一株可降解吡啶的根瘤杆菌、选育方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株可降解吡啶的根瘤杆菌、选育方法及其应用。经鉴定为根瘤杆菌(Rhizobiumsp.)，命名为(Rhizobiumsp.)NJUST18，GenBank登陆号为JN106368，菌株已于2013年3月28日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC?NO:M?2013110。本发明直接采用以吡啶为唯一碳源和氮源的培养基进行吡啶降解菌的富集，并采用以吡啶为唯一碳源、氮源的筛选培养基进行分离，筛选过程迅速快捷，在该培养基上杂菌较少，减少了复筛的工作量。和其他吡啶降解菌株相比，该菌株具有高效的吡啶降解能力、很好的适应能力及耐受性能，在高浓度吡啶废水的处理中具有良好的应用前景。
【专利说明】一株可降解吡啶的根瘤杆菌、选育方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于环境有机污染物生物处理【技术领域】，具体涉及一株降解吡啶的细菌、选育方法及其在废水生物处理和环境污染修复中的应用。
【背景技术】
[0002]吡啶广泛应用于医药、农药、化工等行业，是一种典型的难降解含氮杂环化合物。吡啶因其杂环结构而具有较强的水溶性，很容易转移到土壤和地下水中，因而在土壤和地下水中普遍存在。由于吡啶的生物毒性、致畸变和致癌特性，吡啶污染对人类的健康和生态环境造成了巨大的潜在危害。因此，含吡啶的废水如不经过处理而直接排放，会对环境造成严重污染。
[0003]目前，国内外对吡啶废水的研究主要集中于吸附、焚烧和氧化等物理化学处理技术。然而，吸附、焚烧和氧化等物化处理技术成本普遍偏高，只适用于高浓度吡啶废水的处理，且处理后的废水吡啶含量仍大于排放标准，难以实现达标排放，尚需进一步的处理。因此，对处理效果好、处理成本小、无二次污染的吡啶污染废水的处理技术和工艺的探讨，具有理论和实际意义。
[0004]微生物处理法与物理、化学方法相比，具有经济、高效的优点，更重要的是可以实现污染的无害化治理。生物法无二次污染、处理量大，是目前应用最广的废水处理技术。但由于吡啶类物质可生化降解程度不高，普通的生物处理无法作用或效率低下。因此，对吡啶降解效率高、降解效果好的微生物的驯化、筛选和应用，是解决吡啶废水污染的有效途径。
[0005]近年来国内外研究人员已开展了一些关于吡啶降解菌的筛选工作，目前已出现一些关于生物降解吡啶的报道，然而目前已见的吡啶降解菌种类仍十分有限，主要包括 Arthrobacte, Bacillus, Lysinibacillus, Nocardiodes, Paracoccus, Pseudomonas,Rhodococcus, Shinella, Shewanella, Streptomyces 等种属。然而，至今并未出现关于根瘤杆菌(Rhizobium sp.)降解吡啶的报道。此外，目前已报道的大部分吡唳降解菌对吡唳的耐受浓度低(小于1000mg/L)，降解速率慢，难以满足实际工程应用的要求。降解效率高、对吡啶耐受浓度高、能适应真实环境的的新型、高效降解菌的筛选具有十分重要的意义。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于针对目前吡啶降解菌株对吡啶耐受浓度低、处理效率低、菌株种类较为单一等不足，提供一株可高效降解吡唳的新型菌株(Rhizobium sp.)NJUST18。
[0007]本发明的另一目的在于提供一株可高效降解吡唳的新型菌株(Rhizobium sp.)NJUST18的选育方法。
[0008]本发明还有一个目的是提供(Rhizobium sp.)NJUST18在含吡啶废水处理领域的应用。
[0009]实现本发明目的技术解决方案是:本发明从南京市六合区某化工企业长期受到吡啶污染的土壤中分离、筛选得到了吡啶特效降解菌株NJUST18，经鉴定为根瘤杆菌(Rhizobium sp.),命名为(Rhizobium sp.) NJUST18, GenBank 登陆号为 JN106368,菌株已于2013年3月28日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC N0:M2013110。该菌株为国内外第一株可用于吡啶废水处理的根瘤杆菌。
[0010]一株可高效降解吡唳的新型菌株(Rhizobium sp.)NJUST18的选育方法,包括以下步骤:
[0011](I)菌株的分离:将长期受到吡啶污染的排污口取出的土样2g加入到50mL含500mg/L吡啶的液体无机盐培养基MSM中，装入150mL三角瓶中，30°C条件下以180转/分的转速摇床培养，实现吡啶降解菌的富集培养；7天后，2mL富集培养后的液体培养基转接入50mL新鲜液体无机盐培养基MSM中，并摇床培养；经过连续3次转接后，用无菌蒸馏水将转接后的液体培养基稀释IO5-1O9倍，涂布于含1000mg/L吡啶的无机盐固体培养基平板上，放入30°C培养箱中进行培养；一周后挑取在菌落特征上有明显差异的菌落，采用平板划线分离的方法进行纯化，连续纯化三次后，得到单一菌株，并进行斜面保存。
[0012](2)菌株的筛选:挑取分离所得到的单菌落，分别接种于含1000mg/L吡啶的无机盐液体培养基中，摇床培养120h ;测定培养基中吡啶浓度变化，选取培养基中吡啶浓度显著降低的单菌落。
[0013]与现有技术相比，本发明具有以下优点:
[0014]本发明所提供的(Rhizobium sp.) NJUST18,可以以吡唳为唯一碳源、氮源进行生长。本发明直接采用以吡啶为唯一碳源和氮源的培养基进行吡啶降解菌的富集，并采用以吡啶为唯一碳源、氮源的筛选培养基进行分离，筛选过程迅速快捷，在该培养基上杂菌较少，减少了复筛的工作量。
[0015]吡啶废水的应用研究表明，筛选得到的(Rhizobium sp.)NJUST18，可在102h内实现浓度为1000mg/L的吡啶废水 的处理，吡啶和TOC的降解率分别达到100%和85%。在吡啶浓度为0-2600mg/L的范围内，(Rhizobium sp.)NJUST18可正常生长并实现吡啶的完全降解。在pH为5.0-10.0的范围内，(Rhizobium sp.)NJUST18可实现吡啶的完全降解。低浓度易降解碳源的加入可对吡啶降解起促进作用。和其他吡啶降解菌株相比，该菌株具有高效的吡啶降解能力、很好的适应能力及耐受性能，在高浓度吡啶废水的处理中具有良好的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1是本发明菌株的平板菌落图(a)和透射电镜图(b)。
[0017]图2是本发明菌株(Rhizobium sp.)NJUST18的生长曲线、对吡唳的降解曲线、降解过程中氨氮的释放和TOC的变化情况。
[0018]图3是本发明废水中吡啶浓度对菌株(Rhizobium sp.)NJUST18的生长和吡啶降解的影响。
[0019]图4是本发明废水pH对吡啶降解的影响。
[0020]图5是本发明废水中易降解碳源的存在对吡啶降解的影响。
[0021]图6 为本发明菌株(Rhizobium sp.) NJUST18 的 16SrDNA 序列表。
【具体实施方式】[0022]下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0023]实施例1:吡啶降解菌(Rhizobium sp.)NJUST18的筛选分离及其对吡啶的降解性倉泛
[0024]⑴菌株的分离
[0025]从南京市六合区某化工企业长期受到吡啶污染的排污口挖取土样，将2g 土样加入到50mL吡啶浓度为500mg/L的液体无机盐培养基(MSM)中，装入150mL三角瓶中，30°C条件下以180转/分的转速摇床培养，实现吡啶降解菌的富集培养。7天后，2mL富集培养后的培养基转接入到50mL新鲜培养基中，并摇床培养。经过连续3次转接后，用无菌蒸馏水将转接后的液体培养基稀释IO5-1O9倍，涂布于吡啶浓度为1000mg/L、以吡啶为唯一碳源和氮源的无机盐固体培养基平板上，放入30°C培养箱进行培养。一周后挑取在菌落特征上有明显差异的菌落，采用平板划线分离的方法进行纯化，连续纯化三次后，得到单一菌株，并进行斜面保存。
[0026]无机盐培养基MSM 的组成如下=Na2HPO4.12H20(1.529g/L)，KH2PO4(0.372g/L)，MgSO4.7H20(0.lg/L)，CaCl2(0.05g/L)，微量元素溶液 SL_4(10mL/L)。微量元素 SL-4 组成=EDTA (0.5g/L)，FeSO4.7H20 (0.2g/L)，微量元素 SL-6 (100mL/L)。微量元素 SL-6 组成=ZnSO4.7H20 (0.0 lg/L)，MnCl2.4H20 (0.03g/L)，H3BO4 (0.3g/L)，CoCl2.6H20 (0.2g/L)，CuCl2.2H20 (0.01g/L), NiCl2.6H20 (0.02g/L), Na2MoO4.2H20 (0.03g/L)。
[0027]⑵菌株 的筛选
[0028]挑取分离所得到的单菌落，分别接种于吡啶浓度为1000mg/L、以吡啶为唯一碳源和氮源的无机盐液体培养基中，摇床培养120h。测定培养基中吡啶浓度变化，如果培养基中吡啶浓度显著降低，即可表明吡啶发生了降解。在分离得到的单菌落中，命名为NJUST18的菌株降解性能最为优异，在120h的培养期内，吡啶完全降解，因此选取该菌株作后续的鉴定。
[0029]⑶菌株的鉴定
[0030]对细菌进行形态学、生理生化测试。测定菌株的16S rDNA序列，将菌株的16S rDNA基因序列与国际GenBank数据库中的序列进行网上同源性比较，最终从分子水平上确定该菌的种属。
[0031]①形态特征:NJUST18菌落呈白色，圆形，边缘整齐，光滑湿润。该菌株细胞呈短杆状，表面光滑，以周生鞭毛运动，不形成芽孢。尺寸为2-3 μ mX0.8-0.9 μ m。图1中，左为平板培养基上的菌落，右为细菌的透射电镜照片。
[0032]②生理生化特征:革兰氏阴性，催化酶阴性，氧化酶阴性，接触酶阴性，尿素酶阴性，不能水解淀粉，不能水解酪素，不能利用柠檬酸，可在PH为9.0的营养肉汤中生长，好氧，最适降解pH范围为5.0-8.0，最适生长温度为20-35°C。
[0033]③分子生物学鉴定:以NJUST18菌的核DNA为模板，以16S rDNA基因的PCR扩增的通用引物为引物，进行PCR扩增，测定其全序列，土壤杆菌的16S rDNA基因序列见图6所示的序列表。将菌株的16S rDNA基因序列提交至GenBank数据库(GenBank登陆号为JN106368)，与GenBank数据库中的序列进行网上同源性比较，结果表明，NJUST18与Rhizobium sp.R-24658 和 Rhizobiales bacterium D11-28.1 的序列相似度高达99% 以上。[0034]根据NJUST18的形态学、生理生化测试以及分子生物学分析，NJUST18鉴定为根瘤杆菌(Rhizobium sp.),命名为(Rhizobium sp.)NJUST18。
[0035]⑷菌株对吡啶的降解及在吡啶废水处理中的应用
[0036]将吡啶降解菌株NJUST18接种至添加1000mg/L吡啶的LB培养基，30°C条件下以180转/分的转速摇床培养，进行NJUST18的富集培养，待菌体进入对数生长期后期(约48h)，将所得菌体用6000Xg的转速离心分离5分钟，撇去上清液，采用涡旋震荡的方法将菌体重新悬浮于无菌液体MSM，离心。重复洗涤过程三次后，将菌体重新悬浮于无菌液体MSM (调节加入的MSM量，控制菌悬浮液OD6tltl约为1.5)，得到种子液。
[0037]配制加入1000mg/L吡啶的液体MSM作为模拟废水，将上述种子液加入模拟吡啶废水中，30°C条件下以180转/分的转速摇床培养，观测降解过程中废水中吡啶浓度、总有机碳(TOC)浓度、氨氮浓度以及pH变化，观测细菌生长情况。设立未接种NJUST18的空白对照。实验结果如图2所示。由图2可知，1000mg/L吡啶可于102h内完全降解；伴随着吡啶的降解，细菌生物量显著增长，产率系数约为0.46 ;吡啶降解过程中，吡啶结构中的氮以氨氮的形式释放出来，吡啶降解结束后氨氮的得率约为55% ；T0C显著降低，去除率可高达85% ；由于氨氮的释放，PH则由初始值7.0增加到8.76。而在未接种NJUST18的对照样中，吡啶未得到明显降解。
[0038]本实施例说明分离得到的(Rhizobium sp.)NJUST18可以利用吡唳为唯一碳源和氮源进行生长繁殖，并可实现吡啶的矿化。
[0039]实施例2:废水中吡啶浓度对吡啶降解性能的影响
[0040]配制吡啶浓度分别为600mg/L、1000mg/L、1600mg/L、2000mg/L 和 2600mg/L 的液体MSM作为模拟废水，将(Rhizo bium sp.)NJUST18种子液以5%的接种量接入模拟废水。由图3所示，(Rhizobium sp.)NJUST18可实现吡唳浓度高达2600mg/L的模拟废水中吡唳的完全降解。在吡啶浓度为600mg/L、1000mg/L、1600mg/L、2000mg/L和2600mg/L的条件下，分别可在75h、102h、204h、220h、240h内实现模拟废水中吡啶的完全去除。伴随吡啶的降解，细菌浓度同步增长，产率系数分别为0.51,0.46,0.33,0.35和0.34。由于吡啶的高毒性和难降解特性，在高浓度条件下，尽管可以实现吡啶的完全降解，其降解速率显著下降。降解速率下降的现象在降解末期尤为明显。
[0041]本实施例说明虽然(Rhizobium sp.)NJUST18可实现高浓度吡唳的完全降解,但处
理效率有待改进。
[0042]实施例3:废水pH值对吡啶降解性能的影响
[0043]配制吡啶浓度为1000mg/L，初始pH为5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,10.0的吡啶模拟废水，将(Rhizobium sp.)NJUST18种子液以5%的接种量接入模拟废水。由图4所示，在初始pH为7.0-8.0的条件下，(Rhizobium sp.)NJUST18可实现吡啶的高效率降解；在初始pH为
5.0-6.0的条件下，经历了 72h的延滞期后，吡啶加速降解；而在pH为9.0-10.0的条件下，吡啶降解较为缓慢，在降解末期尤为缓慢。
[0044]本实施例说明(Rhizobium sp.)NJUST18的降解吡唳的最佳pH值条件为中性至弱碱性；在口11为5.0-8.0的范围内，吡啶降解速率相对较高；高口11条件则不利于吡啶的降解。
[0045]实施例4:废水中易降解碳源的存在对吡啶降解性能的影响
[0046]配制批卩定浓度为1000mg/L,外加葡萄糖浓度分别为500mg/L、1000mg/L、2000mg/L的吡啶模拟废水，将(Rhizobium sp.)NJUST18种子液以5%的接种量接入模拟废水。由图5所示，500mg/L葡萄糖的加入有助于提升吡啶的降解速率；1000mg/L、2000mg/L葡萄糖的加入则延缓了吡啶的降解，且随着外加葡萄糖浓度的增高，延缓作用加剧。
[0047] 本实施例说明低浓度的易降解碳源的存在有利于(Rhizobium sp.)NJUST18的生长，从而促进了吡啶的降解过程；高浓度的易降解碳源的存在消耗了氧气和营养元素，对吡啶的降解产生竞争性抑制。
【权利要求】
1.一株可降解吡啶的根瘤杆菌，其特征在于它于2013年3月28日在中国典型培养物保藏中心CCTCC保藏，保藏单位地址为中国湖北省武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCCN0:M2013110,命名为根瘤杆菌NJUST18，其分类命名为(Rhizobium sp.)，GenBank登陆号为 JN106368。
2.根据权利要求1所述的可降解吡啶的根瘤杆菌，其特征在于所述的根瘤杆菌菌落特征和生理生化特征为:呈白色，圆形，边缘整齐，光滑湿润，该菌株细胞呈短杆状，表面光滑，以周生鞭毛运动，不形成芽孢，尺寸为2-3 μ mX0.8-0.9μπι;革兰氏阴性，催化酶阴性，氧化酶阴性，接触酶阴性，尿素酶阴性。
3.—种如权利要求1所述的可降解吡啶的根瘤杆菌的选育方法，其特征在于包括以下步骤: (O菌株的分离:将长期受到吡啶污染的排污口取出的土样2g加入到50mL含500mg/L吡啶的液体无机盐培养基MSM中，装入150mL三角瓶中，30°C条件下以180转/分的转速摇床培养进行富集培养；7天后，2mL富集培养后的液体培养基转接入50mL新鲜液体无机盐培养基MSM中，并摇床培养；经过连续3次转接后，用无菌蒸馏水将转接后的液体培养基稀释IO5-1O9倍，涂布于含1000mg/L吡啶的无机盐固体培养基平板上，放入30°C培养箱中进行培养；一周后挑取在菌落特征上有明显差异的菌落，采用平板划线分离的方法进行纯化，连续纯化三次后，得到单一菌株，并进行斜面保存。 (2)菌株的筛选:挑取分离所得到的单菌落，分别接种于含1000mg/L吡啶的无机盐液体培养基中，摇床培养120h ;测定培养基中吡啶浓度变化，选取培养基中吡啶浓度显著降低的单菌落。
4.一种利用权利要求1所述的可降解吡啶的根瘤杆菌在吡啶废水治理中的应用。
5.根据权利要求4所述的可降解吡啶的根瘤杆菌在吡啶废水治理中的应用，其特征在于所述的吡啶废水的PH值为5-8，废水中吡啶浓度不超过2600mg/L。
【文档编号】C12R1/41GK103540544SQ201310374832
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年8月23日 优先权日:2013年8月23日
【发明者】沈锦优, 王连军, 张鑫, 陈丹, 孙秀云, 李健生, 刘晓东 申请人:南京理工大学