工程菌及其在制备(r)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物制药领域，尤其设及工程菌及其在制备佩-6-氯基-5-哲 基-3-幾基己酸叔了醋中的应用。
【背景技术】
[0002] 他汀类药物是一类哲甲基戊二酷辅酶A(HMG-CoA)还原酶的竞争性抑制剂药物， 是目前临床上应用较广泛的降血脂药物。HMG-CoA还原酶催化HMG-CoA还原成3-甲基-3， 5-二哲基戊酸的反应是胆固醇的生物合成途径，他汀类药物通过抑制HMG-CoA还原酶的 合成，来抑制体内胆固醇的合成，降低低密度脂蛋白胆固醇（LDkC)水平，对W胆固醇升 高为主的高血脂症和冠屯、病有较好的疗效。在结构上，他汀类药物通常由憎水性的刚性 平面结构母核和具有双手性中屯、的（3R，5S/R)-双哲基己酸醋组成。其中，阿托伐他汀 (Atorvastatin)和瑞舒伐他汀（Rosuvastatin)是全新第S代、全合成、高纯化、高选择性 的HMG-CoA还原酶抑制剂，多年来占据降血脂药物的主要市场份额。（3R，5R) -6-氯基-3， 5-二哲基己酸叔了醋是合成阿托伐他汀的关键手性中间体，其可W通过已经建立了一个 手性中屯、的（S)-6-氯-5-哲基-3-幾基己酸叔了醋脱面上氯基得到（时-6-氯基-5-哲 基-3-幾基己酸叔了醋，再通过幾基还原酶的作用得到。因此，开展对（(时-6-氯基-5-哲 基-3-幾基己酸叔了醋的合成改进，阿托伐他汀类药物的制备方法研究均具有十分重要的 作用。
[000引 目前，报道的制备佩-6-氯基-5-哲基-3-幾基己酸叔了醋的方法主要有；种， 两种为化学酶法，其中之一是由美国Codexis公司开发出来，先采用两步=酶[游离酶]全 生物催化法合成4-氯基-3-哲基了酸己醋，另外一种是膳水解酶不对称水解4-氯基-3-哲 基了酸锭得到4-氯基-3-哲基了酸己醋，由法国的Diversa Co巧oration研发，两者都是再 通过克莱森反应与醋酸叔了醋缩合加长碳链来合成（时-6-氯基-5-哲基-3-幾基己酸叔 了醋，该过程中需要裡催化剂和无水无氧反应，反应条件较为苛刻，无法大面积推广生产； 另一种是一步化学法，W (S) -6-氯-5-哲基-3-幾基己酸叔了醋为底物，与化CN在碱性条 件下反应生成（时-6-氯基-5-哲基-3-幾基己酸叔了醋，但底物和产物在强碱性的反应 条件下通常是不稳定的。因此，与化学法相比，生物法反应更温和，费用相对低，过程更绿色 化，区域和立体选择性好，更值得深入研究。
[0004]
【主权项】
1. 一种工程菌，包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基因，其特征在于，所述目的基因 为碱基序列如SEQ ID NO. 3所示的卤代醇脱卤酶基因。
2. 如权利要求1所述的工程菌在以（S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物制 备（R) -6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯中的应用。
3. -种（R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的制备方法，其特征在于，包括： (1) 制备包含碱基序列如SEQ ID No. 3所示的卤代醇脱卤酶基因的工程菌； (2) 制备所述工程菌的静息细胞悬液； (3) 将静息细胞悬液与底物（R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯、氰化物混合，反 应制得（R)_6_氛基-5-羟基-3-幾基己酸叔丁醋。
4. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述反应的温度为18~40°C，反应液 的pH值为7.0~9.0。
5. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述静息细胞悬液的制备方法包括：将 所述工程菌活化后，扩大培养至〇D_达到0. 6~1. 2,加入诱导剂，继续培养，离心收集细 胞，用缓冲液重悬，获得静息细胞悬液。
6. 如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述诱导剂为IPTG ;诱导剂的浓度为 0? 1 ~0? 5mM〇
7. 如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲液为HEPES缓冲液。
8. 如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲液在反应液中的浓度为1~ 100mM〇
9. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述氰化物为NaCN。
【专利摘要】本发明公开了一种工程菌及其在制备(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯中的应用，该工程菌包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基因，所述目的基因为碱基序列如SEQ ID N 0.3所示的卤代醇脱卤酶基因。本发明将SEQ ID N 0.3所示的卤代醇脱卤酶基因导入宿主细胞构建的工程菌可表达卤代醇脱卤酶HHDH，通过该酶的催化作用可实现将(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯催化成(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯。该反应条件温和，操作简便，提高了产物的转化率和纯度。
【IPC分类】C12N1-21, C12P13-00, C12N15-60, C12R1-19
【公开号】CN104673733
【申请号】CN201510067574
【发明人】杨立荣, 王金玉, 陈少云, 吴坚平, 徐刚
【申请人】浙江大学
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2015年2月10日