一种水基钻屑石油烃降解菌的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物领域，涉及一种水基钻肩石油烃降解菌。
【背景技术】
[0002] 石油已成为港口海域主要污染源之一，港口海域受到天然源的石油和人为排放石 油(海洋石油运输、海洋钻井平台石油生产、城市污水排放、疏浚物释放、陆地石油生产大气 沉降、城市地表径流携带、工业污水排放、河流输送)的污染。大型港口的水深一般为几米至 几十米，周围没有潮滩，持续输入的石油污染经过扩散、蒸发、溶解、乳化、光化学氧化、微生 物氧化、沉降、形成沥青球等一系列复杂变化后，大量石油污染沉降进入沉积层，受温度、溶 氧、pH等环境条件限制，沉积物中石油烃的自然降解非常缓慢，石油烃会在此驻留几年甚至 几十年，在海流、海浪、疏浚等作用下，沉入海底的石油或石油氧化物还可能再次浮上海面， 造成二次污染。而长期受石油污染的区域会有石油烃降解菌的富集，可以采用土著石油烃 降解菌对污染港口海域进行原位修复。
[0003] 2011年对渤海湾沉积物的石油烃含量进行调查，调查结果显示，港口海域（天津 港)沉积物石油烃含量为484mg/kg，污染高于其他海域。由此可见，港口海域已成为我国石 油污染的重灾区。为了解决港口海域石油污染问题，进行石油烃的微生物修复技术的研究， 治理港口石油污染，不造成二次污染的降解是十分必要的。本课题针对港口海域的石油污 染状况，利用天津港筛选出的土著微生物，构建适合港口海域对石油烃具有较强降解效果 的菌群;而对于石油烃降解菌株的专一性降解实验，可以有效分析菌株对烃类物质的降解 能力，并以此理论进行港口石油污染的生物修复，对于港口海域的治理，具有重要的理论和 应用性的意义。以期为微生物修复港口海域石油污染技术提供理论支持。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种降解效率高的水基钻肩石 油烃降解菌。
[0005] 本发明实现目的的技术方案是：
[0006] 一种水基钻肩石油烃降解菌，保藏编号为:CGMCC No. 11389,分类命名为:芽孢杆 菌Bacillus sp.，保藏日期：2015年09月17日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0007] 而且，所述石油烃降解菌降解正十九烷、姥鲛烷、菲、芘和苯并(α)芘。
[0008] 本发明的优点和积极效果是：
[0009] 1、本发明提供的菌株采用平板法甄别菌株的降解专一性结果为菌株CH1可降解正 十九烷、姥鲛烷、菲、芘和苯并(α)芘。
[0010] 2、本发明提供的菌株混合菌在姥鲛烷、菲、荧蒽、苯并(α)芘、这四种物质混合烃以 及空白对照的培养液中生长30天后，平板涂布法观察菌落结构发生变化:空白组中菌株CH1 数量占绝对优势。
[0011] 3、本发明提供的菌株经过石油烃降解菌20天的降解，菌株CH1对柴油的降解率均 达到90 %以上，空白对照组挥发量约占60 % ;通过GC-MS全扫描正十九烷的降解产物，得出 其降解率及降解产物峰图，正十九烷20天的挥发量(20yg/L的浓度除外)约有97%-99%。
【附图说明】
[0012] 图1为本发明CH1的菌落形态图；
[0013]图2为本发明CH1的扫描电镜图片。
【具体实施方式】
[0014] 下面通过具体的实施方案叙述本发明方法。除非特别说明，本发明中所用的技术 手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发 明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背 离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改 动也属于本发明的保护范围。
[0015] 申请人对天津港口海域海水中烷烃、芳烃含量进行检测，其中烷烃的浓度为24.44 yg/L，甲基取代的芳香烃浓度为1.60yg/L，含量远远大于渤海海域等其他海域含量;对潮间 带沉积物优控多环芳烃含量进行检测，其中低潮位的16种优控多环芳烃的浓度为 154 · 07ng/g，中潮位为42 · 21ng/g，高潮位为33 · 1 lng/g，含量高于其它非港口海域。分析沉 积物中PAHs含量，通过对多环芳烃混标进行选择离子扫描，低潮位、中潮位和高潮位的沉积 物中PAHs的GC-MS色谱图。其成分为:萘、危烯、危、芴、菲、蒽、焚蒽、芘、苯并(a)蒽、屈、苯并 (b)荧蒽、苯并(k)荧蒽。
[0016] -种水基钻肩石油烃降解菌，具体发现及鉴定过程如下：
[0017] 本发明是采集背景调查的港口海域海水，利用逐级驯化培养的方法筛选分离出其 中的土著石油烃降解菌，对其进行电镜扫描形态观察，并通过16S rDNA测序分析，进行菌种 鉴定。，本申请筛选的菌株，保藏编号为:CGMCC No. 11389，分类命名为:芽孢杆菌Baci 1 lus sp.，保藏日期:2015年09月17日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心，地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，为了叙述方便，以下采用CH1代替保藏编号为： CGMCC No. 11389来进行说明。
[0018] 一、试剂：蛋白胨、酵母浸出粉、（NH4)2S〇4、KH2P〇4、K2HP〇4 · 3H20、FeP〇4 · 4H20、Na0H 和浓盐酸。
[0019]材料:〇#柴油、海水晶。
[0020]培养基配方见表1。
[0021 ]表1实验所用培养基配方
[0022]
[0023]二、石油烃降解菌的驯化、分离与纯化 [0024] 1、石油烃降解菌的驯化步骤为：
[0025] (1)无菌实验条件下，加入5mL采集的海水于100mL富集培养液I中，在30°C、150rpm 条件下，进行摇瓶实验，对海水中的细菌驯化培养；
[0026] (2)培养一周后，摇匀培养液并转移约一半体积至50mL新鲜富集培养液I中继续培 养；
[0027] (3)在同上的条件下，再转移至富集培养液Π 中，依次进行2次富集培养。
[0028] 2、石油烃降解菌的分离与纯化：
[0029] (1)采用平板涂布分离法，用无菌水对驯化四周后的培养液进行梯度稀释，稀释 ΠΓ1、10_2、10_3、10_4、10_ 5、10_6、10_7倍，分别取0. lmL 10_5、10_6、10_7倍的稀释液于柴油平板 培养基上进行涂布，在30°C的培养箱中培养2d;
[0030] (2)挑选形态不同的单独菌落，进行划线分离，在30°C的培养箱中培养2d;
[0031] (3)重复步骤（2)对菌株进行划线纯化，直至平板上所有菌落的形态一致，即为单 一菌株，分离出的菌株用柴油斜面培养基划线保种，4°C冰箱保存。
[0032]三、菌株扫描电镜观察
[0033] 进行扫描电镜观察前用去离子水配制PBS缓冲液(Phosphate Buffered Saline)， 灭菌后置于4°C冰箱保存待用;LB(Luria-Bertani)培养液、lmL移液枪枪头和10mL离心管提 前灭菌。
[0034] 其中PBS缓冲液:KH2P〇4 0.27g/L、Na2HP〇4 1.42g/L、NaCl 8g/L、KCl 0.2g/L，l% 盐酸调节pH至7.4。
[0035] 使用扫描电镜观察细菌菌体形态需要对细菌进行前处理：
[0036] (1)无菌条件下挑取纯化后的单一菌落，接入有50mL LB培养液的锥形瓶中，37°C、 150rpm条件下摇瓶振荡培养12h，使用1000yL的移液枪吸取800yL菌液10mL离心管内；
[0037] (2)将离心管置于高速离心机，3000rpm离心5min，倒去上清液，加入500yL蒸馏水， 离心去上清液，重复离心清洗3次洗净培养液，以免对电镜观察造成干扰；
[0038] (3)离心管中加入lmL 2.5%戊二醛，用力混合均匀，放冰箱4°C冷藏静置4~5h; 3000rpm离心去上清液后使用PBS缓冲液对细菌清洗离心3次；
[0039] (4)利用四个梯度浓度(20 %、50 %、80 %、100 % )的乙醇溶液依次对细菌进行脱水 处理，每个梯度脱水l〇min后3000rpm离心，去上清液；
[0040] (5)用800yL蒸馏水置换乙醇，吸取菌悬液轻轻滴在洁净的载玻片中心，自然风干 以待进行扫描电镜的观察。
[0041] 四、石油烃降解菌的16S rDNA的分子学鉴定
[0042] 1、DNA 的提取
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