一种评价硫酸盐还原菌抑制效果的方法
【专利摘要】本发明涉及一种评价硫酸盐还原菌抑制效果的方法；从测试液/培养液瓶中取出体积为Vb的测试液/培养液废弃掉；注入用含硫酸盐还原菌的污水配制的抑制药剂/杀菌剂，体积为Vb或Vn；注入污水体积为（Vb-Vn）；放入培养箱，30℃恒温培养，每24h观察结果；每隔24h小剂量、小体积地补充注入用清水配制的该抑制药剂/杀菌剂，以液体总体积不超过瓶子的总体积为限，30℃恒温培养，每24h观察结果，以铁钉是否变黑，瓶内液体是否变黑或产生明显的黑色沉淀物、几天变黑来评价该抑制配方对该水样中的硫酸盐还原菌的抑制效果；本方法缩短了测试周期，减少了抑制剂/杀菌剂的用量和测试瓶的消耗，测试结果更为直观。
【专利说明】一种评价硫酸盐还原菌抑制效果的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种利用硫酸盐还原菌细菌测试瓶或自行配制的适合硫酸盐还原菌生长的培养基(内加指示剂)，快速评价杀菌剂或抑制剂对该微生物的杀灭或抑制效果的评价方法。
【背景技术】
[0002]在油田生产中，硫酸盐还原菌(SRB)的繁殖滋生会引起许多不良后果，如油田水处理设备的腐蚀破坏、地层堵塞、油层污染等，给油田生产造成巨大损失。国内外科技工作者对控制SRB的生长进行了大量的探索，对SRB危害的监控和杀菌剂效果的检测都需要我们及时检测SRB，因而，对杀菌剂和抑制剂的应用效果的评选和及时检测就显得尤为重要。
[0003]国内外科技人员对于硫酸盐还原菌的抑制效果的检测，主要集中在3个层面:一是传统的检测方法，培养法及显微镜直接计数法；二是基因层面，基于SRB种属的16SrDNA序列的定性检测，如基因芯片以及FISH技术对SRB的定量和定性检测，APS还原酶基因和异化型亚硫酸盐还原基因进行定性检测；三是蛋白层面，主要是通过免疫吸附的原理得以实现，如已经申请专利的基于APS还原酶的SRB的快速检测试剂盒。到目前为止，还没有一种被公认较完善的检测方法。其中，显微镜技术最大的特点是快速，但需特定的染料及受过培训的操作人员。由于该技术不能分辨细菌的死活，所以检测结果往往偏高。通过检测细菌构成物测定SRB的仪器有很多，但因测定的具体构成物不同，分析结果往往有差异。随着分子生物学技术的飞速发展，分子生物学方法已经渗透到环境生物地球化学的许多领域，但是由于专业要求较高，辅助检测设备操作难度大，检测费用较高，不适于普遍适用。
[0004]培养法是我国各油田过去多年来一直采用的SRB的检测方法，它是根据APIRP-38美国石油学会推荐的地下注入水分析方法中的绝迹逐渐稀释法进行的。该方法是迄今为止应用最多也是最好的方法，可靠性较高。目前，油田系统内SRB菌的计数主要执行中国石油天然气行业标准SY/T5329-94。对杀菌剂/抑制剂药效的评价也多用此法。即在一定体积的污水样中，静态或动态地加入杀菌剂/抑制剂，恒温培养若干小时后，再利用硫酸盐还原菌测试瓶做培养测试分析。这种方法存在的问题是:试验周期长，包括前期反应和后期评价两个过程，尤其在前期抑制剂的评选过程中，工作量繁琐，不能及时有效地指导生产实践。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种用于快速评价硫酸盐还原菌杀灭/抑制效果的方法，可简单快速地评选杀菌剂/抑菌剂，并方便观察，去掉了加入抑制剂/杀菌剂的单独反应过程，将反应和评价过程合二为一，缩短了评价检测时间，达到快速评价抑制配方的目的。
[0006]本发明所所述的快速评价硫酸盐还原菌抑制效果的方法，是以市场上流通的、内装硫酸盐还原菌测试液的硫酸盐还原菌测试瓶为反应场所，测试液体积范围为5?IOml ；或者以自行配制的、内加指示剂的适合硫酸盐还原菌优势生长的培养基为反应场所，培养基成分以质量含量为单位，由磷酸氢二钾0.1~1%。，硫酸盐I~10%。，亚铁盐0.1~1%。，氯化物I~10%。,抗坏血酸0.1~1%。, L-Cys半胱氨酸0.1~1%。,乳酸盐2~10%。和蒸懼水995.6~966%。组成，pH=6.5~7.0，该培养基经灭菌处理后装在带有密封盖的厌氧瓶中，体积范围为5~IOml ;以广泛存在于土壤、海水、河水、地下管道以及油气井等缺氧或兼性厌氧环境中，以硫酸根为底物进行还原反应，适宜生长的温度为25~60°C，pH为6~9的硫酸盐还原菌为抑制对象；以生物抑制剂/化学杀菌剂/生物-化学复配抑制剂为评价对象，其中，生物抑制剂为以硝酸根/亚硝酸根为电子受体的反硝化细菌菌液及其营养液，化学杀菌剂包括氧化性杀菌剂，如氯气、次氯酸钠、漂白粉、臭氧、氯胺等；非氧化性杀菌剂，如氯化十二烷基二甲基苄基铵、溴化十二烷基二甲基苄基铵、二硫氰基甲烷等；重金属化合物，如氧化汞、氯化汞、氟化汞等；粘泥杀菌剂，如松香胺、过氧化氢、又胍聚合物等，生物-化学复配抑制剂则为上述两种或两种以上制剂的任意组合。若在3天之内，测试瓶中的铁钉没有变黑或者产生明显的黑色沉淀物，或者厌氧瓶中的带有指示作用的培养液没有变黑或产生明显的黑色沉淀物，则表明该条件下评选出来的药剂种类和浓度可在O~24h内将该污水中的硫酸盐还原菌控制在O~5mg/l。该控制指标远远低于SY-T5329-1994碎屑岩油藏注水水质推荐指标(SRB < 25个/ml)。
[0007]相同浓度、不同种类的抑制剂或杀菌剂的评选方法。首先从油田、矿场及其他存在硫酸盐还原菌危害的环境中取样或制备成含有硫酸盐还原菌的污水样。依据污水中硫酸盐还原菌的含量，利用含有硫酸盐还原菌的污水配制相同浓度、不同种类的抑制剂/杀菌剂，并依次编号为1#、2#~N#。其次，对应于N个抑制剂/杀菌剂的配方，取N个硫酸盐还原菌测试瓶，并依次编号为1、2……N;同时再取N个硫酸盐还原菌测试瓶做为空白对照，依次编号为I,、2，……N'。每只硫酸盐还原菌测试瓶中的原装测试液体积为Va，分别从2N个硫酸盐还原菌测试瓶中均吸取体积为Vb的测试液废弃处理，Vb与Va的比例为0.1~0.9，此时2N个硫酸 盐还原菌测试瓶中的测试液体积均为(Va-Vb)。加药方式可根据需要选择一次性加入或连续加入。若是一次性加入，则吸取体积为Vb的1#抑制剂/杀菌剂，注入编号为I的硫酸盐还原菌测试瓶中，吸取体积为Vb的污水样，注入编号为I'的空白硫酸盐还原菌测试瓶中；吸取体积为\的2#抑制剂/杀菌剂，注入编号为2的硫酸盐还原菌测试瓶中，吸取体积为Vb的污水样，注入编号为2'的空白硫酸盐还原菌测试瓶中；……以此类推，直至需要的硫酸盐还原菌测试瓶均注射完毕。此时硫酸盐还原菌测试瓶中的最终抑制剂/杀菌剂浓度和污水中的硫酸盐还原菌数量均按同等比例进行了稀释。最后将注入好的硫酸盐还原菌测试瓶均放入恒温箱中恒温至30°C培养，每24h观察一次，以铁钉是否变黑，瓶内液体是否变黑或产生明显的黑色沉淀物、几天变黑来评价该抑制配方对该水样中的硫酸盐还原菌的抑制效果。没变黑的时间越长，说明该抑制剂/杀菌剂对该水样中的硫酸盐还原菌的抑制效果越好。若是连续加入，即在一次性加入的基础上，每隔24h，用一次性注射器分别吸取编号为1#、2#~Ns的抑制剂/杀菌剂，对应编号为1、2……N的硫酸盐还原菌测试瓶，分别补充注入适量的的抑制剂/杀菌剂，补充注入药剂体积与硫酸盐还原菌测试瓶原装药液体积比为0.01~0.05。连续I~7天，若3天内观察到铁钉变黑/瓶内液体变黑/产生明显的黑色沉淀物，则停止补加，说明该条件不能在O~24h内将污水中的SRB控制在O~5mg/I。
[0008]相同种类、不同浓度的抑制剂或杀菌剂的评选方法。首先从油田、矿场及其他存在硫酸盐还原菌危害的环境中取样或制备成含有硫酸盐还原菌的污水样。依据污水中硫酸盐还原菌的含量，利用含有硫酸盐还原菌的污水配制一种较高浓度(浓度为C)的针对硫酸盐还原菌的抑制剂/杀菌剂，若考察的药剂浓度依次为Cp C2……Cn，则取N个硫酸盐还原菌测试瓶，依次编号为1、2……N ;同时再取N个硫酸盐还原菌测试瓶做为空白对照，依次编号为I,、2'……N'。每只硫酸盐还原菌测试瓶中的原装测试液体积为Va，分别从2N个硫酸盐还原菌测试瓶中均吸取体积为Vb的测试液废弃处理，Vb与Va的比例为0.1~0.9，此时2N个硫酸盐还原菌测试瓶中的测试液体积均为(Va-Vb)。加药方式可根据需要选择一次性加入或连续加入。若是一次性加入，则吸取体积为V1的1#抑制剂/杀菌剂，注入编号为I的硫酸盐还原菌测试瓶中，用另一支一次性注射器吸取体积为(Vb-V1)的污水也注入编号为I的硫酸盐还原菌测试瓶中，其中，Vn = Cn.NJC (Vn e (Va-Vb))0吸取体积为Vb的污水样，注入编号为I,的空白硫酸盐还原菌测试瓶中；吸取体积为％的2#抑制剂/杀菌剂，注入编号为2的硫酸盐还原菌测试瓶中，用另一支一次性注射器吸取体积为(Vb-V2)的污水也注入编号为2的硫酸盐还原菌测试瓶中；吸取体积为Vb的污水样，注入编号为2'的空白硫酸盐还原菌测试瓶中；……以此类推，直至需要的硫酸盐还原菌测试瓶均注射完毕。此时硫酸盐还原菌测试瓶中的最终抑制剂/杀菌剂浓度依次为C1X2……Cn，而空白测试瓶中的硫酸盐还原菌数量则按同等比例进行了稀释。最后将注入好的硫酸盐还原菌测试瓶均放入恒温箱中恒温至30°C培养，每24h观察一次，以铁钉是否变黑，瓶内液体是否变黑或产生明显的黑色沉淀物、几天变黑来评价该抑制配方对该水样中的硫酸盐还原菌的抑制效果。没变黑的时间越长，说明该抑制剂/杀菌剂对该水样中的硫酸盐还原菌的抑制效果越好。若是连续加入，即在一次性加入的基础上，每隔24h，用一次性注射器吸取浓度为C的抑制剂/杀菌剂，对应编号为1、2……N的硫酸盐还原菌测试瓶，分别补充注入适量的抑制剂/杀菌剂，补充注入药剂体积与硫酸盐还原菌测试瓶原装药液体积比为0.01~0.05。连续I~7天，若3天内观察到铁钉变黑/瓶内液体变黑/产生明显的黑色沉淀物，则停止补加，说明该条件不能在O~24h内将污水中的SRB控制在O~5mg/l。 [0009]本发明的有益效果是，将硫酸盐还原菌的抑制/杀灭、再培养、检测、观察集中在同一时间内、同一反应环境中完成，省却了硫酸盐还原菌和抑制药剂单独作用反应的场所和时间。每评选一个条件，加上空白对照，只需2个硫酸盐还原菌测试瓶。在3天左右便可估测出该条件在将来现场应用时的有效时间。这种评价方法，不但缩短了测试周期，而且减少了抑制剂/杀菌剂的用量和硫酸盐还原菌测试瓶的消耗，相应地降低了操作者的劳动量，且测试结果观测起来更为直观。利用该方法所评选出来的抑制配方/杀菌剂也更为苛亥IJ，对硫酸盐还原菌的抑制标准为5个/ml，将来在推广使用的时候有一定的富裕度。同时该发明可作为一种硫酸盐还原菌抑制效果的快速评价方法和观察方法，以测试液中的指示剂/指示物(铁钉)变化为标准，没变黑的天数越多，说明该抑制剂/杀菌剂对该污水样中的硫酸盐还原菌的抑制效果维持的时间越长，该配方越好。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1是本发明的一次性加药操作流程示意图。
[0011]图2是本发明的连续性加药操作流程示意图。
[0012]其中，1-测试瓶/厌氧瓶；2_ 一次性注射器；3_废液杯；4_培养箱。【具体实施方式】
[0013]步骤1:从测试液/培养液中取出体积为Vb的测试液/培养液，并废弃掉入废液杯3中；
[0014]步骤2:用一次性注射器2注入用含硫酸盐还原菌的污水配制的抑制药剂/杀菌剂，体积为Vb或Vn;
[0015]步骤3:用一次性注射器2注入污水，体积为(Vb-Vn)；
[0016]步骤4:放入培养箱4，30°C恒温培养，每24h观察结果；
[0017]步骤5:每隔24h小剂量、小体积地补充注入用清水配制的该抑制药剂/杀菌剂，以液体总体积不超过瓶子的总体积为限。
[0018]步骤6:30°C恒温培养，每24h观察结果。
[0019]实施例1
[0020]以克拉玛依油田石南4污水为含硫酸盐还原菌的污水样(SRB为104个/ml)，用其配制100mg/l的次氯酸钠、二硫氰基甲烷、氯化汞溶液各100ml，并依次编号为1#、2#和3# ；取硫酸盐还原菌测试瓶6只(内置测试液10ml)，各吸出5ml测试液并弃之，分别编号为1、
2、3和1'、2' ,V，其中编号为1'、2' ,V的为空白对照。在编号为I的硫酸盐还原菌测试瓶中注入5ml配制好的1#溶液，吸取体积为5ml的污水样，注入编号为I'的空白硫酸盐还原菌测试瓶中；在编号为2的硫酸盐还原菌测试瓶中注入5ml配制好的2#溶液，吸取体积为5ml的污水样，注入编号为2，的空白硫酸盐还原菌测试瓶中；在编号为3的硫酸盐还原菌测试瓶中注入5ml配制好的3#溶液，吸取体积为5ml的污水样，注入编号为3'的空白硫酸盐还原菌测试瓶中。使每只硫酸盐还原菌测试瓶中的总液体体积为10ml。这时，编号为1、2、3的测试瓶中的杀菌剂的终浓度均为50mg/l。放入30°C培养箱恒温培养，每隔24小时后，进行观察，观察期为7天。
[0021]
【权利要求】
1.一种评价硫酸盐还原菌抑制效果的方法，其特征在于，以市售的硫酸盐还原菌测试瓶或者自行配制的硫酸盐还原菌培养基为检测手段，以硫酸盐还原菌为抑制对象，以生物抑制剂、化学杀菌剂或生物-化学复配抑制剂为评价对象，评价硫酸盐还原菌的抑制效果的方法包括以下步骤: 1)取样:从油田、矿场及其他存在硫酸盐还原菌危害的环境中取样或制备成含有硫酸盐还原菌的污水样； 2)配药:依据污水样中硫酸盐还原菌的含量，利用该污水样配制相同浓度、不同种类的抑制剂/杀菌剂，并依次编号为1#、2#~N# ;或者配制浓度为C的同种抑制剂/杀菌剂溶液，考察其在不同浓度Cp C2……Cn下的抑制/杀灭效果； 3)编号:对应于N种抑制剂/杀菌剂或同一抑制剂/杀菌剂的N种不同浓度，取N个硫酸盐还原菌测试瓶，依次编号为1、2……N ;并同时做空白对照，空白硫酸盐还原菌测试瓶编号为I'、2'……N'； 4)比例调配:每只硫酸盐还原菌测试瓶中的原装测试液体积为Va，废弃测试液体积为Vb, Vb是依据抑制剂/杀菌剂发挥药效的终浓度计算而得，且Vb:Va为0.1~0.9，分别从测试液体积为Va的2N个硫酸盐还原菌测试瓶中均吸取体积为Vb的测试液废弃处理，此时2N个硫酸盐还原菌测试瓶中的测试液体积均为(Va-Vb)； 5)注药:加药方式可根据需要选择一次性加入或连续加入方式； 一次性加入方式:吸取体积为VbZiV1的1#抑制剂/杀菌剂，注入编号为I的硫酸盐还原菌测试瓶中，若评价同一药剂在不同浓度下的抑制效果，则再用另一支一次性注射器吸取体积为(Vb-V1)的污水也注入编号为I的硫酸盐还原菌测试瓶中，其中，Vn = Cn.NjC (Vn e(Va-Vb));同时吸取体积为Vb的污水样，注入编号为的空白硫酸盐还原菌测试瓶中；吸取体积为\的2#抑制剂/杀菌剂，注入编号为2的硫酸盐还原菌测试瓶中，若评价同一药剂在不同浓度下的抑制效果，则再用另一支一次性注射器吸取体积为(Vb-V2)的污水也注入编号为2的硫酸盐还原菌测试瓶中，同时吸取体积为Vb的污水样，注入编号为2'的空白硫酸盐还原菌测试瓶中；……以此类推，直至需要的硫酸盐还原菌测试瓶均注射完毕，此时硫酸盐还原菌测试瓶中的最终抑制剂/杀菌剂浓度即为所考察的浓度，污水中的硫酸盐还原菌数量均按比例进行了稀释； 连续加入方式:若是不同种类药剂的评选，即在一次性加入的基础上，每隔24h，用一次性注射器分别吸取编号为1#、2#~Ns的抑制剂/杀菌剂，对应编号为1、2……N的硫酸盐还原菌测试瓶，分别补充注入适量的的抑制剂/杀菌剂。若是同种药剂在不同浓度下的评选，即在一次性加入的基础上，每隔24h，用一次性注射器吸取浓度为C的抑制剂/杀菌剂，对应编号为1、2……N的硫酸盐还原菌测试瓶，分别补充注入适量的抑制剂/杀菌剂；补充注入药剂体积与硫酸盐还原菌测试瓶原装药液体积比为0.01~0.05 ;连续1~7天,若3天内观察到铁钉变黑/瓶内液体变黑/产生明显的黑色沉淀物，则停止补加，说明该条件不能在O~24h内将污水中的SRB控制在O~5mg/l ； 6)培养、观察:将注入好的硫酸盐还原菌测试瓶均放入恒温箱中恒温至30°C培养，每24h观察一次，以铁钉是否变黑，瓶内 液体是否变黑或产生明显的黑色沉淀物、几天变黑来评价该抑制配方对该水样中的硫酸盐还原菌的抑制效果。
2.根据权利要求1所述的一种评价硫酸盐还原菌抑制效果的方法，其特征在于:所抑制的对象硫酸盐还原菌广泛存在于土壤、海水、河水、地下管道以及油气井及缺氧或兼性厌氧环境中，以硫酸根为底物进行还原反应，适宜生长的温度为25~60°C，pH为6~9。
3.根据权利要求1所述的一种评价硫酸盐还原菌抑制效果的方法，其特征在于:硫酸盐还原菌培养基成分以质量含量为单位，由磷酸氢二钾0.1~1%。，硫酸盐I~10%。，亚铁盐0.1~1%0，氯化物I~10%。,抗坏血酸0.1~1%。，L-Cys半胱氨酸0.1~1%0，乳酸盐2~10%。和蒸馏水995.6~966%。组成，ρΗ=6.5~7.0。
4.根据权利要求1所述的一种评价硫酸盐还原菌抑制效果的方法其特征在于:评价对象为生物抑制剂、化学杀菌剂或生物-化学复配抑制剂；生物抑制剂为以硝酸根/亚硝酸根为电子受体的反硝化细菌菌液及其营养液，化学杀菌剂包括氧化性杀菌剂，如氯气、次氯酸钠、漂白粉、臭氧、氯胺等；非氧化性杀菌剂，如氯化十二烷基二甲基苄基铵、溴化十二烷基二甲基苄基按、二硫氰1基甲烧等；重金属化合物，如氧化萊、氣化萊、氣化萊等；粘泥杀菌剂，如松香胺、过氧化氢、又胍聚合物；生物-化学复配抑制剂则为上述两种或两种以上制剂的任意组合。
【文档编号】G01N21/82GK103901024SQ201210579145
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2012年12月27日 优先权日:2012年12月27日
【发明者】聂春梅, 陈爱华, 方新湘, 李敏香, 赵燕, 王传萍 申请人:中国石油天然气股份有限公司