金鱼心脏细胞系及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种金鱼心脏细胞系及其应用。该金鱼心脏细胞系已于2014年7月3日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏登记编号为CGMCC?No.9334。本发明所述的金鱼心脏细胞系特性稳定、成分均一，是研究水产动物病毒的良好材料。
【专利说明】金鱼心脏细胞系及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种金鱼心脏细胞系及其应用，属于医学生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 关于鱼类细胞系的筛选建立的研究，国内外取得了很大的研究进展。胖头鱼肌肉 细胞系、剑尾鱼胚胎细胞系和巴拉圭鰺幼鱼细胞系等多种包括海淡水鱼类细胞系也陆续建 立起来。2013年，国外学者建立了条纹无须紕的尾鳍细胞系和团头鲂的鳍条细胞系。2007 年，国内学者樊挺俊等建立了大菱鲆鳍细胞系；2003年薛淑群等建立了鲤鱼尾鳍条细胞 系。目前尚无关于建立金鱼心脏细胞系的相关报道。
[0003] 世界卫生组织（0ΙΕ)推荐检测水产动物病毒的"黄金标准"是通过细胞来分离病 毒。由此，国内外的许多学者正在进行鱼类细胞系的研究。鱼类原代细胞系的建立技术目 前是一种较为成熟的技术，但是要获得针对病毒敏感的细胞系仍存着很大的偶然性和困难 性，所以建立一株需要鱼类细胞系有效的途径是制备大批量的原代细胞，从而筛选出对病 毒敏感的细胞系。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种特性稳定、成分均一的金鱼心脏细胞系 (GH)，该细胞系是一些水产动物病毒的敏感细胞系，也是进一步研究未知病毒的良好材料。
[0005] 本发明还要保护所述金鱼心脏细胞系的制备方法及该细胞系的应用。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明采用下述技术方案：
[0007] 经过筛选，本发明获得了特性稳定、成分均一的金鱼心脏细胞系，该金鱼心脏细 胞系（GH)已于2014年7月3日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)，并证明存活，其保藏登记编号为CGMCC No. 9334,保存地址为北京市朝阳区北辰西 路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101，其分类命名为金鱼心脏细胞系。
[0008] 进一步地，所述金鱼心脏细胞系具有以下生物学特性：
[0009] (1)细胞呈现典型的上皮细胞形态，连续传代培养50代仍保持该形态特点；
[0010] (2)细胞具有较强的增殖能力，连续培养50代仍保持该增殖和生长特性。
[0011] 本发明还提供了一种上述金鱼心脏细胞系的制备方法，该方法包括以下步骤：
[0012] (1)取金鱼一条，用医用酒精浸泡l_5min，于无菌条件下剪取金鱼的心脏，放于浓 度为1000u/ml的青霉素-链霉素双抗溶液中；
[0013] ⑵用解剖刀切割成小块（约1mm),胰酶消化液消化5min，用培养基重悬，离心，弃 掉上清液，再用培养基进行重悬，离心，弃掉上清，最后加入培养基，重悬混匀；
[0014] (3)将步骤（2)制备的重悬混匀液加入到细胞培养瓶中，25°C培养箱中培养；
[0015] (4)待细胞铺板到1/3的时候，更换新鲜的培养基一次；
[0016] (5)待细胞铺满板子，用胰酶消化液进行初步消化后，加入新的培养基进行培养；
[0017] (6)传代3次后，冻存，复苏后能够继续稳定增殖生长，该细胞系命名为GH。
[0018] 进一步地，所述培养基为含有浓度为lOOu/ml青霉素-链霉素双抗溶液和20 %特 级胎牛血清的M199培养基。
[0019] 进一步地，所述胰酶消化液的配制：磷酸氢二钠2. 3g，磷酸二氢钾0. lg，氯化钠 8. 0g，氯化钾 0· 2g，EDTA 0· 2g，胰酶 0· 6g，水 1000ml。
[0020] 进一步地，本发明所述的金鱼心脏细胞系GH可以作为研究水产动物病毒宿主细 胞使用，用于水产动物病毒的分离。
[0021] 本发明的有益效果如下：
[0022] 实验中使用的是鱼类细胞培养的最常用的培养基、且在简单的条件进行原代细胞 筛选培养，保证最终获得的细胞无需特殊试剂和条件就能增殖，为其提供了广阔的应用空 间。该金鱼心脏细胞系是首次成功在体外培养。该细胞在培养7天，明显出现延伸生长；15 天后铺满板子，进行消化后，具有较强的繁殖能力，呈现典型的上皮细胞形态。细胞连续传 代培养18个月已传至50代，仍然保持上述形态特点、生长和增殖特性。因此，该细胞是一 种特性稳定、成分均一的金鱼心脏细胞系，是研究水产动物病毒的良好材料。
【专利附图】
【附图说明】
[0023] 下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细的说明。
[0024] 图1相差显微镜下的金鱼心脏细胞系的形态；
[0025] 图2金鱼心脏细胞系悬浮特性分析；
[0026] 图3金鱼心脏细胞系的最佳血清浓度的确定；
[0027] 图4金鱼心脏细胞系的最佳培养温度的确定；
[0028] 图5金鱼心脏细胞系的倍增曲线分析；
[0029] 图6金鱼心脏细胞系的增殖病毒的初步应用。
【具体实施方式】
[0030] 为更好地理解本发明，下面将通过具体的实施例进一步说明本发明的方案，本发 明的保护范围应包括权利要求的全部内容，但不限于此。
[0031] 实施例1金鱼心脏细胞的分离和原代培养
[0032] 一、实验材料和试剂
[0033] 实验动物：10g_20g的健康的金鱼。
[0034] 实验器具：解剖刀、眼科剪刀、眼科镊子和纱布等。
[0035] 培养基和相关试剂：
[0036] 青霉素-链霉素双抗溶液浓度为10000u/ml ;
[0037] 培养基：含有浓度为100u/ml青霉素-链霉素双抗溶液和20 %特级胎牛血清（杭 州四季青生物工程材料有限公司）的M199培养基（gibco公司）；
[0038] 胰酶消化液：磷酸氢二钠2. 3g，磷酸二氢钾0. lg，氯化钠8. 0g，氯化钾0. 2g，EDTA 〇.2g，胰酶 0.6g，水 1000ml ;
[0039] 医用酒精；
[0040] 0· 01M 的 PBS 缓冲液（NaCl 80g，Na2HP04 · 12H20 29g，KH2P042g，KC1 2g，水 1000ml)。
[0041] 二、实验方法
[0042] 经过检测的健康金鱼，在实验室内暂养15天，经过检测无其他疾病，开始实验。具 体方法：
[0043] (1)取一条金鱼在医用酒精中浸泡5min，无菌条件下，取金鱼的心脏，放于浓度为 lOOOu/ml的青霉素-链霉素双抗溶液（蒸馏水配制）中，放置15min ;
[0044] (2)用解剖刀切割成小块（约1mm),胰酶消化液消化5min。加入培养基，重悬。离 心lOOOrmp，20min。弃掉上清液，再次加入培养基，进行重悬，离心，弃掉上清液，最后加入培 养基，重悬混勻。
[0045] (3)将步骤（2)制备的重悬混匀液加入到细胞培养瓶中，25°C培养箱中培养。
[0046] (4)待培养2天后观察细胞贴壁情况，适当加入培养基（保证培养基的pH)。待细 胞铺板到1/3的时候（约7天），更换新鲜的培养基一次。
[0047] (5)待细胞铺满板子（约15天），用胰酶消化液进行初步消化后，加入新的培养基 进行培养。
[0048] (6)每隔7天传代1次。
[0049] 三、实验结果：
[0050] 图1为相差显微镜下的金鱼心脏细胞系的形态；图2是金鱼心脏细胞系悬浮特性 分析，结果表明细胞均一性比较好，集中在直径12-18微米。
[0051] 实施例2金鱼心脏细胞系的传代培养和冻存保种
[0052] -、试剂
[0053] 胰酶消化液：磷酸氢二钠2. 3g，磷酸二氢钾0· lg，氯化钠8. 0g，氯化钾0· 2g，EDTA 〇· 2g，胰酶 0· 6g，水 1000ml。
[0054] 冻存液：含10 % DMS0、25 %的特级胎牛血清的M199培养基。
[0055] 二、实验方法
[0056] 1.待细胞生长至90 %时，弃掉旧的培养基，加入5ml胰酶消化液进行消化；
[0057] 2.待细胞呈现"白雾"状的时候，加入2ml的冻存液，以终止胰酶的作用，轻轻幌 动，使细胞混匀，计数。
[0058] 3.收集细胞到冻存管中，于冻存管上注明细胞的名称、细胞数和冻存日期。
[0059] 4. -个月后，按照常规细胞复苏的方法，进行细胞复苏，细胞增殖能力仍然很强， 状态良好。
[0060] 获得的金鱼心脏细胞系（GH)已于2014年7月3日保存在中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心（CGMCC)，并证明存活，其保藏登记编号为CGMCC No. 9334。
[0061] 实施例3金鱼心脏细胞系的最适条件确定
[0062] -、试剂
[0063] 胰酶消化液：磷酸氢二钠2. 3g，磷酸二氢钾0· lg，氯化钠8. 0g，氯化钾0· 2g，EDTA 〇· 2g，胰酶 0· 6g，水 1000ml。
[0064] 培养基：不同浓度的特级胎牛血清的M199培养基。
[0065] 二、实验方法
[0066] 1、最适血清的确定
[0067] 分别配制特级胎牛血清浓度为10 %和20%的培养液，调整细胞密度为 3 X 105πι?Λ二种血清浓度培养基各按lmL/孔的量接种于24孔板，于25°C，培养箱中培养。 每天从每个实验组里取出3孔细胞，消化收集细胞并计数，共培养7天，连续计数7次，绘制 其生长曲线。
[0068] 2、最适温度的确定
[0069] 选择201：、251：、301：三个不同培养温度，使用添加20%特级胎牛血清的組99培 养液，调整细胞密度为3 X ΚΛιιΓ1，细胞悬液按lmL/孔的量接种于24孔板并置于三个不同 培养温度培养箱里。每天从每个实验组里取出3孔细胞，收集细胞并计数，共培养7天，连 续计数7次，绘制其生长曲线。
[0070] 三、实验结果
[0071] 1.最适血清的确定（图3)，金鱼心脏细胞系在特级胎牛血清20 %的M199培养基 中，增长繁殖最好。
[0072] 2.最适温度的确定（图4)，金鱼心脏细胞系在25°C生长，繁殖最好。
[0073] 实施例4金鱼心脏细胞系的生长曲线
[0074] -、试剂
[0075] 胰酶消化液：磷酸氢二钠2. 3g，磷酸二氢钾0· lg，氯化钠8. 0g，氯化钾0· 2g，EDTA 〇· 2g，胰酶 0· 6g，水 1000ml。
[0076] 培养基：20%的特级胎牛血清（FBS)的M199培养基。
[0077] 二、实验方法
[0078] 取对数生长期的细胞，收集计数细胞，使用含20 % FBS的M199培养，调整细胞浓度 为1. 5 X ΙΟ%!/1，按lmL/孔的量接种至24孔板中，置培养箱中25°C培养。每天取3个孔细 胞，胰酶消化消化制成细胞悬液，混匀后用细胞计数仪进行计数，实验重复3次，连续进行 7d，以培养时间（d)为横坐标，细胞浓度（细胞/mL)为纵坐标，绘制生长曲线。
[0079] 三、实验结果
[0080] 金鱼心脏细胞系对数生长期在第l-4d，当4d时进入到平稳期（图5)。
[0081] 实施例5金鱼心脏细胞系的初步应用
[0082] -、试剂
[0083] 胰酶消化液：磷酸氢二钠2. 3g，磷酸二氢钾0· lg，氯化钠8. 0g，氯化钾0· 2g，EDTA 〇· 2g，胰酶 0· 6g，水 1000ml。
[0084] 培养基：20%的特级胎牛血清（FBS)的M199培养基。
[0085] 由 ATCC 购买传染性膜脏坏死病毒（infectious pancreatic necrosis virus， IPNV，ATCC VR-877)。
[0086] 二、实验方法
[0087] 对金鱼心脏细胞系用胰酶消化液进行消化，含有20 %的特级胎牛血清（FBS)的 M199培养基1:1传代，25°C培养箱中培养。细胞增殖在24h内接入传染性胰脏坏死病毒，置 于16°C培养箱中，每天观察变化。
[0088] 三、实验结果
[0089] 细胞内出现明显的细胞病变，说明金鱼心脏细胞系能够增殖病毒传染性胰脏坏死 病毒，见图6。
[0090] 显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对 本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可 以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发 明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
【权利要求】
1. 一种金鱼心脏细胞系GH，其保藏编号为CGMCC No. 9334。
2. 根据权利要求1所述的金鱼心脏细胞系GH，其特征在于，所述细胞系具有以下生物 学特性： (1) 细胞呈现典型的上皮细胞形态，连续传代培养50代仍保持该形态特点； (2) 细胞具有较强的增殖能力，连续培养50代仍保持该增殖和生长特性。
3. -种权利要求1所述的金鱼心脏细胞系GH的制备方法，其特征在于，该方法包括以 下步骤： (1) 取金鱼一条，用医用酒精浸泡l_5min，于无菌条件下剪取金鱼的心脏，放于浓度为 1000u/ml的青霉素-链霉素双抗溶液中； (2) 用解剖刀切割成小块，胰酶消化液消化5min，用培养基重悬，离心，弃掉上清液，再 用培养基进行重悬，离心，弃掉上清，最后加入培养基，重悬混匀； (3) 将步骤（2)制备的重悬混匀液加入到细胞培养瓶中，25°C培养箱中培养； (4) 待细胞铺板到1/3的时候，更换新鲜的培养基一次； (5) 待细胞铺满板子，用胰酶消化液进行初步消化后，加入新的培养基进行培养； (6) 传代3次后，冻存，复苏后能够继续稳定增殖生长，该细胞系命名为GH。
4. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述培养基为含有浓度为lOOu/ml青 霉素-链霉素双抗溶液和20 %特级胎牛血清的M199培养基。
5. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述胰酶消化液的配制：磷酸氢二钠 2. 3g，磷酸二氢钾 0. lg，氯化钠 8. 0g，氯化钾 0. 2g，EDTA 0. 2g，胰酶 0. 6g，水 1000ml。
6. 权利要求1所述的金鱼心脏细胞系GH作为研究水产动物病毒宿主细胞的应用。
7. 权利要求1所述的金鱼心脏细胞系GH在水产动物病毒分离中的应用。
【文档编号】C12N7/00GK104152399SQ201410395208
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月12日 优先权日:2014年8月12日
【发明者】景宏丽, 张旻, 王娜, 高隆英, 张利峰, 林祥梅, 吴绍强, 王树云, 江育林 申请人:中国检验检疫科学研究院