专利名称：水母雪莲毛状根细胞系的制作方法
技术领域：
本发明属于植物生物技术领域，尤其涉及一种水母雪莲毛状根细胞系。
背景技术：
水母雪莲是藏药“恰羔素巴”之正品。主要分布于海拔3900-5600米的高寒冰缘地带，为青藏高原特有植物品种，是名贵药用植物，藏医中用于治疗风湿性关节炎、妇科病及高山反应等症。雪莲由于其分布区自然条件极为恶劣气温低，冷季干旱而漫长，暖季短暂，植物生长季仅90-150天。水母雪莲一般3-5年才能够成熟开花，一般高度在30厘米左右，甚至更低。使得水母雪莲的自然资源极其有限。雪莲分布的地区植物群落结构简单，植物的多样性指数很低，同时由于植物的生物量较低，生态系统一旦破坏将难以恢复。
故为人工栽培水母雪莲，中国科学院植物研究所的200310121348.8的专利申请中公开了一种水母雪莲毛状根培养生产雪莲多糖类有效成份的方法，该方法是利用发根农杆菌R1601诱导水母雪莲得到毛状根，其诱导产生的毛状根中的多糖含量最高可达毛状根干重的5-10％，比野生生药中的0.5％多糖含量高许多。但该方法的培养目的是为了提高水母雪莲的毛状根中的多糖含量，而对其中具有药用的价值的生物碱的含量提高无显著影响。
农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌，1907年人们发现它是植物致瘤的起因，植物细胞被其侵染后，形成肿瘤。能够诱发冠瘿瘤的称为根癌农杆菌，诱导毛发状根的称为发根农杆菌。受感染的细胞可产生正常细胞所不能产生的生物碱-冠瘿碱，被农杆菌利用作为碳源和氮源。
经过持续不断的基础研究，直到1974年，发现在根癌和发根农杆菌中分别有一种环型的Ti或Ri质粒，质粒上的一段T-DNA(转移DNA)包含有生长素基因和细胞分裂素基因，它可以插入植物基因组从而引起细胞特性的变化。由于T-DNA能够进行高频率转移，而且Ti质粒上可插入大到50kb的外源DNA，因此可以利用这种天然的遗传转化体系，将外源DNA转移到植物细胞，并利用植物细胞的全能性，经过细胞或组织培养，由一个转化细胞再生成完整的转基因植物。
在迄今发展起来的转基因技术中，农杆菌介导的遗传转化占据主导地位，应用最为广泛，特别是在双子叶植物上尤其普遍。近几年来农杆菌转化在水稻等谷类作物上取得成功，其应用范围将进一步扩大。农杆菌介导的优点是转化频率高，可转移较大的DNA片段，所转移DNA很明确地为T-DNA左右边界之间的序列，并可直接用不同的植物组织进行基因转移，不需要原生质体培养再生植株的技术，从而提高转育周期。
发根农杆菌是一种寄主非常广泛的土壤细菌，能够侵染几乎所有的双子叶植物和少数的单子叶植物。发根农杆菌的Ri质粒被广泛的应用于植物基因工程、植物次生代谢产物的生产、植物品种改良和植物的栽培中。其转化植物产生的毛状根有如下优点1)毛状根具有生长迅速，激素自主性，2)可以方便的转入外源基因，3)Ri质粒转化的植物的毛状根分化正常植株的频率高，倍性稳定，容易建成系列，4)无性系拥有亲本特征次级代谢途径，且次生代谢产物的生产能力高、含量稳定，5)毛状根来源于一个单细胞，为优良系的筛选提供了极大的方便。
发明内容
本发明的目的在于提供一种水母雪莲毛状根细胞系，该细胞系是利用发根农杆菌侵染水母雪莲并由水母雪莲外植体上诱导形成毛状根，从而提高了水母雪莲毛状根中的生物碱含量，其含量最高可达毛状根干重2.1％。
本发明的目的可通过如下措施来实现一种水母雪莲毛状根系高原R0405，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市海淀区中关村北一条13号，10080，电话010-62542758)，保藏日期2005年12月05日，保藏号CGMCC No.1557，建议分类命名为Saussurea medusa；该水母雪莲细胞系具有以下特征此系具有毛状根的形态，根生长迅速具有多层分枝，能够在无激素MS培养基上自主生长。生物碱含量高。
本发明的优点及效果由发根农杆菌A4侵染水母雪莲子叶获得的发根系能够在无激素的培养基上自主生长，而且生长速度快，分枝频率高。使离体培养条件下生物量在一个培养周期内的积累的达到接种量的5-15倍。毛状根中的生物碱含量，其含量最高可达毛状根干重的2.1％。这些优点有利于以后的生物反应器培养。有助于水母雪莲离体条件下的大规模培养来生产有效次生代谢物具体实施方式
以下将参照具体实施例以详述本发明。
实施例一一种水母雪莲毛状根系的诱导与培养方法，其包括如下步骤(1)取无菌水母雪莲种子，接种至幼苗培养基进行幼苗培养，获得无菌幼苗；(2)以所述步骤(1)获得的无菌幼苗的子叶作为外植体放入预培养基中进行暗培养；(3)将所述步骤(2)中进行预培养的子叶外植体经发根农杆菌A4的介导进行转化；(4)将所述步骤(3)介导转化后的子叶外植体再放回所述步骤(2)的预培养基中进行共培养；(5)将所述步骤(4)进行暗培养的子叶外植体放入抑菌培养基中进行抑菌继代培养，直至在外植体上形成毛状根；(6)将所述(5)抑菌培养的具有毛状根的外植体放入毛状根扩增培养基中进行毛状根的扩大培养。
所述步骤(1)的幼苗培养是将无菌水母雪莲种子置于无激素的MS培养基中、20-25℃下培养。。
所述步骤(2)的子叶外植体在预培养基中进行的暗培养是将外植体放入预培养基在20-25℃下培养24-48h；所述的预培养基包括下述含量的组份MS基本培养基、2.0-10mg/L生长素、0.2-1mg/L细胞分裂素。
所述的步骤(3)中的预培养子叶外植体经发根农杆菌的介导转化是将预培养后的外植体浸入发根农杆菌A4菌液中，浸泡6-12min，以进行介导转化。
所述的发根农杆菌液是将发根农杆菌A4菌株置入YEP液体培养基中，在25-29℃、180r/min转速下培养过夜；然后将菌液进行离心分离弃上清液，用无激素MS培养基重悬浮并稀释到OD＝0.4-0.8，所述OD值为农杆菌菌液在260nm光波下的光吸收值。
所述的步骤(4)中的介导转化后的子叶外植体的共培养是将介导转化的外植体放入预培养基中在25-29℃下培养24-48h；所述的预培养基包括下述含量的组份MS基本培养基、2.0-10mg/L生长素、0.2-1mg/L细胞分裂素。
所述的生长素选自2，4-D、NAA、IAA中的一种。
所述的细胞分裂素选自6-BA、KT、ZT中的一种。
所述的步骤(5)将介导转化的子叶外植体进行暗培养后的外植体再进行抑菌继代培养是将介导转化的子叶外植体进行暗培养后的外植体放入抑菌培养基中于20℃±5℃、24-48h黑暗中进行至少五次的继代抑菌培养，直至将菌除净。
所述的抑菌培养基包括下述含量的组份无任何激素的MS基本培养基、第一抗菌素400-600mg/L。
所述的第一抗菌素选自头孢唑啉钠、头孢拉啶中的一种。
所述的步骤(6)中将具有毛状根的外植体放入毛状根扩增培养基中进行毛状根的扩大培养是指将抑菌培养的具有毛状根的外植体放入毛状根扩增培养基中，20℃±5℃、24-48h黑暗中进行毛状根扩大培养。
所述的毛状根扩增培养基包括下述含量的组份MS基本培养基、第二抗菌素400-600mg/L。
所述的第二抗菌素选自羧苄青霉素、羧茚青霉素中的一种。
所述的抑菌培养基和毛状根扩增培养基中还包括下述含量的组份水解酪蛋白250-350mg/L、肌醇100-300mg/L、Vc 1-3mg/L、柠檬酸2-6mg/L、蔗糖浓度3-8％、琼酯粉0.2-0.8％。
其更具体的实施方式如下水母雪莲毛状根细胞系的制备方法，包括如下步骤(1)将水母雪莲的种子灭菌，于超净工作台上接种到无激素MS培养基中，20℃培养获得无菌幼苗；(2)取水母雪莲的无菌幼苗，将无菌幼苗、子叶、叶柄和胚轴剪成1cm左右的小段，转入预培养基中20℃暗培养2天；所述预培养基包括下述含量的组份MS培养基、2.0mg/L 2，4-D生长素、0.2mg/L细胞分裂素，(3)将预培养2D的水母雪莲的各种外植体浸入发根农杆菌液中，浸泡8min，将预培养的外植体经发根农杆菌A4菌株的介导进行转化，然后在无菌滤纸上吸去多余的菌液；(4)介导转化后的外植体再放回原来的预培养基中，28℃暗培养2天；(5)将暗培养2D后的外植体转接到附加了500mg/L头孢唑啉钠(cef)的MS无激素培养基中，进行抑菌抑菌继代培养；隔2天转接一次，5次后，将转接周期适当延长，直至将菌除净；(6)将所述(5)抑菌培养的具有毛状根的外植体放入附加了500mg/L羧苄青霉素(car)的MS无激素培养基上进行毛状根的扩大培养。
其中，所述的发根农杆菌液的制取如下挑取发根农杆菌的单菌落接种于YEB液体培养基中，28℃、180r/min培养过夜。将菌液于离心管中4000r/min离心10min。弃上清，用无激素MS液体培养基重悬浮并稀释到OD＝0.6。
其中MS培养基中的各元素的含量如下(mg/L)MgSO4·7H2O 370 CaCl2·2H2O 440KNO31900 NH4NO31650 KH2PO4170FeSO4·7H2O 27.8 Na2EDTA 37.3 MnSO4.4H2O 11.2ZnSO4·7H2O 4.3 CuSO4.5H2O 0.0125KI 0.42H3BO33.1 Na2MoO4.2H2O 0.125CoCl2.6H2O 0.0125Glycine1 VB6-0.25VB10.05 Nicotinicacid 0.25在外植体预培养、抑菌培养及扩增培养过程中所用培养基中蔗糖浓度为3％-8％范围内，水解酪蛋白300mg/L，肌醇200mg/L，Vc 2mg/L，柠檬酸4mg/L，PH5.8，琼脂粉约0.5％。20℃±1℃黑暗中培养。
所述的YEB培养基作为发根农杆菌培养基，其中的各元素的含量如下(mg/L)蛋白胨(peptone) 5000酵母提取物(yeast extract powder) 1000牛肉浸膏(Beef Extract) 5000MgSO4·7H2O 495PH 7.0经过上述的诱导培养步骤后，水母雪莲的各种外植体在附加抗生素cef的无激素的MS培养基中培养，子叶外植体上愈伤组织然后再在愈伤组织上形成毛状根，而叶柄和胚轴外植体多直接形成毛状根。毛状根生长至1-2cm时，将其切下继续接在无激素的MS培养基中培养，毛状根能够在无激素培养基上自主生长。在培养过程中抗生素cef有利于外植体先形成愈伤组织和毛状根的分化，但不利于毛状根的生长和分枝。而在附加了car的MS无激素培养基上毛状根能够迅速生长和分枝。
对筛选出的根系进行PCR检测和农杆碱电泳检测，以确定T-DNA的插入。
经上述方法诱导培养10-14天后，各外植体均在切口处产生愈伤组织。约3周后开始一些外植体上出现根。之后形成根的外植体和根的数量不断增多。每块外植体上根的数量从1到30条不等。以毛状根的诱导率为标准，选择出水母雪莲毛状根诱导的最适条件以水母雪莲子叶为外植体，发根农杆菌菌液的浓度为OD＝0.6，毛状根的诱导率是78.7％。得到的毛状根具有不同的分枝和生长状况。在进行毛状根培养研究的过程中发现在附加了cef的培养基上毛状根只伸长极少分枝，而且毛状根随着生长只有刚伸长的部分保持良好的生长状态，其余的逐渐褐化。当毛状根转接到附加了car的无激素培养基则生长迅速且分枝多。
对毛状根系进行PCR检测。根据T-DNA区的ROL基因序列分别设计RolA、RolB、RolC基因的引物，通过扩增得到相应分子量的特异条带。证明了T-DNA插入水母雪莲基因组诱导形成毛状根的可能性。
对毛状根提取物进行农杆碱电泳检测，毛状根样品中出现水母雪莲原植物中没有的斑点。说明农杆菌基因已经整合到植物基因组中并表达。
权利要求
1.一种水母雪莲毛状根细胞系R0405，其保藏号为CGMCC No.1557。
全文摘要
本发明涉及一种水母雪莲毛状根细胞系R0405，其保藏号CGMCCNo.1557；本发明的水母雪莲毛状根细胞系能够在无激素培养中自主生长，而且毛状根中的生物碱含量得到提高，可达到干重的2.1％。将有利于离体培养条件下生产目的产物研究，并有助于下一步解决天然雪莲资源匮乏的问题的研究。
文档编号C12N5/04GK1966673SQ20051002279
公开日2007年5月23日 申请日期2005年12月30日 优先权日2005年12月30日
发明者王莉, 李毅 申请人:中国科学院西北高原生物研究所