一种1-氰基环己基乙酸的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种1-氰基环己基乙酸的制备方法，首先采用微生物转化的方法对底物1-氰基环己基乙腈进行催化，然后采用分步分离的方法对转化液进行分离纯化，最终获得了蛋白残留100PPM以下，收率在85％以上，纯度达到98％的产物，很好的解决了后续加氢反应生成加巴喷丁时由于蛋白浓度过高对催化剂产生毒害作用的问题，也提高了加巴喷丁的产量。
【专利说明】一种1-氰基环己基乙酸的制备方法 (一）
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种1-氰基环己基乙酸的制备方法，特别涉及利用含重组腈水解酶 的工程菌生物转化制备1-氰基环己基乙酸的方法。 (二）
【背景技术】
[0002] 1-氰基环己基乙酸（1-cyanocyclohexaneaceticacid)是制备抗癫痫药物加巴 喷丁的重要中间体。
[0003]加巴喷丁（gabapentin)，化学名称为1-氨甲基-1-环己基乙酸，别名为卡巴番定、 迭力。其结构与氨基丁酸（GABA)类似，主要用于治疗癫痫及多种神经性疼痛，是一种新 型的抗癫痫药物。常温下，加巴喷丁为白色或类白色结晶性粉末，无味。分子式为：C9H17N02。 相对分子质量为171. 24,易溶于水，微溶于乙醇，不溶于乙醚。
[0004]加巴喷丁的分子结构比较简单，既有氨基又有羧基，易脱水形成五元环的螺环内 酯，也是六元环的同一碳原子上带有两个取代基。所以，大部分研究者都以六元环化合物为 起始原料。当前工业合成加巴喷丁主要通过化学方法以环己酮、环己基甲醛、亚甲基环己烷 等为原料经过一系列的环化、脱羧、重排、水解等反应最终制得。但是现有路线有很多的问 题：（1)反应条件苛刻，需在强酸、强碱条件下反应；（2)所用原料毒性较大，操作危险，运输 困难，易污染环境；(3)反应时间长，费时费力；(4)反应收率低，影响经济效益。所以现使用 一条化学酶法合成加巴喷丁的路线。
[0005]加巴喷丁的化学酶法合成路线，是以环己酮为原料，首先制得1-氰基环己基乙 腈，然后再以腈水解酶催化生成1-氰基环己基乙酸，最后通过催化加氢得到加巴喷丁。整 个过程操作方便、对环境友好而且收率高。而1-氰基环己基乙酸是腈水解酶法制取加巴喷 丁过程中最关键的中间体。
[0006]化学酶法具有收率高，纯度高，副产物少，易操作和环境友好等优点，是一种较为 有效的廉价生产的方法。加巴喷丁化学酶法合成路线的关键，是腈水解酶催化1-氰基环己 基乙腈生成1-氰基环己基乙酸，催化完成的生物转化液中含有大量菌体，以及一些细胞破 裂后流出的细胞液，蛋白质，糖类等杂质。如需进行下一步反应，需先将生物转化液中的大 量蛋白质等杂质除去。
[0007]现有对1-氰基环己基乙酸的分离提取的技术，还未见其文献报道。一般对有机羧 酸的提取是通过有机溶剂的萃取，或者膜过滤装置，或者离子交换层析。 (三）
【发明内容】
[0008]本发明目的是提供一种1-氰基环己基乙酸的分离提取方法，可以快速、有效地将 生物转化液中的蛋白质等杂质去除，并且拥有较高的收率，便于其进行下一步加氢反应。
[0009]本发明采用的技术方案是：
[0010] 本发明提供一种1-氰基环己基乙酸的制备方法，所述方法为：（1)生物转化：以腈 水解酶为催化剂，以1-氰基环己基乙腈为底物，以pH值为7. 0的缓冲液（优选PBS缓冲液） 或去离子水为反应介质，在35°C进行转化反应，反应结束后,获得转化液；（2)分离纯化：① 将步骤（1)获得的转化液调pH值至7. 3?8. 0,离心，获得上清液和沉淀；②取上清液加入 聚合硫酸铁，搅拌絮凝，抽滤，获得滤液a和滤饼a;③向滤液a中加入活性炭，搅拌除色（优 选60°C搅拌30min)，抽滤，获得滤液c和滤饼c;所述活性炭的质量加入量以滤液a体积计 为0. 001?0. 01g/ml;④将滤液c调节pH值为2. 0?2. 5,静置沉淀，抽滤，获得滤饼e和 滤液e，将滤饼e干燥，获得1-氰基环己基乙酸。
【权利要求】
1. 一种1-氰基环己基乙酸的制备方法，其特征在于所述方法为：（1)生物转化：以腈 水解酶为催化剂，以1-氰基环己基乙腈为底物，以pH值为7. 0的缓冲液或去离子水为反应 介质，在35°C进行转化反应，反应结束后，获得转化液；(2)分离纯化：①将步骤（1)获得的 转化液调pH值至7. 3?8. 0,离心，获得上清液和沉淀；②取上清液加入聚合硫酸铁，搅拌 絮凝，抽滤，获得滤液a和滤饼a ;③向滤液a中加入活性炭，搅拌除色，抽滤，获得滤液c和 滤饼c ;④将滤液c调节pH值为2. 0?2. 5,静置沉淀，抽滤，获得滤饼e和滤液e，将滤饼e 干燥，获得1-氰基环己基乙酸。
2. 如权利要求1所述1-氰基环己基乙酸的制备方法，其特征在于所述催化剂的质量浓 度为2. 5?50g/L反应介质，底物的初始浓度为lmol/L反应介质。
3. 如权利要求1所述1-氰基环己基乙酸的制备方法，其特征在于所述步骤②具体为： 取上清液加入终浓度3?5g/L聚合硫酸铁，在20?30°C、200rpm条件下搅拌l-10min，然 后再在30°C、50rpm条件下搅拌5-30min，4°C下静置沉降20-60min，抽滤，获得滤液a和滤 饼a。
4. 如权利要求1所述1-氰基环己基乙酸的制备方法，其特征在于所述腈水解酶为含 腈水解酶突变体的工程菌经发酵培养获得的湿菌体，所述含腈水解酶突变体的工程菌按如 下方法获得：（1)以敏捷食酸菌（Acidovorax facilis)ZJB09122基因组DNA为模板，以序 列1和序列2为引物，通过PCR方法获得含重组腈水解酶基因的克隆载体；然后再以含重 组腈水解酶基因的克隆载体为模板，以序列3和序列4为引物，使用高保真的DNA聚合酶扩 增目标腈水解酶基因，运用酶切连接的方法，构建了含重组腈水解酶基因的表达载体；序列 1 :5, -ATGGTTTCGTATAACAGCAAG-3，，序列 2 :5, -CTACTTTGCTGGGACCGG-3，， 序列 3 :5'-AATGGATCCATGGTTTCGTATAACAGCAAG-3' 序列 4 :5' -AGGGTCGACCTACTTTGCTG GGACCGG-3,； (2)以步骤（1)构建的含重组腈水解酶基因的表达载体为模版，以序列5和序列6为引 物，根据Quikchange定点突变方法，扩增得到含重组腈水解酶突变体的表达载体，并将突 变表达载体转化至宿主菌，得到含腈水解酶突变体的工程菌； 序列 5 :5' -GAGCACGTTCAGCCGCTGTCCAAAT-3，； 序列 6 :5' -CGGCTGAACGTGCTCCCAGCAGTTC-3'。
5. 如权利要求1所述1-氰基环己基乙酸的制备方法，其特征在于所述聚合硫酸铁的加 入量为3?5g/L。
6. 如权利要求1所述1-氰基环己基乙酸的制备方法，其特征在于所述③中将滤饼a用 蒸馏水洗涤，抽滤，获得滤饼b和滤液b，将滤液b和滤液a合并后加入活性炭；所述活性炭 的质量加入量以滤液a和滤液b总体积计为0. 001?0. 01g/ml。
7. 如权利要求1所述1-氰基环己基乙酸的制备方法，其特征在于所述④中将滤饼c用 蒸馏水洗涤，抽滤，获得滤饼d和滤液d，合并滤液c和滤液d并调节pH值为2. 0?2. 5。
8. 如权利要求4所述1-氰基环己基乙酸的制备方法，其特征在于所述湿菌体按如下步 骤制备： (1)斜面培养 将含腈水解酶的工程菌或含腈水解酶突变体的工程菌接种至斜面培养基，30°C培养 24h，获得菌体斜面；斜面培养基终浓度组成为：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L， 琼脂30g/L，溶剂为去离子水，pH值自然； (2) 种子培养 从菌体斜面挑取一接种环菌体接种至种子培养基，37°C培养10h，获得种子液；种子培 养基终浓度组成为：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，卡纳霉素50mg/L，溶剂为去 离子水，pH值自然； (3) 发酵培养 将步骤（2)获得的种子液以体积浓度2%的接种量接种至发酵罐，37°C发酵培养4h后， 降温至30°C，添加终浓度10g/L乳糖进行诱导，诱导培养至0D值达到25-40,停止发酵，发 酵过程中pH维持在6. 5,取发酵液离心，得到湿菌体；发酵培养基每3L组成为：蛋白胨45g、 酵母粉36g、NaC130g、甘油36g、磷酸二氢钾4. 08g、磷酸氢二钾6. 84g、硫酸镁1. 125g、硫酸 铵15g，溶剂为去离子水，pH值为6. 5。
9. 如权利要求1所述1-氰基环己基乙酸的制备方法，其特征在于步骤（2)分离纯化方 法为：①将步骤（1)获得的转化液调pH值至7. 3?8. 0,离心，获得上清液和沉淀；②取上 清液加入无水乙醇，在20?30°C、200rpm条件下搅拌lh，抽滤，获得滤液A和滤饼A ;将滤 液A在35°C减压浓缩至无液体流出，获得浓缩液；③使用去离子水将浓缩液定容至浓缩前 体积，再加入活性炭，60°C搅拌30min，抽滤，获得滤液B和滤饼B，将滤饼B用蒸馏水洗涤， 抽滤，获得滤饼C和滤液C ;所述活性炭的质量加入量以定容后浓缩液体积计为0. 001? 0. 01g/ml ;④合并滤液B和滤液C并调节pH值为2. 0?2. 5, 20?30°C静置沉淀，抽滤，获 得滤饼D和滤液D，将滤饼D干燥，获得1-氰基环己基乙酸。
10. 如权利要求9所述1-氰基环己基乙酸的制备方法，其特征在于无水乙醇体积加入 量是上清液体积的1. 5-4倍。
【文档编号】C12P13/00GK104342463SQ201410395025
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2014年8月12日 优先权日:2014年8月12日
【发明者】郑裕国, 薛亚平, 柳志强, 苏新瑞, 黄有明, 翁建峰, 王应鹏, 贾东旭 申请人:浙江工业大学