一种建立富含蜕皮激素的多花筋骨草悬浮细胞系的方法
【专利摘要】本发明公开了一种建立富含蜕皮激素的多花筋骨草悬浮细胞系的方法，包括如下步骤：1、将多花筋骨草外植体置于诱导培养基上进行诱导培养，获得愈伤组织一；2、将所述愈伤组织一置于继代培养基上进行继代培养5次以上，获得愈伤组织二；3、将所述愈伤组织二置于悬浮培养基中进行悬浮震荡培养；4、收获细胞，提取蜕皮激素。利用本发明所提供的方法首次建立了多花筋骨草悬浮细胞系，从而快速高效获得具有亲本全套基因的单倍体植株。这不仅有利于从细胞学角度深入解析多花筋骨草合成蜕皮激素机理，也为多花筋骨草的基因转化和遗传修饰奠定了技术基础。
【专利说明】一种建立富含蜕皮激素的多花筋骨草悬浮细胞系的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，涉及一种建立富含蜕皮激素的多花筋骨草悬浮细胞系 的方法。
【背景技术】
[0002] 随着人们环保意识的提高，农药的发展已趋向低毒化、安全化和环保化，易分解且 分解物不损害环境的环境友好型植物源杀虫剂成了各国植物保护者的研宄热点，因此蜕皮 甾酮的需求量将愈来愈大，使其野生资源不能满足市场需求。而植物细胞悬浮培养生产次 生代谢产物具有提高产率、缩短周期、调控其生产过程、提高产品质量等显著特点。
[0003] 国际上对于植物悬浮细胞培养生产相关次生代谢产物（调味剂、香精等）已有很 多。目前，关于悬浮细胞的培养技术已有很多篇文献报道。黎祥云等公开了一种巫山淫羊蕾 悬浮细胞培养体系及其建立方法和应用（2011);李惠华等发明了一种龙脑樟细胞悬浮培 养液及悬浮培养方法（2013);李银心等公开了一种建立盐角草悬浮细胞系的方法（2013)。 已有苜蓿花药悬浮培养，在其培养方法中苜蓿属于豆科多年尘草本植物，而多花筋骨草为 唇形科筋骨草属植物，两者在遗传性状上有一定差距，并且以幼嫩叶片为诱导材料对外界 培养条件相对更敏感，苜蓿愈伤组织的培养方法显然不能用于唇形科植物悬浮培养，培养 体系需要重新建立。但迄今为止，还没有多花筋骨草建立悬浮细胞系的的相关报道。β-蜕 皮甾酮是多花筋骨草中最重要的次生代谢产物，蜕皮留酮是一种控制昆虫尘长发育的 天然化合物，市场十分紧缺。专家期望利用蜕皮留酮对昆虫生长发育或生理机能产生影响， 抑制它们的活力和发育速度，来达到长期有效的生物防治的目的。
【发明内容】
[0004] 本发明提供一种建立富含蜕皮激素的多花筋骨草悬浮细胞系的方法，以期为多花 筋骨草野生资源保护及建立高效的蜕皮留酮离体生产体系提供技术基础。
[0005] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一种建立富含蜕皮激素的多花筋骨草悬浮 细胞系的方法，包括如下步骤：
[0006] 步骤（一）、将多花筋骨草外植体置于诱导培养基上进行诱导培养，得到愈伤组织 ，
[0007] 步骤（二）、将所述愈伤组织一置于继代培养基上进行继代培养五次以上，选取生 长均一、质地疏松的，从而得到愈伤组织二；
[0008] 步骤（三）、将所述愈伤组织二置于悬浮培养基中进行悬浮震荡培养；
[0009] 步骤（四）、收获细胞，提取蜕皮激素；
[0010] 所述悬浮培养基配方如下：MS基本培养基中添加最终浓度为0. 6mg/L 2,4-D和 20g/L鹿糖，调节pH = 5. 8 ;于121°C高压灭菌20分钟；
[0011] 所述诱导培养基和继代培养基配方如下：MS基本培养基中添加最终浓度为 0.4mg/L 2,4-D、0.2mg/L KT、0.2mg/L 6-B 和 5-6g/L 琼脂；调节 口!1 = 6.2;于121°〇高压灭 菌20分钟；
[0012] 外界调控条件为：温度=25±1°C ;光暗周期16小时/8小时；光照强度20001x ; 采用透气膜封口。
[0013] 本发明还具有如下技术特征：
[0014] 1、如上所述的步骤（三）中，进行悬浮震荡培养，从而获得多花筋骨草悬浮细胞系 的方法，具体包括如下步骤：
[0015] (I)将所述愈伤组织二置于所述悬浮培养基中，以120-140转/分钟的转速震荡培 养8-12天，得到细胞悬浮液；
[0016] (II)向步骤（I)所得细胞悬浮液中加入等体积的悬浮培养基，再以120-140转/ 分钟的转速震荡培养8-12天，得到待过滤细胞悬浮液；
[0017] (III)将步骤（II)所得细胞悬浮液用300目筛子过滤，去除大细胞团，加入等体 积悬浮培养基，再以120-140转/分钟的转速震荡培养8-12天，得到过滤再培养细胞悬浮 液；
[0018] (IV)重复步骤（111)2-3次，最后一次所得过滤再培养细胞悬浮液即为多花筋骨 草悬浮细胞系。
[0019] 2、所述外植体为多花筋骨草幼嫩叶片。
[0020] 3、步骤（三）中，将所述愈伤组织二悬浮培养四代后再培养8天的细胞接种于悬 浮培养基振荡培养，接种量为l〇〇g/L。
[0021] 利用本发明所提供的方法首次建立了多花筋骨草悬浮细胞系，从而快速高效获得 具有亲本全套基因的单倍体植株。本方法的细胞悬浮培养分散性好，细胞大小均一，生长迅 速，重复性好。
【专利附图】
【附图说明】
[0022] 图1为接种量对悬浮细胞生长的影响。
[0023] 图2为2,4-D浓度对悬浮细胞生长的影响。
[0024] 图3为蔗糖质量浓度对悬浮细胞生长的影响。
[0025] 图4为多花筋骨草培养液中糖浓度的变化规律。
[0026] 图5为多花筋骨草悬浮细胞系培养物鲜重、干重生长曲线。
[0027] 图6为多花筋骨草悬浮细胞系培养物PCV变化曲线。
[0028] 图7为多花筋骨草悬浮培养细胞β -蜕皮留酮含量变化曲线。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述：
[0030] 实施例1
[0031] 从多花筋骨草幼嫩叶片诱导得到愈伤组织
[0032] 本实验所用多花筋骨草采自辽宁省沈阳福陵森林公园，移栽至东北林业大学林学 院实验室栽培。4月初采其幼嫩叶片做外植体，首先将外植体置于流水下冲洗30分钟，其 次在超净工作台中用质量浓度75%的酒精消毒外植体30秒，然后用无菌水冲洗3次后将 其置于适量的2. 5%的NaClO溶液中，100转/分钟摇床震荡8分钟，去除NaClO溶液后，再 用无菌水彻底冲洗残留的NaClO溶液，约5-6次，最后用无菌滤纸吸去外植体表明的水分。 用解剖刀切去叶片边缘，再将其切成Icm2大小，叶片正面朝上接种于诱导培养基上，于温度 为24-26°C，光暗周期为16小时/8小时，光照强度为20001x的条件下诱导其生成愈伤组织 一。愈伤组织形成后，每20d继代一次，在继代培养基中连续继代培养5次，反复筛选后选 取生长均一，质地疏松，分散性好的愈伤组织做接种材料，此为愈伤组织二。继代培养的条 件同上。
[0033] 所述诱导培养基和继代培养基配方如下：MS基本培养基中添加最终浓度为 0· 4mg/L 的 2,4-D、0. 2mg/L 的 KT、0. 2mg/L 的 6-BA 和 5-6g/L 的琼脂，调节 pH = 6. 2,于 121 C尚压灭囷20分钟。
[0034] 实施例2
[0035] 稳定悬浮细胞的获得
[0036] 1、悬浮细胞的诱导
[0037] 在最后一次继代培养中，愈伤组织培养14d后，挑选形状松散，颜色黄绿、生长迅 速的颗粒状胚性愈伤组织，用镊子将愈伤组织轻轻夹碎，接种在含50mL培养液的IOOmL三 角瓶中进行悬浮震荡培养。培养条件：温度为（25±1)°C，光暗周期16h/8小时，光照强度 20001x，摇床转速120-140转/分钟。
[0038] 2、稳定悬浮细胞的获得
[0039] 将1中的细胞悬浮震荡培养24小时后，过滤除去较大、较紧密的细胞团后继续培 养，以上述条件培养8-12天后得到细胞悬浮液，再将所得的悬浮液中加入等体积的悬浮培 养基，继续震荡培养8-12天，得到待过滤细胞悬浮液。
[0040] 将上述细胞悬浮液经300目筛子过滤，去除大细胞团，加入等体积悬浮培养基，再 以120-140转/分钟的转速震荡培养8-12d，得到过滤再培养细胞悬浮液；重复以上步骤 2-3次，最后一次所得过滤再培养细胞悬浮液即为多花筋骨草稳定的悬浮细胞系。
[0041] 每3天取3瓶进行PCV、鲜重、干重测定，取平均值，以确定适合悬浮细胞生长的最 佳条件。
[0042] 实施例3
[0043] 影响悬浮细胞生长的因素的确定
[0044] 1、接种量对多花筋骨草悬浮细胞尘长的影响
[0045] 将愈伤组织二悬浮培养4代后再培养8d的细胞按不同接种量（接种量5%、10%、 15%、20%、25%、30%)接种到悬浮培养基中，培养12d后分别测定其PCV、鲜重和干重。以 接种量为横坐标，以鲜重增殖数量为纵坐标做接种量对多花筋骨草悬浮细胞生长的影响曲 线图，结果如图1所示。多花筋骨草悬浮培养时初始接种量为10 %，即接种量l〇〇g/L时，悬 浮细胞PCV、鲜重及干重增殖倍数最多，增殖倍数均超过4倍。
[0046] 2、生长调节剂对悬浮细胞生长的影响
[0047] 接种相同质量的培养物到添加不同2,4-D浓度（2,4-D浓度0· 2mg/L、0. 4mg/L、 0. 6mg/L、0. 8mg/L、I. Omg/L)的悬浮培养基中培养，生长12d后测定细胞鲜重情况。接种量 均为10%，培养液均为50mL。以2,4-D浓度为横坐标，以细胞干重增殖数量为纵坐标绘制 不同2,4-D浓度对悬浮细胞生长的影响图，结果如图2所示。通过对植物生长剂2,4-D不 同浓度试验发现，多花筋骨草悬浮细胞系建立中，2,4-D终浓度0. 6mg/L时细胞生长效果最 好。
[0048] 3、蔗糖浓度对悬浮细胞生长的影响
[0049] 1)采用添加不同蔗糖浓度（蔗糖浓度 10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L) 的培养基进行悬浮震荡培养，培养12d测定细胞鲜重。以蔗糖浓度为横坐标，以悬浮细胞鲜 重增殖倍数为纵坐标做糖的质量浓度对多花筋骨草悬浮细胞生长的影响曲线，结果如图3 所示。多花筋骨草细胞悬浮培养中，蔗糖终浓度为20g/L时细胞生长效果最好。
[0050] 2)培养液中残糖浓度的测定
[0051] ①标准曲线的绘制：准确秤取Ig葡萄糖，蒸馏水定容至1L，S卩lmg/L。吸取OmU 0. 2mL、0. 4mL、0. 6mL、0. 8mL、l. OmL葡萄糖标准液于6支干洁试管中，依次加入蒸馏水lmL、 0· 8mL、0. 6mL、0. 4mL、0. 2mL、0mL，即浓度梯度分别为 0g/L、0. 2g/L、0. 4g/L、0. 6g/L、0. 8g/L、 1. Og/L，再加5ml蒽酮试剂（lg蒽酮溶于72%的硫酸1000mL，棕瓶冰箱保存2-3周），将各 管摇匀，于沸水浴中加热l〇min，冷却后在波长620nm处比色，以第一管溶液做为空白，测其 余管的吸光度，以葡萄糖浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，求回归方程。
[0052] ②取稀释100倍的培养液ImL于试管中，按上述方法处理样品液，测得样品液吸光 度。测得吸光度值代入回归方程式求得样品液中的残糖浓度。结果如图4所示。结果说 明：总糖的消耗与与细胞生长成负相关，在细胞的延滞期（l-3d)总糖消耗较慢，对数生长 期（3-9d)总糖被快速消耗，稳定期和衰亡期总糖消耗趋于平稳。
[0053] 4、适合悬浮细胞生长的悬浮培养基成分的确定
[0054] 综上所述，将适合悬浮细胞生长的悬浮培养基成分确定为：MS基本培养基、2,4-D 终浓度〇.6mg/L、蔗糖终浓度20g/L。调节pH值于5.8,于121°C高压灭菌20分钟。MS基本 培养液的溶剂是水，溶质如表1所示。
[0055] 表1多花筋骨草悬浮培养MS培养基配方
[0056]
【权利要求】
1. 一种建立富含蜕皮激素的多花筋骨草悬浮细胞系的方法，其特征在于，包括如下步 骤： 步骤（一）、将多花筋骨草外植体置于诱导培养基上进行诱导培养，得到愈伤组织一； 步骤（二）、将所述愈伤组织一置于继代培养基上进行继代培养五次以上，选取生长均 一、质地疏松的，从而得到愈伤组织二； 步骤（三）、将所述愈伤组织二置于悬浮培养基中进行悬浮震荡培养； 步骤（四）、收获细胞，提取蜕皮激素； 所述悬浮培养基配方如下：MS基本培养基中添加最终浓度为0. 6mg/L 2,4-D和20g/L 蔗糖，调节pH = 5.8 ;于121°C高压灭菌20分钟； 所述诱导培养基和继代培养基配方如下：MS基本培养基中添加最终浓度为0. 4mg/L 2,4-D、0. 2mg/L KT、0. 2mg/L 6-BA 和 5-6g/L 琼脂；调节 pH = 6. 2 ;于 121°C高压灭菌 20 分 钟； 外界调控条件为：温度=25±1°C ;光暗周期16小时/8小时；光照强度20001x ;采用 透气膜封口。
2. 根据权利要求1所述的一种建立富含蜕皮激素的多花筋骨草悬浮细胞系的方法，其 特征在于：步骤（三）中，进行悬浮震荡培养，从而获得多花筋骨草悬浮细胞系的方法，具体 包括如下步骤： (I) 将所述愈伤组织二置于所述悬浮培养基中，以120-140转/分钟的转速震荡培养 8-12天，得到细胞悬浮液； (II) 向步骤（I)所得细胞悬浮液中加入等体积的悬浮培养基，再以120-140转/分钟 的转速震荡培养8-12天，得到待过滤细胞悬浮液； (III) 将步骤（II)所得细胞悬浮液用300目筛子过滤，去除大细胞团，加入等体积悬浮 培养基，再以120-140转/分钟的转速震荡培养8-12天，得到过滤再培养细胞悬浮液； (IV) 重复步骤（111)2-3次，最后一次所得过滤再培养细胞悬浮液即为多花筋骨草悬 浮细胞系。
3. 根据权利要求1所述的一种建立富含蜕皮激素的多花筋骨草悬浮细胞系的方法，其 特征在于：所述外植体为多花筋骨草幼嫩叶片。
4. 根据权利要求2所述的一种建立富含蜕皮激素的多花筋骨草悬浮细胞系的方法，其 特征在于：步骤（三）中，将所述愈伤组织二悬浮培养四代后再培养8天的细胞接种于悬浮 培养基振荡培养，接种量为l〇〇g/L。
【文档编号】C12R1/91GK104498427SQ201410821225
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月20日 优先权日:2014年12月20日
【发明者】赵佳佳, 迟德富, 宇佳 申请人:东北林业大学