一种用于防治葡萄霜霉病的巨大芽孢杆菌及其悬浮剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，特别是设及一种用于防治葡萄霜霉病的巨大芽抱杆菌 及其悬浮剂。
【背景技术】
[0002] 葡萄霜霉病是一种世界性病害，是葡萄最主要的病害之一，一般在5~6月开始发 生，8~9月进入发病盛期，主要为害叶片，严重影响叶片的光合作用，严重时常造成叶片焦 枯早落，影响果实品质及产量，致减产30 %~50 %，重者达80 % W上。该病菌属鞭毛菌亚 n，菌丝体在寄主细胞间蔓延，W球状吸器伸入寄主细胞吸收养料。葡萄霜霉病主要危害植 物的叶片、新梢、卷须等组织；发病严重时，果实产量降低、品质变劣。防治葡萄霜霉病的方 法有抗病育种，化学防治和生态防治（控制温湿）等。由于抗病育种周期长且抗性易丧失； 化学防治存在易产生抗药性和对人、环境污染的问题；而生态防治的控制温湿需要葡萄秩 苗苗龄、长势和天气情况都合适的情况下才能进行，应用受条件限制。近年来，生物防治技 术由于具有防止对象针对性强，防效高；对人、畜安全，没有环境污染等优点而日益受到重 视。
[0003] 生物防治葡萄霜霉病的方法主要包括植物提取物防治、植物抗病性诱导和利用生 防菌。目前，已有十余种植物提取物能够有效防治葡萄霜霉病。但是，植物提取物的提取过 程繁琐、生产成本高和人工合成单一物质的使用后病原菌易产生抗药性等缺点，使得该方 法难于应用。因此，利用生防菌防治葡萄霜霉病可弥补W上不足。
[0004] 目前，利用生防菌防治葡萄霜霉病研究中，已有利用细菌中的苍白杆菌、枯草芽抱 杆菌、短小芽抱杆菌、W及放线菌中的利迪链霉菌等括抗微生物的报道（臧超群，赵奎华， 等。生防细菌SY286的筛选及其对葡萄霜霉病的防治效果研究[J]。中国生物防治学报， 2014,30(3) ;402-407)。未见利用巨大芽抱杆菌防治该病的报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的就是针对上述存在的缺陷而提供一种用于防治葡萄霜霉病的巨大 芽抱杆菌，用于葡萄霜霉病的巨大芽抱杆菌炬acillus megaterium)的菌株BMJBN02,已 于2015年1月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、，保藏编号为 CGMCC NO. 10478。本发明还公开了利用上述菌株生产的微生物菌剂及其制备方法。本发明 菌株BMJBN02对葡萄霜霉病特异性强，且防效高，平均防效在70% W上。
[0006] 本发明的一种用于防治葡萄霜霉病的巨大芽抱杆菌及其悬浮剂技术方案为，一种 用于防治葡萄霜霉病的巨大芽抱杆菌，于山东省寿光韭菜田±壤中分离所得，巨大芽抱杆 菌Bacillus megaterium BMJBN02,于2015年1月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中屯、，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编；100101，保藏编号 为CGMCC NO. 10478,菌种的拉了文名称是Bacillus megaterium。具有使霜霉病抱子囊变 形的作用。
[0007] 该菌为革兰氏阳性菌，杆状，末端圆，呈长链状排列。。能运动。芽抱楠圆形，中生 或次生。可液化明胶、腺化牛奶、水解淀粉、使霜霉病抱子囊变形。
[000引所述的一种用于防治葡萄霜霉病的巨大芽抱杆菌的悬浮剂，将巨大芽抱杆菌 Bacillus megaterium BMJBN02发酵得到的发酵液与表面活性剂、防腐剂、悬浮助剂和增稠 剂混合制备悬浮剂。
[0009] 所述的一种用于防治葡萄霜霉病的巨大芽抱杆菌的悬浮剂，由W下步骤制得：
[0010] (1)种子液的获得：将生防菌BMJBN02接种到液体LB培养基，30°C，20化pm振荡培 养12~18小时，取样测定600nm处的OD值，测定过程中W未接种的液体LB培养基调零；
[0011] (2)发酵液的获得；当步骤（1)中OD值为0. 5~0. 8时，将种子液按1:150体积 比加入装有发酵培养基的发酵罐培养得到发酵液；
[0012] (3)巨大芽抱杆菌BMJBN02悬浮剂的制备：将制备的BMJBN02菌的发酵液与表面 活性剂、防腐剂、悬浮助剂和增稠剂混合制备悬浮剂。
[001引 步骤（1)中液体LB培养基配方；1%化Cl，l%蛋白腺，0.5%酵母粉，抑7.0~7. 5。 [0014] 步骤（2)中培养条件为：培养温度30°C，转速22化/min,发酵时间为36~4她， 发酵液PH维持在7. 0,溶氧量30%，通气量7~9mV小时，罐压0. 05~0.化Pa，产抱率为 88 %，活菌计数5. 33 X 10化即? m。。
[00巧]步骤似中发酵培养基配方；玉米粉2%，豆稍粉1%，酵母粉0.3%，CaCl2〇. 1%， M拆〇4 " 7H 2〇 0. 05 %，K2HPO4 " 3H 2〇 0. 3 %，KH2PO4O. 2 %，pH7. 0 ~7. 5。
[0016] 步骤做中悬浮助剂是硫酸锭，防腐剂是甘氨酸，表面活性剂是有机娃抓-3077， 增稠剂是黄原胶。
[0017] 步骤做中，在BMJBN02菌的发酵液中，按质量百分比加入硫酸锭6%~8%，甘氨 酸2%~5%，BD-30770. 05%~0. 1%，黄原胶0. 2%~0. 3%制得，所得悬浮剂中BMJBN02 活菌计数5X 109c化? ml/i，W上各组份的用量均W BMJBN02菌的发酵液的质量为基数。
[001引步骤（3)中，先将硫酸锭揽拌下加入BMJBN02菌的发酵液中，待硫酸锭全部溶解 后，在揽拌下依次加入防腐剂甘氨酸、表面活性剂BD-3077、增稠剂黄原胶，揽拌均匀即可。。
[0019] 本发明的有益效果为：本发明是专口针对危害葡萄叶部和果实的霜霉病的生防制 剂。由于是生物制剂，完全不存在因化学制剂使用带来的一系列问题，因此有利于温室大 棚蔬菜的无公害生产，不但为农民节省了开支，并且提高了蔬菜生产的质量，有利于出口创 收。
[0020] 温室实验表明；该菌制剂能够显著降低葡萄霜霉病的发生。该菌剂可W稀释500 倍在葡萄旺长期对其喷雾，对葡萄霜霉病的抑制率可达到70% W上。
[0021] 本发明优选表面活性剂抓-3077。在实际应用中抓-3077的主链十分柔顺，其分子 间的作用力比碳氨化合物要弱得多，即与同分子量的碳氨化合物相比，其粘度低，表面张力 弱，表面能小，成膜能力强。因此，BD-3077的低表面张力和低表面能为其带来疏水、消泡、 泡沫稳定、防粘、润滑、上光等各项优异性能；同时，BD-3077还兼具了表面活性剂和增效剂 的作用。
【附图说明】：
[0022] 图1所示为实施例3中抑制病原抱子囊萌发试验水对照实验；
[0023] 图2所示为实施例3中抑制病原抱子囊萌发试验波尔多液处理实验；
[0024] 图3所示为实施例3中抑制病原抱子囊萌发试验本发明的巨大芽抱杆菌BMJBN02 处理实验。
【具体实施方式】：
[0025] 为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本 发明并不局限于此。
[0026] 实施例1 [0027] 菌株分离及鉴定
[002引 1、本发明设及一种防治葡萄霜霉病的生防菌株BMJBN02,该菌株分离于山东省寿 光市韭菜田±壤。菌种保藏号为CGMCCNO. 10478
[0029] 2、菌株鉴定
[0030] 采用采用生理生化特征测定和leSrDNA序列比对分析结合的方法将该菌株鉴定 为巨大芽抱杆菌炬acillus thuringiensis)，命名为BMJBN02。同时，将分离纯化的单菌 落同时进行V. P试验、菌膜形成试验、卵