一种耐酸耐盐兼性厌氧芽孢杆菌的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种原生质融合技术，具体涉及一种耐酸耐盐兼性厌氧芽孢杆菌的制 备方法。
【背景技术】
[0002] 当前，我国的养殖行业正在经历转型升级，传统的中小规模饲养的农业养殖模式 正在逐步向集约化规模化的工业养殖模式过渡。伴随着养殖模式的转变，暴露出一些亟待 解决的关键问题。集约化养殖的饲养环境相对密封，养殖密度大，动物免疫能力和抗疾病能 力减弱，对此，养殖中抗生素的使用就凸显出来。饲养过程中抗生素大量添加又导致了动物 胃肠道的正常菌群失调、内源性感染或二重感染，产生耐药菌株等弊端，特别是产品中的抗 生素残留会通过食物链影响人类的健康，引发了一系列的公共安全问题、环境保护问题、畜 禽产品质量等问题。由于抗生素的药物残留问题，我国动物养殖产品出口受到很大影响。随 着社会经济的发展及国家无公害食品行动计划的实施，人们食品安全意识日趋增强，越来 越关注健康和产品质量，无公害食品、绿色食品消费在世界范围内已成为潮流。养殖生产将 经历着由数量型向质量型的巨大历史变革。
[0003] 国内外的研宄表明乳酸菌等能产生乳酸、乙酸及次级代谢产物，在动物体内调节 胃肠道菌群平衡，使有益微生物的数量增加，增强了动物非特异性免疫系统功能；芽孢杆菌 属微生物由于具有较强的抗逆特性、能分泌高活性的脂肪酶、蛋白酶及淀粉酶等消化酶，以 上特性可以提高饲料的转化率和防病、促进动物对营养物质的消化吸收以及促进动物的生 长性能及较好的益生效果。因此，以乳酸菌、芽孢杆菌等为代表的饲用微生物在养殖业中得 到了大量的应用，成为了带到养殖业转型升级的重要推动力。
[0004] 目前，在养殖领域中使用的微生物主要包括两个类型，一类是厌氧型的乳酸菌，另 一类是好氧型的芽孢杆菌。这两类微生物在使用效果上各有其优缺点：乳酸菌可以在动物 肠道的缺氧环节中正常生长而发挥益生效果，但是该菌的耐热效果较差，耐酸耐盐能力也 有限；芽孢杆菌具有分泌多种消化酶的能力，而且具有较强的抗逆性，但是不能在厌氧环节 中生长，因此对动物肠道的益生效果有限。
[0005] 因此，急需发明一种新型的集乳酸菌与芽孢杆菌益生优势于一体的饲用微生物以 使其益生效果最大化，解决饲用微生物在使用中存在的问题。
【发明内容】
[0006] 本发明针对自然界中具有兼性厌氧特性并适用于动物饲养的微生物群体较少，若 直接从自然环境中分离具有兼性厌氧特性的饲用芽孢杆菌，成功率极低的缺陷，目的在于 提供一种耐酸耐盐兼性厌氧芽孢杆菌的制备方法。
[0007] 本发明具体通过以下技术方案实现：
[0008] -种耐酸耐盐兼性厌氧芽孢杆菌的制备方法，具体包括以下步骤：
[0009] 1)原生质体的制备：乳酸杆菌原生质体制备条件为：取活化培养12h的乳酸杆菌 细胞，加入浓度为3. 5mg/mL的溶菌酶，在pH7. 0、温度37°C的条件下酶解45min;芽孢杆菌 原生质体制备条件为：取活化培养6h的芽孢杆菌细胞，加入浓度为2. Omg/mL的溶菌酶，在 pH7. 0、温度37°C的条件下酶解30min。
[0010] 2)将乳酸杆菌原生质体和芽孢杆菌原生质体分别进行灭活；
[0011] 3)灭活后的乳酸杆菌与芽孢杆菌原生质体的融合。
[0012] 所述的乳酸杆菌为筛选得到的耐酸耐盐乳酸杆菌；所述的芽孢杆菌为筛选得到的 产蛋白酶耐酸耐盐芽孢杆菌。
[0013] 所述的活化培养采用的活化培养基为：
[0014] 乳酸杆菌：蛋牛肉膏10.Og，葡萄糖20.Og，白胨10.Og，酵母膏5.Og，吐 温-801.OmL，K2PH042. 0g，乙酸钠 5. 0g，柠檬酸三铵 2. 0g，MgS04 ? 7H20 0? 2g，MnS04 ?H20 〇? 〇5g，蒸馈水定容至 1L，pH6. 5,121°C灭菌 20min。
[0015] 芽孢杆菌：牛肉膏5. 0g，葡萄糖10. 0g，蛋白胨10. 0g，酵母膏5. 0g，NaCl 5. 0g，蒸 馏水定容至1L，pH 7. 2,121°C灭菌20min。
[0016] 所述的溶解酶用SMM配制，再用孔径为0.22ym的无菌滤器过滤除菌，分装成单次 使用的小份，-20°C保存。
[0017] 所述的灭活条件为：乳酸杆菌原生质体：65°C热处理120min;芽孢杆菌原生质体： 30W紫外灯20cm处照射15min。
[0018] 所述的融合条件为选用浓度为40% pH7. 0融合剂，在35~40°C条件下融合20~ 30min〇
[0019]所述的融合剂的制备方法为：40g PEG，KH2P040. 27g，CaCl20. llg，用 pH7. 0 的 PBS 缓冲液定容到100mL，121°C灭菌20min，备用。
[0020] 本发明的有益效果为：采用原生质体融合的方法人为构建具有耐酸耐盐特性的兼 性厌氧芽孢杆菌，本技术路线的成功概率远高于随机从环境中分离筛选具有耐酸耐盐特性 的兼性厌氧芽孢杆菌的技术方法；运用原生质体融合法构建并筛选获得的融合菌株由于集 合了原亲本菌株的优良遗传特性（如耐酸耐盐、芽孢形成、厌氧生长等），具有更加优越的 使用性能。
【附图说明】
[0021] 图1是乳酸菌在不同pH条件下耐受存活率的结果；
[0022] 图2是乳酸菌的胆盐耐受特性；
[0023] 图3是胆盐浓度0.2 %时芽孢杆菌的胆盐耐受特性；
[0024] 图4是胆盐浓度0.5 %时芽孢杆菌的胆盐耐受特性；
[0025] 图5是芽孢杆菌在不同pH条件下耐受存活率的结果；
[0026] 图6是乳酸杆菌A2和芽孢杆菌E2的生长曲线
[0027] 图7是溶菌酶浓度对乳酸杆菌A2原生质体形成率与再生率的影响；
[0028] 图8是溶菌酶浓度对芽孢杆菌E2原生质体形成率与再生率的影响；
[0029] 图9是酶解温度对乳酸杆菌A2原生质体形成率与再生率的影响；
[0030] 图10是酶解温度对芽孢杆菌E2原生质体形成率与再生率的影响；
[0031] 图11是酶解时间对乳酸杆菌A2原生质体形成率与再生率的影响；
[0032] 图12是酶解时间对芽孢杆菌E2原生质体形成率与再生率的影响
[0033] 图13是乳酸杆菌A2原生质热灭活曲线；
[0034]图14是芽孢杆菌E2原生质体紫外线灭活曲线；
[0035] 图15是融合子菌株的耐酸耐盐特性分析。
【具体实施方式】
[0036] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施 例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技