一株*降解菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于受污染±壤与水的生物降解处理技术领域，特别设及一株窟降解菌。
【背景技术】
[000引 多环芳姪（Polycyclic Aromatic Hy化ocarbons，PAHs)是一类含有两个或两个 W上苯环，W线状、角状或簇状排列的稠环型化合物，具有疏水性、低溶解度、低蒸汽压、高 烙点和沸点、辛醇-水分配系数高等特性。多环芳姪类化合物具有强烈的致癌作用、致崎 作用和致突变作用，一般来说，2~3环的低分子量PAHs具有显著的急性毒性，而某些高 分子量的PAHs具有潜在的致癌性。由于PAHs分子中存在共辆大JT键电子体系，因此具 有较高的稳定性，其光解作用和生物降解作用缓慢，能够通过各种环境介质长距离迁移并 长期存在于环境中，通过环境蓄积、生物蓄积、生物转化或化学反应等方式损害健康和环 境，已引起各国环境科学家的高度重视。美国环保局早在80年代就已把16种未带分支 的PAHs确定为环境中的优先污染物，我国也把PAHs列入环境污染的黑名单中。生物降解 是实现恢复PAHs污染环境的最有效手段之一，常见的具有降解PAHs功能微生物有假单胞 菌属（Pseudomonas)、銷氨醇单胞菌属（S地ingomonas)、红球菌属（Miodococcus)、分枝杆 菌属（Mycobacterium)、芽抱杆菌属炬acillus)、黄杆菌属（Flavobacterium)、气单胞菌 属（Aeromonas)、拜叶林克氏菌属炬eijernckia)、椿状杆菌属（Corynebaeterium)、藍细菌 (切anobacteria)、微球菌属（Micrococ州S)、诺卡氏菌属（Nocardia)和弧菌属（Vibrio) 等。
[0003] 然而由于缺少高效的多环芳姪降解菌，制约了多环芳姪污染±壤生物修复技术的 进一步发展和应用。因此，需要从污染的环境中驯化筛选出对多环芳姪降解速率较快的微 生物菌种，然后再把它们应用于实际PAHs污染环境的生物治理，该对于治理和修复多环芳 姪污染±壤有重要的意义。
【发明内容】
[0004] 本发明提供一株窟降解菌。所用菌株经鉴定为人苍白杆菌Oc虹obactrum ant虹opi DWL2013年12月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 屯、，该中屯、位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为 CGMCC No. 8621。将该菌株制成含菌量为1.25X 108C即/ml的菌悬液，可用于环境中庸的降 解。
[0005] 从污染±壤中分离纯化所述窟降解菌的步骤如下：
[0006] (1)选取受石油污染的上壤，将其通过直径为2mm的网筛后立即放置于4°C冰箱中 保存备用。
[0007] (2)向体积为1000血的开口玻璃瓶中加入25~30血浓度为Ig/L的盧的丙酬混 合溶液，为除去丙酬将玻璃瓶开口放置2天。
[0008] (3)向步骤（2)中开口玻璃瓶中加入500~600血基础培养基，在转速为l(K)r/min 的条件下揽拌40~50min后加入步骤（1)中的±壤250g ;然后置于温度为25~30°C的 环境中在转速为l(K)r/min的条件下揽拌富集驯化培养30d，在培养期间定期向玻璃瓶中加 入基础培养基W维持玻璃瓶中泥浆系统的水上比例保持不变；其中基础培养基的组成为： N&Cl ;1. 5g ? [1，脚2口04;1. 5g ? L-i，MgCl2;0. 25g ? 1-1，CaCls ? 2&0 ;0. lOg ? [1。
[0009] (4)向体积为100~200血的锥形瓶中加入10血浓度为Ig/L的窟的丙酬混合溶 液，为除去丙酬将锥形瓶开口放置2天。
[0010] (5)向步骤（4)中的锥形瓶中入50mL基础培养基、0. 5mL微量金属液和0.1 mL维 生素C溶液；其中微量金属液的组成为；C0CI2 ? 6&0 ;35mg ? [1，01化;0. 20mg ? 1-1，邮03; 6. Omg ? [1，MnCl] ? 4&0 ;25mg ? [1，Na2Mo04 ? 2馬0 ;3. Omg ? [1，NiCl] ? 2&0 ;2. Omg ? [1， ZnCl2:2. 5mg ? L -1。
[0011] (6)向步骤巧）中的锥形瓶内接入步骤（3)驯化的±壤0.25肖，然后置于温度为 25~30°C转速为10化/min的振荡器中培养5~7天，每天打开瓶口一次队陕复锥形瓶内 的溶解氧；按接种体积比为200~250 : 1的比例转入另一按步骤（4)至（5)处理后的锥 形瓶内，当转接次数大于8之后即可获得高效去除窟的好氧降解菌群。
[001引 （7)向体积为500血的锥形瓶内加入400血基础培养基、1. 0血微量金属液、0. 1血 维生素C溶液，摇匀后作为液体培养基备用。
[0013] (8)向体积为150血的锥形瓶内加入50血按步骤（7)配制的液体培养基和0. 60g 琼脂，然后在温度为121°C的高压锅中灭菌20分钟，在室温下冷却至65~70°C时，在超净 工作台中将其倒入体积为160mL的培养皿中，为除去培养基表面多余的水分将该培养皿在 超净工作台中放置2天。
[0014] (9)在超净工作台中向步骤（8)中的培养皿中加入0. 5mL浓度为Ig/L的窟丙酬溶 液，来回倾斜转动培养皿使鹿的丙酬溶液均匀分布，为除去培养基表面的丙酬将该培养皿 在超净工作台中放置2天。
[0015] (10)向体积为25血的锥形瓶内加入10血按步骤（7)配制的液体培养基和0. 25g 琼脂，在温度为12rc的高压锅中灭菌20分钟，在超净工作台中冷却至38~40°C。
[0016] (11)在超净工作台中向步骤（10)的锥形瓶中加入ImL步骤做得到的窟好氧降 解菌群溶液，摇匀后吸取ImL慢慢加入步骤（9)中的培养皿中，来回倾斜转动培养皿使接种 有混合菌群的培养基溶液均匀分布。将培养皿放入温度为25°C的培养箱中培养观察，10~ 15天后便可发现有明显的菌落出现。
[0017] (12)在超净工作台中挑取步骤（11)培养皿中的菌落，进行重复分离，分离纯化8 个周期W上即可得到能够高效降解窟的纯菌种。
[0018] 运用上述方法能够分离纯化到对窟降解性能好的微生物菌种。
【具体实施方式】
[0019] 向加入窟和基础培养基的开口玻璃瓶内加入受石油污染的±壤进斤窟降解微生 物的富集与驯化，30d后向加入窟、基础培养基、微量金属液、维生素C溶液及吸附剂的锥形 瓶内接入富集驯化的上壤。在温度为25~30°C、转速为l(K)r/min的振荡器中培养5~7 天后，进行循环转接，在循环次数大于8次后即可得到高效去除窟的降解菌群。在超净工作 台中制作w窟为唯一碳源和能源的琼脂固体培养基底层平板，在底层平板上制作含有窟降 解菌群的琼脂固体培养基顶层平板，将制作好的培养基平板在培养箱中培养10~15天。 在超净工作台中向加入趙、基础培养基、微量金属液、维生素C溶液及吸附剂的锥形瓶内接 入培养基平板中的菌落，在温度为25~30°C、转速为l(K)r/min的振荡器中培养5~7天。 然后进行循环转接，在循环次数大于8次后即可得到能够降解窟的纯菌种。
[0020] 运用分离纯化得到的降解蔚的菌种人苍白杆菌Oc虹obactrum ant虹opi DW1制 成菌悬液，含菌量为1.25Xl〇sCFU/ml，进行降解窟的降解试验。结果表明菌株人苍白杆菌 Oc虹obactrum ant虹opi DW1能够对趙进行有效的降解，当窟的初始浓度为0. 14mg/L时，7 天后的降解去除率为56. 2%。
【主权项】
1. 一株对窟具有降解功能的菌株，其特征在于，所述菌株经鉴定为人苍白杆菌 Ochrobactrum anthropi DW1，其菌种保藏号为 CGMCC No. 8621〇
【专利摘要】本发明公开了属于生物降解处理技术领域的一株对具有降解功能的菌株。降解菌经鉴定为人苍白杆菌Ochrobactrum anthropi DW1，菌种保藏号为CGMCC No.8621。将该菌株制成含菌量为1.25×108CFU/ml的菌悬液，对初始浓度为0.14mg/L的在7天后的降解去除率为56.2％。CGMCC No.862120131220
【IPC分类】C12R1-01, B09C1-10, C12N1-20
【公开号】CN104673725
【申请号】CN201510097223
【发明人】朱宜, 秦伟, 谢恩, 郑蕾, 丁爱中, 豆俊峰
【申请人】北京师范大学
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2015年3月5日