一株长链烷烃降解菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于环境污染物生物处理技术领域。具体涉及一株长链烷烃降解菌及其应 用。
【背景技术】
[0002] 随着经济的发展，冶金生产中用冷却、乳化、防腐、抗磨和清洁的长链烷烃类精细 化学品的需求日益增多，广泛的使用导致了冶金废水中存在长链烷烃物质，这类物质由于 化学性质稳定、疏水性强，使生物可利用性差，很难自然降解，是严重持续破坏生态环境的 有机污染物之一。如，焦化废水经生化处理后还含有大量的长链烷烃，而导致水质达不到工 业再生水的标准。因此，研究有效去除长链烷烃的控制方法对保持生态环境良性循环、促进 经济和社会的可持续发展具有十分重要的意义。
[0003] 工业废水中的长链烷烃类污染物治理技术主要有物理法、化学法和生物法。虽然 物理法和化学法治理长链烷烃类污染物能取得较好的效果，但造价高和易造成二次污染而 限制了实际应用。生物法治理长链烷烃类污染物具有处理效果好、成本低、操作简单、绿色、 无二次污染和应用范围广等优点而受到人们的广泛关注。
[0004] 目前，已报道的石油烃类降解微生物的细菌和真菌有100多属，细菌较多，真菌较 少。细菌中能降解石油烃的主要有：假单胞菌属、无色杆菌属、产碱杆菌属、芽孢杆菌属、 节杆菌属、微球菌属、黄杆菌属和不动杆菌属等。这些细菌对石油烷烃的降解效率有待于 提高，即不能满足烷烃降解的实际应用，特别是对不动杆菌属的菌种报道甚少。如"一种 稠油降解菌及其应用"（CN 101921722 A)专利技术，该技术的特点是得到能降解稠油的 不动杆菌，但存在对环境适应不强、降解效率低等缺点；"高效油脂降解菌及其应用"（CN 103525720 A)专利技术，该技术的特点是得到能降解油脂的不动杆菌，主要针对工业油脂 及餐饮垃圾污染物的降解，也存在可操作性差、降解效率低和菌株的适用范围受限等不足。
【发明内容】
[0005] 本发明旨在克服现有技术的不足，目的是提供一株长链烷烃降解菌，该菌种能高 效地降解工业废水中的长链烷烃组分，实现对工业废水生物强化深度再生处理。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案是： 一株长链烷烃降解菌，来源于武汉石化厂受污染的土壤，经人工富集、筛选和分离纯化 所得到。该菌株为不动杆菌（Acinetobacter sp.)C3,由中国典型培养物保藏中心（武汉大 学）保藏，保藏号为：CCTCC NO :M 2015394,保藏日期为2015年6月19日；所述不动杆菌 (Acinetobacter sp. )C3 的 16S rDNA 的 GenBank 登录号为 KR072554 ;菌株 Acinetobacter sp. C3为一株革兰氏阴性菌，菌落为规则的圆形，边缘整齐，表面光滑，菌落颜色呈白色；通 过革兰氏染色后在显微镜下呈阴性，菌体呈短杆状。
[0007] 本发明提供的菌株Acinetobacter sp. C3应用于降解焦化废水和石化废水中的 C8~C40组分，C8~C40组分得到了有效的去除；在发酵降解过程生成了一种磷脂类生物表面 活性剂。由于其具有较强的乳化作用、增溶作用、润湿和渗透作用，增加了长链烷烃的溶解 性和传递速度，从而提高了菌株Acinetobacter sp. C3对长链烷烃的降解效率。
[0008] 本发明与现有技术相比，具有以下优点： 1、本发明提供的菌株Acinetobacter sp. C3在发酵降解过程生成了一种磷脂类生物表 面活性剂，产率为3~10g/L ;该表面活性剂能将溶液的表面张力由最初的80. 03mN/m降低到 20. 79mN/m，72h 内乳化能力达 60~100%。
[0009] 2、本发明提供的菌株Acinetobacter sp. C3具有高效的降解长链烷烃能力，适用 于对不同环境、不同浓度的长链烷烃的有效降解：对浓度为500~5000mg/L的正十六烷的 降解率为85~100% ;对浓度为500~10000mg/L的柴蜡混合物的降解率为78~92% ;对冶金行 业(独立焦化厂、钢铁联合企业和新型煤化工企业等）中COD为80 ~400mg/L的废水处理 后，出水水质的COD为30~60mg/L，达到工业再生水的标准（C0D彡60mg/L);对独立焦化 厂、钢铁联合企业和新型煤化工企业的废水中长链烷烃的去除率分别为52~73%、87~93%和 88. 5~95. 2%。
[0010] 因此，本发明提供的菌株Acinetobacter sp. C3应用于焦化废水和石化废水的治 理，有良好的降解效果，实现了对工业废水生物强化深度再生处理。
【附图说明】
[0011] 图1为本发明的菌株Acinetobacter sp. C3的革兰氏染色图； 图2为图1所示菌株Acinetobacter sp. C3产生的生物表面活性剂的红外吸收光谱 图； 图3为图1所示菌株Acinetobacter sp.C3产生的生物表面活性剂临界胶束浓度的测 定图； 图4为图1所示菌株Acinetobacter sp. C3产生的生物表面活性剂乳化性能的测定 图； 图5为图1所示菌株Acinetobacter sp. C3对石油经的降解曲线图； 图6为图1所示菌株Acinetobacter sp. C3对焦化废水降解前的气质联用图； 图7为图1所示菌株Acinetobacter sp. C3对焦化废水降解后的气质联用图。
【具体实施方式】
[0012] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明进行进一步的描述，并非对其保护范围的 限制。
[0013] 实施例1 菌株Acinetobacter sp.C3的获取和鉴定。菌株Acinetobacter sp.C3的获取和鉴定 的步骤是： 步骤一、样品采集及富集培养 从武汉石化厂长期受污染土壤中采集土壤样品，把采集的土壤样品加入蒸馏水中，摇 勾，于1000 Xg离心10min，取上清，按接种量4%(v : V)接种于正十六烧浓度为500mg/L 的LB液体培养基中，在转速为125r/min和温度为35°C的恒温摇床中培养24h，得到初培养 液。
[0014] 取初培养液4mL转接于正十六烧浓度为500mg/L的无机盐培养基中，在转速为 125r/min和温度为35°C的恒温摇床中培养36h，得到培养液。
[0015] 再取培养液4mL转接于含正十六烧为唯一碳源的无机盐培养基中，转接6次，转接 过程中逐渐增大正十六烷的浓度，浓度依次为：1000mg/L、1500mg/L、2000mg/L、3000mg/L、 4000mg/L和5000mg/L ;然后在转速为125r/min和温度为35°C的恒温摇床中训化培养36h， 得终培养液。
[0016] 步骤二、分离纯化 取终培养液I mL，用无菌水将其按体积比依次梯度稀释为10 \ 10 2, 10 3, 10 4, 10 5， 10 6, 10 7和10 8的菌悬液，然后取200 μ L稀释好的各个浓度梯度的菌悬液均匀地涂布于正 十六烷浓度为l〇〇〇mg/L的固体LB平板上(每个浓度梯度做三个重复)，于35°C的恒温培养 箱中培养；待长出菌落后，挑取菌落于正十六烷浓度为l〇〇〇mg/L的固体无机盐培养基平板 上划线，倒置在35°C生化培养箱中恒温培养l~2d，挑取单菌落，采用平板划线分离法将菌 落在无机盐平板上划线纯化，重复划线4~5次，得到纯化后的单菌落。挑取所有的单菌落接 种于正十六烧浓度为l〇〇〇mg/L的无机盐培养基中，于转速为125r/min和温度为35°C的摇 床中培养48h，采用气相色谱法检测降解后无机盐培养基中正十六烷的残余浓度，确定降解 率最高的菌株，编号为C3。
[0017] 步骤三、菌株的鉴定 将菌株C3接种于LB固体培养基上，于35°C生化培养箱中恒温培养48h，菌落为规 则的圆形，边缘整齐，表面光滑，菌落颜色呈白色；通过革兰氏染色后在显微镜下呈阴性， 如图1所示菌体呈短杆状；菌株C3的16S rDNA基因序列长度为1414bp，如序列表所示， 提交到GenBank后，序列的登录号为KR072554,经NCBI Blast检索，本发明的菌株C3与 Acinetobacter sp.的相似性达99%。故，根据菌株C3的形态特征和生理生化特征及 其16S rDNA基因序列特征，确定菌株C3属于不动杆菌属（Acinetobacter sp.)，命名为 Acinetobacter sp.C3〇
[0018] 所述的LB培养基配方为：酵母浸提物5g，蛋白胨10g，氯化钠10g，蒸馏水1L。所 述富集培养基的PH值为6. 8~7. 2,在121. 3°C湿热灭菌20 min备用。
[0019] 所述的无机盐培养基配方为：硝酸铵lg，磷酸氢二钠 I. 42g，磷酸二氢钾I. 36g，七 水硫酸镁〇. 432g，氯化钙0. 006g，微量元素 lmL，蒸馏水1L。培养基的pH值为6. 8~7. 2， 在121. 3°C湿热灭菌20min。其中微量元素配方：一水硫酸锰I. 69g/L，六水氯化钴0. 24g/ L，硼酸I. 16g/L，二水钼酸钠0. 024g/L，七水硫酸亚铁2. 78g/L，七水硫酸锌I. 15g/L，五水 硫酸铜〇· 38g/L。
[0020] 所述的正十六烷是用0. 2 μπι微孔滤膜过滤后的产品。
[0021] 所述的LB固体培养基配方：在LB培养基上加入2% (w/v)的琼脂，高温湿热灭菌。
[0022] 所述的无机盐固体培养基配方：在无机盐培养基配方上加入2% (w/v)的琼脂，高 温湿热灭菌。
[0023] 实施例2 温度对菌株Acinetobacter sp.C3降解正十六烧的影响。将菌株Acinetobacter sp. C3接种至正十六烷浓度为1000mg/L的无机盐培养基中，在转速为150r/min和培养温 度分别为25 °C、30 °C、35 °C和40 °C的恒温摇床中培养48h，采用气相色谱法检测温度对菌株 Acinetobacter sp. C3降解正十六烧的影响，结果见表1。
[0024] 表1温度对菌株Acinetobacter sp. C3降解正十六烧的影响
由表1可以看出，菌株Acinetobacter sp C3在25~40°C范围内对正十六烧有一定的 降解效果，在35°C时降解效果最佳。菌株Acinetobacter sp.C3对在较高温度40°C下也有 较好的降解率，达86. 3%。
[0025] 本实施例说明菌株Acinetobacter sp C3对不同的温度环境中长链烷烃的降解性 能较好。
[0026] 实施例3 pH值对菌株Acinetobacter sp.C3降解正十六烧的影响。将菌株Acinetobacter sp. C3接种至正十六烷浓度为1000mg/L的无机盐培养基中，调pH值分别为6. 5、6. 8、7. 0、 7.