专利名称：制备紫背天葵胚性细胞悬浮培养细胞系的方法及其专用培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞悬浮培养领域，特别涉及一种制备紫背天葵胚性细胞悬浮培养细 胞系的方法及其专用培养基。
背景技术：
紫背天葵，学名Gynura bicolor DC，别名紫背菜、两色三七草、红背菜、观音菜，为 菊科三七草属多年生宿根草本植物。其整个植株呈紫绿色，叶长卵型，边缘有锯齿，叶面绿 色略带紫，背面紫红色具蜡质，有光泽，是有药用价值的野生蔬菜。紫背天葵作为一种值得 推广的高营养保健蔬菜，含有较为丰富全面的营养成分，除一般蔬菜所具有的营养物质外， 还富含可提高动物抗病能力，并对恶性生长细胞具有中度抗性的黄酮类化合物及铁、锰、锌 等对人体有益的微量元素。在我国南方一些地区更是把紫背天葵作为一种补血的“良药”， 是产后妇女食用的主要蔬菜之一。同时它也是很好的天然红色素原料，这种色素就是花青 素。随着众多的合成色素被发现有毒害作用以及人们保健意识的增强，传统工业合成色素 的应用范围逐步缩小，前期影响广泛的“苏丹红”事件使人们谈“红”色变；植物体花青素 作为一种天然色素，安全、无毒、资源丰富，具有相当的营养和药理作用，对人类健康影响广 泛，在食品、化妆品以及医药等方面有着巨大的应用潜力。紫背天葵可用扦插及种子繁殖， 但主要采用扦插繁殖。但是长期使用无性繁殖易感染病菌，需用种子繁殖更新，或用组培技 术脱毒重新育苗。组培技术具有繁殖系数高、速度快、不受季节影响等优点，是植物快速繁 殖的重要是手段，建立胚性细胞悬浮系，为其进一步通过体细胞胚发生途径再生植株提供 可能。到目前为止，现在还没有紫背天葵胚性细胞悬浮系的建立方法，也阻碍了紫背天 葵所含青花素等类黄酮物质的工厂化生产和应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于制备紫背天葵胚性细胞悬浮系的液体培养基。本发明提供的用于紫背天葵悬浮培养细胞系的液体培养基，是在MS基本培养液 中添加2，4-D、KT(激动素)和碳源得到的液体培养基；液体培养基中2，4-D的终浓度是 l-3mg/L，KT 的终浓度是 0. 2-lmg/L ；上述MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示。表1. MS基本培养液的溶质_大量元素_培养基中浓度(mg·!/1)
本发明的液体培养基中2，4-D的终浓度优选是1. 5-2. 5mg/L, KT的终浓度优选是 0.4-0. 6mg/L。上述液体培养基中2，4-D的终浓度更优选是2mg/L，KT的终浓度更优选是0. 5mg/ L0上述液体培养基中碳源可为葡萄糖、麦芽糖或蔗糖，优选为蔗糖，蔗糖在液体培养 基中的终浓度是20-40g/L，其终浓度也可优选为25-35g/L。本发明的另一目的是提供一种 制备紫背天葵胚性细胞悬浮培养细胞系的方法。本发明的制备紫背天葵胚性细胞悬浮培养细胞系的方法，是将紫背天葵胚性愈伤 组织置于上述本发明的液体培养基中培养得到的悬浮培养细胞系。上述紫背天葵胚性愈伤组织是将紫背天葵叶片置于愈伤组织诱导培养基上诱导 培养得到的。上述愈伤组织诱导培养基是在MS基本培养液中添加2，4_D、KT、碳源和凝胶剂得 到的固体培养基；其中2，4-D的终浓度是l-3mg/L，KT的终浓度是0. 2-lmg/L ；MS基本培养 液的溶剂是水、溶质如表1所示。上述愈伤组织诱导培养基中2，4_D的终浓度优选是2mg/L，KT的终浓度优选是 0. 5mg/L。上述诱导培养的条件是温度为26°C，光照强度为25001UX，光照时间为16小时/天。本发明的方法还包括预处理步骤，该预处理步骤可为将紫背天葵叶片置于70% (体积百分比)的酒精里灭菌20-40秒，用无菌水冲洗，再用滴加了吐温的0.1% (体积百 分比)的升汞浸泡6-10分钟后，用无菌水冲洗干净。本发明中固体培养基中的碳源可为葡萄糖、麦芽糖或蔗糖等，优选为蔗糖；蔗糖的 用量可为在培养基中的终浓度是20-40g/L ；凝胶剂可为琼脂、卡拉胶或Gelrite等，优选是 琼脂，琼脂的用量可为在培养基中的终浓度是7-9g/L;凝胶剂的用量以能达到培养基的硬 度为基础，可适当调整用量。本发明的液体培养基可有效地用于紫背天葵悬浮细胞系的制备。本发明中愈伤组 织的诱导率可达到100%。本发明提供了一种紫背天葵胚性细胞悬浮培养的方法，为国内外首次在此方向进 行研究，并且所获得的胚性细胞色泽鲜黄，细胞分裂旺盛，分散性好，为建立以紫背天葵为 原料的生物反应器提供了可靠的理论基础。
图1为本发明实施例1诱导的愈伤组织。图2为本发明实施例1紫背天葵愈伤组织悬浮培养生长曲线。图3为本发明实施例1紫背天葵胚性细胞悬浮培养细胞系。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。实施例1、制备紫背天葵胚性细胞悬浮培养细胞系一、胚性愈伤组织的获得及统计观察1、外植体的预处理选取幼嫩平展的紫背天葵(品种为红叶，购于北京市农林科学院蔬菜中心)叶片 为外植体，先在70% (体积百分比)的酒精里灭菌30s，用无菌水冲洗3次，再用滴加了吐 温的0. (体积百分比)的升汞浸泡8min，然后用无菌水冲洗干净。2、胚性愈伤组织的获得1)诱导愈伤组织将上述步骤1中预处理后的紫背天葵叶片剪成IcmX Icm左右的小块，叶背朝下的 接种在愈伤组织诱导培养基上，在温度为26°C，光照强度为25001UX，光照时间为16小时/ 天的培养条件下培养，24天后得到愈伤组织。上述愈伤组织诱导培养基是在MS基本培养液中添加2，4_D、KT、蔗糖和琼脂得到 的固体培养基；其中2，4-D的终浓度是2mg/L，KT的终浓度是0. 5mg/L,蔗糖的终浓度是 30g/L，琼脂的终浓度是8g/L，培养基的pH为5. 9 ;MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示2)统计观察愈伤组织诱导情况实验重复3次，统计观察上述步骤1)中愈伤组织的诱导情况，培养40天的实验结果见下表2。从表2可以看出，紫背天葵叶片在培养16天左右开始出现愈伤组织，培养24 天后愈伤组织的诱导率可达到100%。表2.愈伤组织的诱导率 3)继代得到胚性愈伤组织待上述步骤1)中得到的愈伤组织生长30天时，将其转接到新鲜的相同的培养基 (即步骤1)中的愈伤组织诱导培养基)上进行继代培养，直到产生新鲜的，嫩黄的，松散的、 生长旺盛的胚性愈伤组织，培养约60天可获得胚性愈伤组织(如图1所示)。上述继代培养的培养条件是温度为26 °C，光照时间为16h/d，光照强度为 25001ux。二、胚性细胞悬浮培养细胞系的获得1、液体培养挑取步骤一中步骤3)得到的新鲜的，嫩黄的，松散的、生长旺盛的胚性愈伤组织， 将其接入到本发明的液体培养基中，按每瓶的接种量为2. 5g胚性愈伤组织(细胞密度约 为1 X IO5个/mL)，IOOmL三角瓶含有33mL液体培养基，在26°C，黑暗培养，100r/min条件 下振荡培养15天。每隔5天观察细胞及细胞团状态，取样称量，记录数据，数据见表3，趋 势图见图2 (纵坐标是生长量的倍数=增殖后质量/增殖前质量)。说明5天以后，悬浮培 养细胞系进入对数增长期，15天以后悬浮细胞增殖速度大大减慢，表明最佳继代时间为15 天。表3.悬浮细胞培养质量变化 上述液体培养基是在MS基本培养液中添加2，4-D、KT和蔗糖得到的液体培养基； 其中2，4-D的终浓度是2mg/L，KT的终浓度是0. 5mg/L,蔗糖的终浓度是30g/L，培养基的pH =5. 9，MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示。2、得到紫背天葵胚性细胞悬浮系
将上述步骤二中步骤1液体培养15天时的胚性愈伤组织转接到新鲜的无菌的与 步骤二中步骤1的液体培养基一致的液体培养基中继代培养，继代时使用无菌过滤网，将 较大的悬浮细胞团过滤掉，留下较小的细胞团，将较小的细胞团转移到新鲜的液体培养基 中；经过继代培养直至最终得到生长迅速的胚性细胞悬浮培养细胞系(如图3所示)。
权利要求
一种用于紫背天葵悬浮培养细胞系的液体培养基，是在MS基本培养液中添加2，4-D、KT和碳源得到的液体培养基；所述液体培养基中2，4-D的终浓度是1-3mg/L，KT的终浓度是0.2-1mg/L；所述MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示。
2.根据权利要求1所述的液体培养基，其特征在于所述液体培养基中2，4-D的终浓 度是 1. 5-2. 5mg/L, KT 的终浓度是 0. 4-0. 6mg/L。
3.根据权利要求1或2所述的液体培养基，其特征在于所述液体培养基中2，4-D的 终浓度是2mg/L，KT的终浓度是0. 5mg/L。
4.根据权利要求1-3中任一所述的液体培养基，其特征在于所述碳源为葡萄糖、麦芽 糖或蔗糖，优选为蔗糖，所述蔗糖的终浓度是25-35g/L。
5.一种制备紫背天葵胚性细胞悬浮培养细胞系的方法，是将紫背天葵胚性愈伤组织置 于权利要求1-4中任一所述的液体培养基中培养得到的悬浮培养细胞系。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述紫背天葵胚性愈伤组织是将紫背天 葵叶片置于愈伤组织诱导培养基上诱导培养得到的。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述愈伤组织诱导培养基是在MS基本培 养液中添加2，4-D、KT、碳源和凝胶剂得到的固体培养基；其中2，4-D的终浓度是l_3mg/L， KT的终浓度是0. 2-lmg/L ；所述MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述愈伤组织诱导培养基中2，4-D的终 浓度是2mg/L，KT的终浓度是0. 5mg/L。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于所述凝胶剂是琼脂、卡拉胶或 Gelrite，优选是琼脂，所述琼脂的终浓度是7_9g/L ；所述碳源为葡萄糖、麦芽糖或蔗糖，优选为蔗糖，所述蔗糖的终浓度是20-40g/L。
10.如权利要求6-9中任一所述的方法，其特征在于所述诱导培养的条件是温度为 26°C，光照强度为25001uX，光照时间为16小时/天。
全文摘要
本发明公开了一种制备紫背天葵胚性细胞悬浮培养细胞系的方法及其专用培养基。本发明的液体培养基是在MS基本培养液中添加2，4-D、KT和碳源得到的液体培养基；液体培养基中2，4-D的终浓度是1-3mg/L，KT的终浓度是0.2-1mg/L。本发明的制备紫背天葵胚性细胞悬浮培养细胞系的方法，是将紫背天葵胚性愈伤组织置于本发明的液体培养基中培养得到的悬浮培养细胞系。本发明中愈伤组织的诱导率可达到100％。本发明可有效地制备紫背天葵胚性细胞悬浮培养细胞系，为建立以紫背天葵为原料生物反应器提供了可靠基础。
文档编号C12N5/04GK101838631SQ20101019783
公开日2010年9月22日 申请日期2010年6月3日 优先权日2010年6月3日
发明者刘莉莎, 温常龙, 王玉珏, 程琳, 赵永钦, 赵立群, 郭仰东 申请人:中国农业大学