反应器按无血清培养密度可达8×106/ml，至少可得到4.4×1010的细胞，相当于80?90个15L滚瓶或18?20个40层细胞工厂收获的细胞数量，发明效果明显。
【专利说明】
全悬浮培养型Marc-145细胞系的驯化方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及全悬浮培养型Marc-145细胞系的驯化方法。
【背景技术】
[0002] Marc-145细胞是1993年Kim HS等从恒河猴胚肾细胞MA-104中克隆得到的上皮细 胞，该细胞可连续传代呈贴壁型生长，是目前研究和生产猪繁殖与呼吸综合征病毒 (Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRSV，俗称"蓝耳病"）及疫苗最理 想的细胞株，还可用于鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV)和猪 细小病毒(Porcine parvovirus virus，PPV)等病毒的体外增殖。因 Marc-145为贴壁型生 长，在病毒培养和疫苗生产时该细胞均采用贴壁单层培养，细胞的量受制于容器(如:细胞 工厂、滚瓶)或介质（如:微载体)的表面积，大规模生产时需要足够大的厂房或价格昂贵的 微载体以及大量的人工操作，而且生物反应器微载体培养目前在放大培养时仍存在许多技 术难题没有解决，推广应用仍有难度。现阶段工业化单层培养Marc-145细胞时，培养基中均 加一定比例的牛血清（包括胎牛血清或新生牛血清）细胞才能正常生长，牛血清不仅价格 贵，而且牛血清来源于自然生物体，牛源本身携带和采集加工过程有污染外源微生物和致 病因子的可能，使用会存在生物安全风险。另外，牛血清是一种天然混合物，其具体成份目 前还没有完全分析清楚，生物制品生产中使用后对下游纯化工艺造成困难，如果有残留通 常会引起接种者的副反应而影响产品质量。生物制品生产中细胞培养如能采用无血清全悬 浮工艺，培养规模就容易线性放大，避免了细胞贴壁培养和使用牛血清带来的工艺缺陷，可 提高病毒产量和产品质量，但是驯化无血清全悬浮培养型细胞株是目前最关键的技术瓶颈 之一。本发明提供一种低血清和无血清高密度全悬浮培养型Marc-145细胞及其制备方法和 应用方法，为用全悬浮培养Marc-145细胞生产PRRSV疫苗提供细胞基质及制备方法和培养 方法。
【发明内容】
[0003] 本发明提供了全悬浮培养型Marc-145细胞系的驯化方法，并提供了驯化后的全悬 浮培养型Marc-145细胞的扩大培养方法。
[0004] 本发明提供全悬浮培养型Marc-145细胞系的驯化方法，步骤如下：
[0005] (1)贴壁培养型Marc-145细胞的培养
[0006]选用经无菌、支原体、外源病毒检定为阴性，对PRRSV敏感的贴壁培养型Marc-145 细胞，待细胞生长致密单层后用含10 %新生牛血清的DMEM培养液按1:4比例分瓶传代，置37 °C 5 %⑶2的培养箱培养，在48-72h内细胞形成致密单层，为边缘清晰的扁平上皮型细胞且 细胞生长正常的情况下可用于驯化；
[0007] (2)低血清贴壁培养型Marc-145细胞系的驯化
[0008] a)将步骤（1)所述生长正常的贴壁培养型Marc-145细胞分别用含新生牛血清8%、 5 %的DMEM培养液各培养三代。每次传代的标准是按1:4比例分瓶，在37 °C 5 % C02培养，在 48-72h内细胞形成致密单层；
[0009] b)将培养液换成DMEM/F12后加5%新生牛血清继续培养三代，传代标准同步骤a);
[0010] c)培养液中新生牛血清降为3 %，按b步骤中的方法，传代比例降为1: 3再培养三 代；
[0011] d)培养液中新生牛血清降为1 %，在培养液中再加体积百分含量20%上一代次培 养了该细胞48-72h的培养液继续培养五代，传代标准同步骤c);细胞在48h-72h内形成致密 单层，驯化得到了低血清贴壁培养型Marc-145细胞系；
[0012] ⑶低血清全悬浮培养型Marc-145细胞的驯化
[0013] a)将步骤⑵驯化的低血清贴壁培养型Marc-145细胞，用DMEM/F12和无血清培养 基1号按体积比1:1比例混合后，加3-5%新生牛血清制成培养液，用培养液将细胞密度调整 至 3-5X105/ml，100_130r/min、37°C5%C〇2 摇床培养；
[0014] b)每培养48h取样计数，细胞密度未达到lX106/ml时，800-1000r/min离心后换用 新鲜培养液重新悬浮培养;细胞密度达到1 X l〇6/ml时，800-1000r/min离心按1:2比例分瓶 培养;至细胞密度达到2X106/ml时，800-1000r/min离心按1:3比例分瓶培养;在连续三代 按1: 3比例培养48h细胞密度均达2 X 106/ml时，驯化得到低血清全悬浮培养型Marc-145细 胞系；
[0015] ⑷无血清全悬浮培养型Marc-145细胞的驯化
[0016] a)在无血清培养基2号（兰州百灵生物技术有限公司，货号：BFLM101.05)中加3% 新生牛血清，将步骤(3)中得到的低血清全悬浮培养型Marc-145细胞直接稀释到密度5-7 X 105/ml，置 100-130r/min、37°C5%C02 摇床培养；
[0017] b)每培养24h取样计数，细胞密度达到3X106/ml时，将细胞悬液直接稀释至5X l〇5/ml接种培养，每培养一代新生牛血清浓度下降1%，到第4代时血清降为0,完全用无血 清培养培养，在连续三代培养48h细胞密度均达3 X 106/ml时，驯化得到无血清全悬浮培养 型Marc-145细胞系。
[0018]本发明还提供应用权利要求1所述的方法得到的全悬浮培养型Marc-145细胞。 [0019]本发明还提供全悬浮培养型Marc-145细胞在无血清培养基中的培养方法，步骤如 下：
[0020] a)种子细胞培养，复苏一支全悬浮培养型Marc-145细胞，用40-60ml无血清培养基 2号加 5-10%新生牛血清，置110r/min、37°C5%C02培养；
[0021 ]当细胞生长至3 X 106/ml以上时，用无血清培养基2号加 1-3%新生牛血清的培养 液将细胞稀释至密度为5-7 X 105/ml，计250-350ml，100r/min、37 °C 5 % C02培养；
[0022] 扩大培养至细胞密度达3 X 106/ml以上时，再用无血清培养基2号直接将细胞稀释 至密度为5-7X105/ml继续扩大培养，总体积为400-600ml;培养条件为：100-130r/min、37 °C5%C〇2；
[0023] 细胞密度达3 X 106/ml以上时，转入生物反应器培养；
[0024] b)生物反应器批培养:用无血清培养基2号接种密度为5-7 X105/ml的全悬浮培养 型Marc-145细胞至生物反应器培养体积，培养条件为:转速70-120r/min、温度37°C、溶氧 40-70%、pH7.15-7.25。
[0025] 本发明还提供全悬浮培养型Marc-145细胞在无血清培养基中的培养方法，步骤如 下：
[0026] 用无血清培养基2号接种全悬浮培养型Marc-145细胞至生物反应器培养，起始细 胞密度为5-7 X 105/ml，起始培养体积比生物反应器培养允许最小体积多10-20%，培养条 件为:转速50_70r/min、温度37°C、溶氧25-40%、pH7 · 15-7 · 25;
[0027] 细胞密度达2X106/ml以上时补加与起始培养体积相等的无血清培养基2号，培养 条件改为:转速70_90r/min、温度37 °C、溶氧35-45 %、pH7.15-7.25;
[0028] 细胞密度达4X106/ml以上时补加无血清培养基2号至最高培养体积，培养条件改 为：转速90-120r/min、温度 37°C、溶氧 50-70%、ρΗ7·10-7·20。
[0029] 本发明还提供全悬浮培养型Marc-145细胞在低血清培养基中的培养方法，步骤如 下：
[0030] 用无血清培养基2号加1-3 %新生牛血清接种全悬浮培养型Marc-145细胞至生物 反应器培养，起始细胞密度为5-7 X 105/ml，起始培养体积比生物反应器培养允许最小体积 多 10-20 %，培养条件为:转速50-70r/min、温度37 °C、溶氧25-40 %、pH7.15-7.25;
[0031] 细胞密度达2 X 106/ml以上时补加与起始培养体积相等的无血清培养基2号，培养 条件改为:转速70_90r/min、温度37 °C、溶氧35-45 %、pH7.15-7.25;
[0032] 细胞密度达6X106/ml以上时补加无血清培养基2号至最高培养体积，培养条件改 为：转速90-120r/min、温度 37°C、溶氧 50-70%、ρΗ7·10-7·20。
[0033] 本发明的有益效果为:本发明提供的细胞驯化方法及得到的可悬浮培养的Marc-145 细胞 ，该细胞适应低血清和无血清全悬浮培养 ，在 7. 5L 的反应器 （实际最高培养体积 5.5L)按无血清培养密度可达8 X 106/ml，至少可得到4.4 X 101Q的细胞，相当于80-90个15L 滚瓶或18-20个40层细胞工厂收获的细胞数量，按此计算，一台培养体积500L生物反应器相 当于目前300台30瓶位滚瓶机产能。将悬浮培养的细胞运用到实际生产中在场地和人力投 入上也会大幅度节省，符合目前节能、环保及低碳理念，在带来可观地经济效益的同时，也 会产生较好地社会效益。
【附图说明】
[0034]附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实 施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
[0035]图1为驯化前贴壁培养型Marc-145细胞；
[0036]图2为驯化的悬浮培养型Marc-145细胞；
[0037]图3为驯化的悬浮培养型Marc-145细胞荧光抗体法检查外源病毒结果图；
[0038]图4为驯化的悬浮培养型Marc-145细胞在生物反应器中无血清培养的生长曲线 图；
[0039]图5为驯化的悬浮培养型Marc-145细胞在生物反应器中低血清培养的生长曲线 图。
【具体实施方式】
[0040]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市 售。
[0041 ] 实施例1
[0042] 1.材料：
[0043] 1)细胞株:Marc-145恒河猴胚肾细胞，由甘肃省动物细胞工程技术研究中心提供；
[0044] 2)DMEM 培养液，Gibco,货号：02-5062EJ;
[0045] 3)DMEM/F12 培养液，Gibco,货号：12500-096;
[0046] 4)无血清培养基1号，兰州百灵生物技术有限公司，货号:BFLM401.05;
[0047] 5)无血清培养基2号，兰州百灵生物技术有限公司，货号:BFLM101.05;
[0048] 6)低血清培养基，兰州百灵生物技术有限公司，货号:BLLM101.05;
[0049] 7)新生牛血清，兰州民海生物工程有限公司，批号:20150716;
[0050] 8)DMS0(二甲基亚讽），Thermo Fisher Scientific Corporation，货号：20688 8)；
[00511 9)胰蛋白酶，Gibco，货号：27250，配制成0 · 25%胰蛋白酶溶液(EDTA-Na 0 · 3g/L)。
[0052] 2.所用仪器设备和器皿
[0053] 1)生物反应器，B.Braun，型号:BI0STATE0R B plus,最大培养体积5L;
[0054] 2)摇床，KUHNER，型号：ISF1-XC;
[0055] 3)C〇2培养箱，Thermo Fisher Scientific Corporation，型号：3111;
[0056] 4)离心机，湖南凯达，型号：TD5Z，TDL80-2B;
[0057] 5)相差倒置显微镜，OLYMPUS，OLYMPUS CKX41;
[0058] 6)荧光倒置显微镜，OLYMPUS AX71，OLYMPUS;
[0059] 7)细胞培养瓶(Corning，T25货号：430639,T75货号：430641);
[0060] 8)锥形细胞瓶150ml，江苏海门，规格:150ml;
[00611 9)悬浮培养瓶500ml，兰州百灵塑料制品有限公司，规格:500ml;
[0062] 10)移液器，BRAND GMBH+C0 KG，型号：accu-jetORpro。
[0063] 2.方法：
[0064] 1)贴壁培养型Marc-145细胞的培养
[0065]从甘肃省动物细胞工程技术研究中心细胞库中选取经检定无菌、支原体、外源病 毒均为阴性，且对PRRSV敏感的贴壁培养型Marc-145细胞一支复苏培养，复苏的细胞编号 为:GsACC2B0000086，培养液为10 %新生牛血清（以下血清浓度均为体积百分含量)的DMEM， 培养条件:37°C5%C02的培养箱培养。细胞复苏后活力为94.6%，细胞培养48h形成了致密 单层，按1:4比例分瓶传代培养在48h也成致密单层，细胞边缘清晰，形态扁平，呈上皮型，见 图1。细胞生长正常可用于驯化。
[0066] 2)低血清贴壁培养型Marc-145细胞系的驯化
[0067] a)将1)所述生长正常的贴壁培养型Marc-145细胞用8%新生牛血清的DMEM培养液 培养三代，传代按1:4比例分瓶，培养条件:37 °C 5 % C02培养，每代在48-72h形成致密单层； [0068] b)培养液中新生牛血清降为5%后按a步骤中的方法培养三代；
[0069] c)培养液换成DMEM/F12加5%新生牛血清后按b步骤中的方法继续培养三代；
[0070] d)培养液中新生牛血清降为3%，按c步骤中的方法，传代比例降为1:3再培养三 代；
[0071] e)培养液中新生牛血清降为1 %，在培养液中再加体积百分含量20%上一代次培 养了该细胞48_72h的培养液(已证明细胞在低血清培养时会分泌一些有利于细胞生长的因 子)继续培养五代，培养方法同d;
[0072] f)细胞在48_72h形成了致密单层，说明已驯化了适应低血清贴壁培养型Marc-145 细胞系，可在液氮冻存一部分该阶段的细胞，以防在后期驯化过程出现意外时，直接复苏使 用以节约时间。按细胞冻存的常规方法，用冻存液配方：80 % DMEM/F12+10 %新生牛血清+ 10%DMS0,细胞密度为3X10%1，细胞活力为99%，每支冻存管的装量为1.5ml。
[0073] 3)低血清全悬浮培养型Marc-145细胞系的驯化和建立
[0074] a)将上述2)驯化的低血清贴壁培养型Marc-145细胞，用DMEM/F12和无血清培养基 1号（购自兰州百灵生物技术有限公司，货号：BFLM401.05)按体积比1:1比例混合后，加3-5%新生牛血清制成培养液，用培养液将细胞密度调整至4.6 X105/ml，用锥形细胞瓶在 11 Or/min、37 °C 5 % C02 摇床培养；
[0075] b)每培养48h取样计数，细胞密度未达到1 X 106/ml用800-1000r/min离心后换用 新鲜培养液重新悬浮培养(也称之为传代）；直至细胞密度达到1 X l〇6/ml时，按上述方法离 心按1: 2比例分瓶培养；至细胞密度达到2 X 106/ml时，按上述方法离心按1: 3比例分瓶培 养。当连续三代按1:3比例培养48h细胞密度均达2 X106/ml时，说明已驯化了低血清全悬浮 培养型Marc-145细胞系，可液氮冻存一部分该阶段的细胞。低血清全悬浮驯化需要10-20 代。
[0076] 培养结果和传代操作情况见下表。并对第16代细胞进行了冻存，用冻存液配方： 80%无血清培养基1号+10%新生牛血清+10%DMS0,细胞密度为1.6X10 7/ml，细胞活力为 98.1%，每支冻存管的装量为1.5ml。
[0077] 表1 Marc-145细胞低血清全悬浮培养驯化过程计数结果和传代操作情况表
[0078]
[0079]
[0080] 4)无血清全悬浮培养型Marc-145细胞系的驯化和建立
[0081] 用含3%新生牛血清的无血清培养基2号直接稀释(不离心）上述步骤3)中第16代 低血清全悬浮培养的Marc-145细胞，用锥形细胞瓶以5X10 5/ml密度接种，置110r/min、37 °C5%C〇2摇床培养。
[0082] 每24h取样计数，细胞密度达到3X 106/ml时，将细胞悬液直接稀释至5X 105/ml接 种培养，每培养一代新生牛血清浓度下降1%，到第4代时血清降为0,完全用无血清培养培 养，培养连续三代当48h细胞密度均达到3 X 106/ml时，说明已驯化了无血清全悬浮培养型 Marc-145细胞系，冻存建立主细胞库和工作细胞库。培养结果和培养液情况见下表2,细胞 形态见图2。
[0083]并对第7代细胞进行了冻存建立了主细胞库，用冻存液配方:80 %无血清培养基1 号+10 %新生牛血清+10 %DMS0，细胞密度为1.49 X 107/ml，细胞活力为98.9 %，每支冻存管 的装量为1.5ml。从主细胞库复苏后培养两代建立了工作细胞库，工作细胞库冻存液配方同 主细胞库，细胞密度为1.63 X 107/ml，细胞活力为99.3%，每支冻存管的装量为1.5ml。
[0084] 表2 Marc-145细胞无血清全悬浮培养驯化过程计数结果和传代操作情况表
[0085]
[0087] 5)全悬浮培养型Marc-145细胞的检定
[0088]根据《中华人民共和国兽药典》三部2010年版"生产用细胞标准"进行检定。
[0089] a)无菌检验：全悬浮培养型Marc-145细胞培养的上清液接种到硫乙醇酸盐培养 基、酪胨琼脂培养基(斜面)和葡萄糖蛋白胨培养基中培养均为阴性；
[0090] b)支原体检验:全悬浮培养型Marc-145细胞冻融一次上清液接种到支原体液体培 养基和支原体固体培养基中培养均为阴性；
[0091] c)外源病毒检验:全悬浮培养型Marc-145细胞冻融一次的上清液接种到Vero细胞 和ST细胞培养，细胞未出现病变;荧光抗体法检查牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和猪细小病毒 (PPV)为阴性，如图3;红细胞吸附试验也为阴性。
[0092] d)染色体检查，统计了50个处于中期分裂相的染色体的数量，2n = 60占84%。
[0093] 6)无血清全悬浮培养型Marc-145细胞的生物反应器高密度培养
[0094] a)种子细胞培养从工作细胞库中复苏一支全悬浮培养型Marc-145细胞，用50ml无 血清培养基2号加5 %新生牛血清，置110r/min、37 °C 5 % C〇2培养。
[0095] 培养48h细胞密度达3.75 X 106/ml，用无血清培养基2号加1 %新生牛血清的培养 液稀释成300ml用悬浮培养瓶扩大培养，稀释后细胞密度为6.25 X 105/ml，培养条件：100r/ min、37°C5%C〇2 培养。
[0096] 培养48h细胞密度达4.36 X 106/ml，取细胞悬液140ml，加无血清培养基2号至 1000ml分两个悬浮培养扩大培养，每瓶500ml，培养条件：11 Or/min、37 °C 5 %⑶2培养，细胞 密度为6.1X105/ml。
[0097] 培养48h细胞密度达3.91 X106/ml，一部分转入生物反应器培养，剩余部分以5-7 X 105/ml密度连续传代培养。
[0098] b)生物反应器批培养按照生物反应器操作规程准备生物反应器，用无血清培养基 2号将上述全悬浮培养型Marc-145细胞按以密度6 X 105/ml接种至生物反应器，培养液体积 为5L。反应器参数:转速100r/min、温度37°C、溶氧45%、pH7.22。每12小时计数细胞密度。细 胞计数结果见表3,生长曲线见图4。
[0099] c)生物反应器流加培养按照生物反应器操作规程准备生物反应器，用无血清培养 基2号将上述全悬浮培养型Marc-145细胞按密度以7 X105/ml接种至生物反应器培养，起始 培养体积2L，反应器参数:转速60r/min、温度37 °C、溶氧25 %、pH7.25。每12计数细胞密度 和活力，36h细胞密度达26.3 X 105/ml，补加无血清培养基至4L，反应器参数改为:转速90r/ min、温度37°C、溶氧40%、pH7.2。培养至72h细胞密度达54.3X 105/ml，补加无血清培养基 至5.5L，培养条件改为:转速120r/min、温度37°C、溶氧60 %、pH7.10，培养至96h密度达94.2 X105/ml。细胞计数结果见表3,生长曲线见图4。
[0100] 综上两培养方式，在批培养时接种密度6X105/ml，5L共接种3X109的细胞，培养 96h细胞密度8.54 X 106/ml总量达4.27 X 101()，约生长14倍，细胞活力为93.1 %。而流加培养 接种密度7 X 105/ml，起始培养体积2L共接种1.4 X 109的细胞，培养96h细胞密度9.43 X 106/ ml，总量达5.19 X 101()，约生长37倍，细胞活力为98.1 %。由此可见，流加培养更适合全悬浮 培养型Marc-145细胞的生物反应器培养。
[0101 ] 表3全悬浮培养型Marc-145细胞生物反应器无血清培养计数结果表
[0102]
[0103] 注:表中7"前的数据为补培养液前的值，7"后的数据为补培养液后的值。
[0104] 7)全悬浮培养型Marc-145细胞在生物反应器低血清高密度培养
[0105] 培养方式为流加培养，按照6c的方法用低血清培养基加 3%新生牛血清在生物反 应器培养。以6.4 X 105/ml密度接种培养，36h细胞密度达24.2 X 105/ml补加无血清培养基至 4L，培养至72h细胞密度达60.4 X 105/ml补加无血清培养基至5.5L，到96h细胞密度达105.6 X105/ml。细胞计数结果见表4,生长曲线见图5。
[0106] 表4全悬浮培养型Marc-145细胞生物反应器低血清培养计数结果表
[0107]
[0108] 注:表中7"前的数据为补培养液前的值，7"后的数据为补培养液后的值。
[0109] 最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明， 尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可 以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。 凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的 保护范围之内。
【主权项】
1. 全悬浮培养型Marc-145细胞系的驯化方法，其特征在于:步骤如下： (1) 贴壁培养型Marc-145细胞的培养 选用经无菌、支原体、外源病毒检定为阴性，对PRRSV敏感的贴壁培养型Marc-145细胞， 待细胞生长致密单层后用含10%新生牛血清的DMEM培养液按1:4比例分瓶传代，置37°C 5% CO2的培养箱培养，在48-72h内细胞形成致密单层，为边缘清晰的扁平上皮型细胞且细胞生 长正常的情况下可用于驯化； (2) 低血清贴壁培养型Marc-145细胞系的驯化 a) 将步骤（1)所述生长正常的贴壁培养型Marc-145细胞分别用含新生牛血清8%、5%的 DMEM培养液各培养三代;每次传代的标准是按1:4比例分瓶，在37 °C 5%C02培养，在48-72h内 细胞形成致密单层； b) 将培养液换成DMEM/F12后加5%新生牛血清继续培养三代，传代标准同步骤a); c) 培养液中新生牛血清降为3%，按b步骤中的方法，传代比例降为1:3再培养三代； d) 培养液中新生牛血清降为1%，在培养液中再加体积百分含量20%上一代次培养了该 细胞48-72h的培养液继续培养五代，传代标准同步骤c);细胞在48h-72h内形成致密单层， 驯化得到了低血清贴壁培养型Marc-145细胞系； (3) 低血清全悬浮培养型Marc-145细胞的驯化 a) 将步骤(2)驯化的低血清贴壁培养型Marc-145细胞，用DMEM/F12和无血清培养基1号 按体积比1:1比例混合后，加3-5%新生牛血清制成培养液，用培养液将细胞密度调整至3-5 X105/ml，100-130r/min、37°C 5% CO2摇床培养； b) 每培养48h取样计数，细胞密度未达到1\106/1111时，800-100(^/1^11离心后换用新鲜 培养液重新悬浮培养;细胞密度达到1父10 6/1111时，800-100(^/1^11离心按1:2比例分瓶培 养;至细胞密度达到2 X 106/ml时，800-1000r/min离心按1:3比例分瓶培养;在连续三代按 1:3比例培养48h细胞密度均达2 X IOfVml时，驯化得到低血清全悬浮培养型Marc-145细胞 系； (4) 无血清全悬浮培养型Marc-145细胞的驯化 a) 在无血清培养基2号中加3%新生牛血清，将步骤(3)中得到的低血清全悬浮培养型 Marc-145细胞直接稀释到密度5-7 XioVml，置100-130r/min、37°C5%C02摇床培养； b) 每培养24h取样计数，细胞密度达到3 X 106/ml时，将细胞悬液直接稀释至5 X 105/ml 接种培养，每培养一代新生牛血清浓度下降1%，到第4代时血清降为0,完全用无血清培养培 养，在连续三代培养48h细胞密度均达3 X IOfVml时，驯化得到无血清全悬浮培养型Marc-145细胞系。2. 应用权利要求1所述的方法得到的全悬浮培养型Marc-145细胞。3. 权利要求2所述的全悬浮培养型Marc-145细胞在无血清培养基中的培养方法，其特 征在于:步骤如下： a)种子细胞培养，复苏一支全悬浮培养型Marc-145细胞，用40-60ml无血清培养基2号 加5-10%新生牛血清，置110r/min、37°C 5% CO2培养； 当细胞生长至3 X IO6Ail以上时，用无血清培养基2号加1-3%新生牛血清的培养液将细 胞稀释至密度为5-7\105/1111，计250-3501111，10(^/111丨11、371€5%〇)2培养 ； 扩大培养至细胞密度达3 X IO6Ail以上时，再用无血清培养基2号直接将细胞稀释至密 度为5-7\105/1111继续扩大培养，总体积为400-6001111;培养条件为 ：100-13(^/1^11、371€5% CO2 ； 细胞密度达3 X 106/ml以上时，转入生物反应器培养； b)生物反应器批培养：用无血清培养基2号接种密度为5-7 X 105/ml的全悬浮培养型 Marc-145细胞至生物反应器培养体积，培养条件为:转速70-120r/min、温度37 °C、溶氧40_ 70%、ρΗ7·15-7·25。4. 权利要求2所述的全悬浮培养型Marc-145细胞在无血清培养基中的培养方法，其特 征在于:步骤如下： 用无血清培养基2号接种全悬浮培养型Marc-145细胞至生物反应器培养，起始细胞密 度为5-7 X 105/ml，起始培养体积比生物反应器培养允许最小体积多10-20%，培养条件为： 转速50-70r/min、温度37°C、溶氧25-40%、pH7 · 15-7 · 25; 细胞密度达2X 106/ml以上时补加与起始培养体积相等的无血清培养基2号，培养条件 改为：转速70_90r/min、温度37°C、溶氧35-45%、pH7.15-7.25; 细胞密度达4 X IO6Ail以上时补加无血清培养基2号至最高培养体积，培养条件改为:转 速90-120r/min、温度 37°C、溶氧 50-70%、ρΗ7·10-7·20。5. 权利要求2所述的全悬浮培养型Marc-145细胞在低血清培养基中的培养方法，其特 征在于:步骤如下： 用无血清培养基2号加1-3%新生牛血清接种全悬浮培养型Marc-145细胞至生物反应器 培养，起始细胞密度为5-7 X 105/ml，起始培养体积比生物反应器培养允许最小体积多10-20%，培养条件为:转速50-7(^/11^11、温度37°(：、溶氧25-40%、？!17.15-7.25 ; 细胞密度达2X IO6Ail以上时补加与起始培养体积相等的无血清培养基2号，培养条件 改为：转速70_90r/min、温度37°C、溶氧35-45%、pH7.15-7.25; 细胞密度达6 X IO6Ail以上时补加无血清培养基2号至最高培养体积，培养条件改为:转 速90-120r/min、温度 37°C、溶氧 50-70%、ρΗ7·10-7·20。
【文档编号】C12N5/073GK105950544SQ201610325906
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月17日
【发明人】乔自林, 马忠仁, 徐水林, 王家敏, 令世鑫, 冯玉萍
【申请人】西北民族大学