一种防治由艰难梭菌所致肠道感染的活菌疫苗及其制备方法和应用的制作方法

专利名称：一种防治由艰难梭菌所致肠道感染的活菌疫苗及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种防治由艰难梭菌所致肠道感染的活菌疫苗及其制备方法和应用，具体涉及一种防治艰难梭菌毒素A阳性的艰难梭菌所致肠道感染的活菌疫苗。
背景技术：
艰难梭菌(clostridium difficile,⑶)是一种革兰氏阳性厌氧芽孢杆菌,是最重要的医院感染的病原体之一。研究表明，临床上约1(T20%的抗生素相关性腹泻和近100%的伪膜性肠炎与此菌有关。艰难梭菌相关性腹湾(Clostridium difficile-associateddiarrhea, CDAD)主要发生于长期服用抗生素者，也可发生于其他影响肠道正常菌群，降低抵抗艰难梭菌定殖的情形，如用抗肿瘤药物、长期住院、免疫缺陷等，特别是那些有免疫功能降低者和/或老年人。CDAD临床表现复杂多样，从无症状携带者到爆发性结肠炎。重症患 者预后差，死亡率高达40%。CDAD的治疗分为抗菌治疗和非抗菌治疗。抗菌治疗中，虽95%的患者对甲硝唑或万古霉素敏感，但5 30%患者停药后易复发，还可造成继发多重耐药菌株感染。非抗菌治疗主要手段之一是采用生态制剂，可作为治疗辅助用药或预防复发。但是，由于抗生素的“无选择性”杀菌作用，使生态菌在CDAD的预防中发挥的作用十分有限。因此，有必要探索新的防治CDAD方法。而有效的疫苗正是防治CDAD最理想的途径和方法。艰难梭菌主要产生两种毒素毒素A和毒素B。毒素B与毒素A基因有一定的同源性，两基因位于C端的重复序列，起结合膜受体作用，N端序列为毒素的酶及毒性作用区。毒素A分子表面结构大部分是由C-末端重复单位构成的，形成了毒素A分子的粘合区域(TxAC314,即14CDTA, 14C_terminal toxin A repeats)。业已证明，针对粘合区域的抗体具有保护作用，可以抑制毒素A的细胞毒性和肠毒性。针对毒素A设计的艰难梭菌疫苗也可以有效地防治A毒素阳性的艰难梭菌感染。国内外对艰难梭菌疫苗研究的技术主要分为以下三类①被动免疫型疫苗如用艰难梭菌菌体或重组毒素经甲醛处理后免疫母鸡，得到蛋黄免疫球蛋白IgY，经纯化后，口服治疗艰难梭菌感染。或者用基因工程的方法表达纯化的针对艰难梭菌毒素的重组单克隆抗体。这一类型疫苗的优点是不仅可预防，还可以作为治疗性疫苗，但成本高，保存运输等不便。②主动免疫型疫苗如将艰难梭菌产毒株培养滤液及菌体分别用福尔马林灭活后，以霍乱毒素作为粘膜佐剂制备的减毒疫苗；还有通过基因重组表达用艰难梭菌毒素A羧基端重复单位作为载体蛋白与其他病源微生物的多糖共价结合构建成疫苗，或者用基因重组技术，在大肠杆菌内表达毒素A与毒素B基因的3'端的重复序列，重组多肽纯化后与多糖结合等基因工程疫苗。这但类疫苗于采用福尔马林处理抗原，或免疫时配合使用佐剂，一些采用侵入性免疫途径(如皮下、腹腔内注射等)，因此，人体应用时不易被患者接受；③口服活菌疫苗，其实也是主动免疫型疫苗的一种。用减毒霍乱弧菌或减毒鼠伤寒杆菌中表达艰难梭菌毒素A羧基端无毒的受体结合区，形成减毒活菌疫苗，通过鼻腔及胃饲活菌，在肺、肠粘膜和血清中产生高滴度的抗毒素A抗体及抗破伤风毒素抗体。这类活菌疫苗的优点是经济、方便，也有较好的免疫保护效果，还可同时做成多介疫苗，但由于目前采用了减毒伤寒菌或霍乱弧菌作为载体菌，于人体应用时其生物安生性值得关注，因而有进一步改进的必要。乳酸链球菌(Streptococcuslactis ；Lactococcus lactis)是一种革兰氏阳性球菌，被认为是一种对人体无害，较为安全的细菌(generally regarded as safe, GRAS)。作为一种食品工业菌，其被广泛应用于乳制品工业。乳链菌近年来被大量用于表达多种生物多肽或蛋白，如表达白介素2 (interleukin 2，IL2)、IL6、ILlO和三叶肽等。由于乳链菌是食品级的细菌，所以重组的乳链菌也被作为一种安全的生物制品的载体。例如，经改造的分泌ILlO的重组乳链菌可以作为活菌口服，直接进入肠道表达ILlO从而抑制炎症反应。乳链菌也被用于口服疫苗的研究工作。如将流产布鲁氏菌(Brucella abortus)的抗原L7/L12与酿胺链球菌(Streptococcus pyogenes)的M6蛋白的膜锚定序列(cell wallanchoring, CffA)连接成融合蛋白表达于乳链菌中,可以使抗原锚定于乳链菌的表面以增加 抗原性，形成抗流产布鲁氏菌感染的食品级的口服活菌疫苗(Food-grade live vaccine)。随着人口老龄化和肿瘤发病率的增加、抗生素等对肠道菌群有影响的药物使用等原因，在临床上艰难梭菌感染率有增加趋势。研究一种新的抗艰难梭菌感染的疫苗是防治艰难梭菌感染的有效手段。但是目前尚无将乳酸链球菌作为表达载体用于艰难梭菌毒素A阳性的艰难梭菌所致肠道感染的活菌疫苗研究中。

发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种防治艰难梭菌毒素A阳性的艰难梭菌所致肠道感染的活菌疫苗，该活菌疫苗经试验验证安全有效。本发明的第二个目的在于提供上述防治艰难梭菌毒素A阳性的艰难梭菌所致肠道感染的活菌疫苗的制备方法，该制备方法具有成本低、可大量制备及工艺简单等优点。本发明的最后一个目的在于提供上述上述防治艰难梭菌毒素A阳性的艰难梭菌所致肠道感染的活菌疫苗在制备具有防治艰难梭菌毒素A阳性的艰难梭菌所致的肠道感染药物中的用途。本发明的第一个目的是通过如下技术方案来实现的一种防治艰难梭菌毒素A阳性的艰难梭菌所致肠道感染的活菌疫苗，所述疫苗含有胸苷酸合成酶ThyA基因缺陷型重组乳酸链球菌。其中，所述的胸苷酸合成酶ThyA基因缺陷型重组乳酸链球菌通过如下方式获得采用表达分泌型的抗艰难梭菌毒素A的融合蛋白取代乳酸链球菌的胸苷酸合成酶ThyA基因序列。所述的表达分泌型的抗艰难梭菌毒素A的融合蛋白通过以下方式获得将乳酸链球菌分泌型蛋白45基因的信号肽序列SPUsp45、艰难梭菌A毒素C末端重复序列14⑶TA和无毒性破伤风毒素C片段序列TETC，按正确的阅读框用基因工程的方法连接形成表达分泌型的抗艰难梭菌毒素A的融合蛋白。更优选的，所述的表达分泌型的抗艰难梭菌毒素A的融合蛋白通过以下方式获得将乳酸链球菌分泌型蛋白45基因的信号肽序列SPUsp45、艰难梭菌A毒素C末端重复序列14CDTA、无毒性破伤风毒素C片段序列TETC和酿脓链球菌M6蛋白的膜锚定序列CWAM6，按正确的阅读框用基因工程的方法连接形成表达分泌型的抗艰难梭菌毒素A的融合蛋白。其中，乳酸链球菌分泌型蛋白45基因的信号肽序列SPUsp45的核苷酸序列如SEQID NO. I所示，氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，艰难梭菌A毒素C末端重复序列14⑶TA的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所 示，氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示，无毒性破伤风毒素C片段序列TETC的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO. 6所示，酿脓链球菌M6蛋白的膜锚定序列CWAM6的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示，氨基酸序列如SEQ IDNO. 8所示。即结合现有的艰难梭菌感染的疫苗研究技术以及乳酸链球菌在活菌疫苗中应用的技术，本发明人采用食品级的乳酸链球菌为抗原蛋白的表达菌(载体)，表达艰难梭菌毒素 A 分子的粘合区域(TxAC314,即 14CDTA, 14C_terminal toxin A repeats)蛋白作为抗原，并将整个重组菌作为口服疫苗刺激机体产生对抗14⑶TA的抗体，用于防治毒素A阳性的艰难梭菌肠道感染。优选的，以乳酸链球菌活菌为疫苗的表达载体，表达艰难梭菌A毒素C末端重复序列(14⑶TA)抗原，共表达无毒性破伤风毒素C片段(TETC)作为疫苗的生物佐剂，以基因工程的方法制备的胸苷酸合成酶(thymidylate synthase, ThyA)基因缺陷型重组乳酸链球菌。即首先将艰难梭菌A毒素C末端重复序列(14CDTA)抗原与无毒性破伤风毒素C片段(TETC)序列形成一种融合蛋白，然后在融合蛋白基因的氨基端(N端，5’端)带有一段乳酸链球菌分泌型蛋白 45 (L. lactis secreted protein (Usp45) gene)基因的信号妝(75-181，GeneBank accessionNo. M60178)序列，作为乳酸链球菌表达融合蛋白的信号肽。也即乳酸链球菌分泌型蛋白45基因的信号肽序列、艰难梭菌A毒素C末端重复序列(14⑶TA)和无毒性破伤风毒素C片段(TETC)序列，按正确的阅读框用基因工程方法连接形成表达分泌型的抗艰难梭菌毒素A的融合蛋白作为抗艰难梭菌口服疫苗的抗原。并采用上述分泌型的抗艰难梭菌A的融合蛋白基因序列替代乳酸链球菌的胸苷酸合成酶基因序列，所制备的胸苷酸合成酶(thymidylate synthase,ThyA)基因缺陷型重组乳酸链球菌将表达分泌型的抗艰难梭菌A的融合蛋白作为疫苗。最佳的，以乳酸链球菌活菌为疫菌的表达载体，表达艰难梭菌A毒素C末端重复序列(14⑶TA)抗原，共表达无毒性破伤风毒素C片段(TETC)作为疫苗的生物佐剂，并共表达酿脓链球菌M6蛋白的膜锚定序列(CWAM6)以增强疫苗的免疫效果，以基因工程的方法制备的胸苷酸合成酶(thymidylate synthase,ThyA)基因缺陷型重组乳酸链球菌。即首先将艰难梭菌A毒素C末端重复序列(14CDTA)抗原与无毒性破伤风毒素C片段(TETC)序列和酿脓链球菌M6蛋白的膜锚定(CWAM6)序列共表达的,形成一种融合蛋白，该融合蛋白作为抗原主要锚定于乳酸链球菌的表面；然后在融合蛋白基因的氨基端(N端，5’端)带有一段乳酸链球菌分泌型蛋白 45 (L. lactis secreted protein (Usp45) gene)基因的信号妝(75-181,GeneBank accession No. M60178)序列，作为乳酸链球菌表达融合蛋白的信号肽。也即乳酸链球菌分泌型蛋白45基因的信号肽序列、艰难梭菌A毒素C末端重复序列(14⑶TA)、无毒性破伤风毒素C片段(TETC)序列和酿脓链球菌M6蛋白的膜锚定(CWAM6)序列，按正确的阅读框用基因工程方法连接形成表达分泌型的抗艰难梭菌毒素A的融合蛋白作为抗艰难梭菌口服疫苗的抗原。并采用上述分泌型的抗艰难梭菌A的融合蛋白基因序列替代乳酸链球菌的胸苷酸合成酶基因序列，所制备的胸苷酸合成酶(thymidylate synthase, ThyA)基因缺陷型重组乳酸链球菌将表达分泌型的抗艰难梭菌A的融合蛋白作为疫苗。所述乳酸链球菌为食品级工业菌。本发明的第二个目的是通过如下技术方案来实现的上述防治艰难梭菌毒素A阳性的艰难梭菌所致肠道感染的活菌疫苗的制备方法，将上述胸苷酸合成酶ThyA基因缺陷型重组乳酸链球菌在含有胸苷的培养基中培养后，获得防治艰难梭菌毒素A阳性的艰难梭菌所致的肠道感染的口服活菌疫苗。所述胸苷的浓度优选为10 30 U M0
所述活菌疫苗的剂型为口服剂。本发明的第三个目的是通过如下技术方案来实现的上述防治艰难梭菌毒素A阳性的艰难梭菌所致肠道感染的活菌疫苗在制备具有防治艰难梭菌毒素A阳性的艰难梭菌所致的肠道感染药物中的用途。
本发明具有如下优点本疫苗的剂型为口服剂，服用方便，便于保存及运输。


图I是实施例I中防治艰难梭菌毒素A阳性的艰难梭菌所致肠道感染的活菌疫苗的构建示意图，其中A是构建14CDTA融合蛋白在乳链菌中共表达单位构建示意图，其将表达一种膜锚锭蛋白是构建乳链菌中thyA基因剔除单位示意图，ThyA-Up:乳链菌ThyA基因上游序列，含有ThyA基因启动子(promoter)和核糖体结合点(ribosomal bindingsite, RBS) ;SPUsp45 :USP45 蛋白的信号肽(Signal peptide ofUsp45) ;14CDTA :艰难梭菌毒素A之无毒性抗原序列；CWAM6 :编码细胞膜M6蛋白序列(sequence encoding the cellwall M6protein), TETC:破伤风无毒性的C片段；ThyA-Down:ThyA基因下游序列，含ThyA基因的终止子；图2是实施例2和3中以质粒表达14⑶TA融合蛋白试验中质粒的构建示意图，其中A为仅含有pTRKH2空白质粒的乳链菌；B为乳链菌的质粒中，包括有表达14CDTA分泌蛋白的元件，包括TETC和14⑶TA，但不表达膜蛋白CWAM6 ;C为乳链菌的质粒中，表达带有膜蛋白CWAM6的14⑶TA融合蛋白，P :为启动子；RBS :核糖体结合点(ribosomal bindingsite) ；SPUsp45 :USP45蛋白的信号妝(Signal peptide of Usp45) ;14CDTA :艰难梭菌毒素A之无毒性抗原序列；CWAM6 :编码细胞膜M6蛋白序列(sequence encoding the cell wallM6protein) ；TETC:破伤风无毒性的C片段；TUSP45为链酸链球菌USP45基因的终止密码子；图3是实施例I中表达系统的设计图(由gene construction kit软件制作)。其中，带下划线的大写为P59启动子，带下划线的大写红色字母分别为-10区及-35区，带蓝色下划线的小写字母为RBS，大写蓝色粗体字母为Usp45蛋白的信号肽部分(SPusp45)，绿色大写字母示多克隆位点(未示终止子部分，另外再行克隆和连接)；图4是实施例I表达系统在大肠杆菌内验证，pNBC2000-EGFP在大肠杆菌中的表达激光共聚焦显微镜观察结果，EGFP经PCR扩增后，亚克隆于pNBC2000载体中，转入大肠杆菌(图E、F)，并以pNBC2000质粒转化的大肠杆菌作为空白对照(图C、D)，pBS-EGFP质粒转化的大肠杆菌作为阴性对照(图A、B)，其中，图A、C、E为荧光图像，而图B、D、F为DIC(微分干涉衬比法)图像，结果表明我们构建的表达系统在大肠杆菌内可以正确表达外源基因；
图5是实施例I表达系统在乳链菌活内验证，PNBCL2000-EGFP在乳链菌中的表达激光共聚焦显微镜观察结果，含有PNBCL2000-EGFP的乳链菌(A、B)，含pNBCL2000的乳链菌(C、D)，其中，图A、C为荧光图像，而图B、D为DIC (微分干涉衬比法)图像图像；图6是重组TETC蛋白在乳链菌的定位表达(丨为分泌表达的TETC，丨为膜锚定表达的TETC M :蛋白质标准；1 :重组乳链菌LL-pNBCL1002总蛋白；重组乳链菌LL_pNBCL1002上清蛋白；3 :重组乳链菌LL-pNBCL2002总蛋白；4 :重组乳链菌LL_pNBCL2002膜蛋白；5 乳链菌LL-pTRKH2总蛋白6 :乳链菌LL_pTRKH2上清蛋白；7 :乳链菌LL_pTRKH2膜蛋白；8乳链菌总蛋白；9 :乳链菌上清蛋白);图7是LL-pNBCL1002，LL-pNBCL2002重组蛋白免疫印迹分析结果(l:LL-pNBCL1002 菌体总蛋白；2:LL_pNBCL1002 上清蛋白；3:LL_pNBCL2002 菌体总蛋白；4:L :L-pNBCL2002 膜蛋白；5:LL_pTRKH2 菌体总蛋白；6:LL_pTRKH2 上清蛋白；7 LL-pTRKH2膜蛋白) 图8重组TETC - 14⑶TA融合蛋白在乳链菌内的表达(丨为分泌表达的TETC —14⑶TA，丨为膜锚定表达的TETC - 14⑶TAM :蛋白质标准；1 :重组乳链菌LL_pNBCL1003总蛋白；重组乳链菌LL-pNBCL1003上清蛋白；3 :重组乳链菌LL_pNBCL2003总蛋白；4 :重组乳链菌LL-pNBCL2003膜蛋白；5 :乳链菌LL_pTRKH2总蛋白6 :乳链菌LL_pTRKH2上清蛋白；7 乳链菌LL-pTRKH2膜蛋白；8 :乳链菌总蛋白；9 :乳链菌上清蛋白);图9LL-pNBCL1003, LL-pNBCL2003重组蛋白免疫印迹分析结果(Lanel:LL-pNBCL1003菌体总蛋白与破伤风抗毒素Lane 2: LL-pNBCL1003上清蛋白与破伤风抗毒素Lane 3:LL_pNBCL1003菌体总蛋白与艰难梭菌A毒素抗体Lane 4:LL_pNBCL1003上清蛋白与艰难梭菌A毒素抗体Lane 5 LL_pNBCL2003菌体总蛋白与破伤风抗毒素Lane 6LL-PNBCL1003膜锚定蛋白与破伤风抗毒素Lane7 LL-pNBCL2003菌体总蛋白与艰难梭菌A毒素抗体Lane 8 LL_pNBCL2003膜锚定蛋白与艰难梭菌A毒素抗体)；图10实施例3中重组乳链菌活菌疫苗接种方案及动物实验时间安排过程图；图11是实施例3中艰难梭菌攻击后各组动物间累积腹泻发生率的比较图；图12是实施例3中艰难梭菌攻击后各组动物间生存率的比较图；图13实施例3中艰难梭菌攻击后各组实验动物间的生存时间及攻击后生存天数比较图；图14是实施例3中艰难梭菌攻击后各组动物间累积死亡率的比较图；图15是实施例3中艰难梭菌攻击前后各组动物间体重的比较图；图16是实施例3中空白对照组金黄地鼠的肠管、肠腔和结肠的显微镜示意图，其中金黄地鼠肠管扩张，肠腔出血，结肠内无成形粪便；图17是实施例3中空白对照组金黄地鼠的盲肠和结肠的显微镜示意图，其中盲肠粘膜出血、水肿并可见部分粘膜缺损，血管纹理消失；相邻的结肠粘膜水肿，溃疡形成；图18是实施例3中LL-pTRKH2组濒死的金黄地鼠肠腔和结肠的显微镜示意图，其中濒死的金黄地鼠肠腔轻度扩张、张力增高，水肿、淤血，结肠内无成形粪便；图19是实施例3中LL-pTRKH2组盲肠的显微镜示意图，其中组盲肠粘膜水肿，散在出血点及糜烂；图20是实施例3中LL-pNBCL2003组及LL_pNBCL1003组肠管和结肠的显微镜示意图，其中这两组肠管不扩张，无明显淤血及出血征象，张力正常，结肠内有成形粪便；图21是实施例3中LL-pNBCL1003组盲肠的显微镜示意图，其中盲肠粘膜无明显水肿，血管纹理清晰；图22是实施例3中LL-pNBCL2003组盲肠的显微镜示意图，其中盲肠粘膜无明显水肿,血管纹理清晰；图23是实施例3中空白对照组金黄地鼠盲肠的显微镜示意图，其中空白对照组粘膜缺损，腺体破坏，广泛出血，粘膜下层水肿，有中等至大量的中性粒细胞浸润；图24是实施例3中LL-pTRKH2组盲肠的显微镜示意图，其中LL_pTRKH2组粘膜缺损较空白对照组轻，粘膜下有少量出血及大量中性粒细胞浸润，脓肿形成； 图25是实施例3中LL-pNBCL1003组盲肠的显微镜示意图，其中LL_pNBCL1003组粘膜上皮轻度受损完整，粘膜下层有大量中性粒细胞浸润，隐窝变浅；图26是实施例3中LL-pNBCL2003组盲肠的显微镜示意图，其中LL_pNBCL2003组粘膜缺损较轻，仅有少量中性粒细胞浸润；图27 是实施例 3 中空白对照组、LL-pTRKH2 组、LL_pNBCL1003 租和 LL_pNBCL2003组大体及组织病理评分比较图，其中a与空白对照组比较p = 0. 000, b与LL-pTRKH2组比较 p = 0. 000，c 与 LL-pNBCL2003 比较 p = 0. 616 ；图28是实施例3中血清及肠液抗艰难梭菌A毒素特异性抗体IgG及IgA检测结果图，其中与空白对照组相比，P < 0.05 ;与非重组质粒乳链菌组相比，P < 0. 000，与 LL-pNBCL1003 相比，P = 0. 116 ;图29是实施例3中抗TETC-14⑶TA血清对艰难梭菌A毒素细胞毒性的影响图，其中A.正常对照组；B. A毒素处理组；C.血清预孵组；D.血清处理组。
具体实施例方式下面结合附图对本发明作进一步阐述，但是本发明的内容并不局限于此。第一部分防治艰难梭菌毒素A阳性的艰难梭菌所致肠道感染的活菌疫苗及其制备过程实施例II.疫苗表达抗原的载体(表达菌)米用乳酸链球菌(Streptococcuslactis ；Lactococcus lactis)作为表达艰难梭菌的14CDTA蛋白分子(抗原)的载体，乳酸链球菌是一种革兰氏阳性球菌，为一种兼性厌氧菌，被认为是一种对人体无害，较为安全的细菌(generally regarded as safe, GRAS),也是一种食品工业菌，被广泛应用于乳制品工业，例如中国工业微生物菌种保藏中心保藏的乳酸链球菌(CICC编号6023)等。乳酸链球菌用M17培养基(Difco，Detroit, Mich)或类似培养基培养，培养于30°C厌氧或需氧的环境中，对于ThyA基因缺陷型乳酸链球菌，在培养基中要加入胸苷(thymidine)，其浓度约为20 y M，M17培养基由Difco公司生产的培养基，只需加入蒸馏水高压后即可使用。2.采用乳酸链球菌表达的艰难梭菌毒素A分子的粘合区域(TxAC314，即14⑶TA，14C-terminal toxin A repeats)蛋白作为抗原的特征如下
2. I 艰难梭菌毒素 A 分子的粘合区域(TxAC314,即 14CDTA, 14C_terminal toxinA r印eats)蛋白是无毒性的，艰难梭菌A毒素C末端重复序列14⑶TA的核苷酸序列如SEQID NO. 3所示,氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。2. 2为利于14⑶TA分子刺激机体产生免疫反应，14⑶TA分子为分泌蛋白形式表达，为达到这一目的，在14⑶TA分子序列的5’端将加上乳链菌分泌型蛋白45 (L. Iactissecreted protein Usp45 gene)的信号肽序列，乳酸链球菌分泌型蛋白45基因的信号肽序列SPUsp45的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示，氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。2. 3为了将表达的分泌型14⑶TA锚定于乳酸链球菌的表达，以增强抗原性，在构建表达膜锚定蛋白的基因来自酿脓链球菌的e_6基因中编码M6蛋白的膜锚定序列(CffAM6) (1479-2111, GeneBank accession No. M11338)，其酿脓链球菌 M6 蛋白的膜锚定序列CWAM6的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示，氨基酸序列如SEQ ID NO. 8所示。2. 4为了增强机体对于14⑶TA的免疫反应，除将14⑶TA锚定于乳酸链球菌表面夕卜，加强14CDTA的抗原性是十分重要的技术步骤，本疫苗采用的一种生物疫苗，即无毒性 破伤风毒素 C 片段(TETC)的序列(GeneBank accession no. M12739, 367-1719)，但为了有利于TETC在乳链菌内的表达，根据乳链菌的密码子，设计TETC的基因序列，用于本疫苗的TETC核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO. 6所示。3.重组活菌疫苗的构建3. I乳链菌表达表达系统的构建3. I. I乳链菌分泌型表达系统的序列及获得选用适合于乳链菌中使用的乳酪链球菌(Lactococcus lactis subsp. cremoris)的启动子 59 (promoter 59, p59) (GeneBankaccession No. M24806,)作为启动子，选用乳链菌分泌型蛋白45 (L. lactis secretedprotein Usp45 gene)的核糖体结合位点(Ribosome binding site, RBS)和信号妝(75-181, GeneBank accession No. M60178)序列作为RBS和信号肽；在信号肽后插入多克隆位点，设计乳链菌分泌表达系统序列，核苷酸序列如SEQ ID NO. 9及图3所示序列使用软件DNASTAR 5. 0，每40bp的寡核苷酸的长度设计I条寡核苷酸，使相邻的两条寡核苷酸有20bp相互互补，采用基因拼接的方法获得全长341bp的序列PU (详细方法见杨晓强，彭春秀，姜泊，邢锐，张绍荣，陈学清.乳链菌表达系统的构建及其鉴定[J].第一军医大学学报，2005，25 (10):1232 1235.)。3. I. 2扩增USP45基因的终止子以质粒pVE5247 (含USP45信号肽及终止子，由法国INRA科学家J.-C. Piard博士赠送)为模板，扩增USP45基因的终止子(Tusp45)作为表达系统PNBC1000的终止子，设计如下引物上游引物Tl加入BamH I位点5’GAGGATCCAAAAAAGTCTTAATAAAT 3’(黑体为 BamH I 位点)，下游引物 T2 加入 Xba I 及 SacI 位点5’TGGAGCTCTCTAGATAAAAAATGAITTGACAG 3’，(黑体为 Sac I 位点，带下划线序列为Xba I位点)(详细方法见杨晓强，彭春秀，姜泊，邢锐，张绍荣，陈学清.乳链菌表达系统的构建及其鉴定[J].第一军医大学学报，2005，25 (10) :1232 1235.)。3. I. 3组装分泌表达系统pNBClOOO将基因拼接产物I3U以Eco0109I及BamH I酶切3h，琼脂糖凝胶电泳回收后取7 ii L(约50ng)与I y L(约15ng)以相同酶进行酶切并凝胶电泳回收的pBluescript II SK(+)质粒用T4DNA连接酶室温下连接5h。连接产物转化E. coli T0P10感受态细胞，平铺于已涂有40mmol/L IPTG，20% X_gal的含75 y g/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37°C培养过夜。通过蓝白斑筛选重组质粒，以含IOOy g/mL氨苄青霉素的LB液体培养基培养12h后，用常规的质粒提取试剂盒提取质粒，通过Xba I酶切鉴定筛选出含有目的片断的重组质粒，命名为pBS-PU，将TUSP45连接至pBS-PU，构建成PNBC1000,由上海博亚生物技术有限公司采用Sanger’ s双脱氧末端终止法，用M13正向通用弓I物对重组质粒进行核酸序列测定。3. I. 4M6蛋白膜锚定序列(CWAM6)扩增以质粒pVE5207(由法国INRA科学家J. -C.Piard博士赠送)中的emm6基因为模板，设计并合成PCR引物，在上游引物设计BamH I位点，下游引物5’加入Sal3’下游引物(EM3) :5’ CCGTCGACTTAGTTTTCTTCTTTGCG 3’，用灭菌双蒸水配制成 20 u mo I/L 浓度，通过PCR扩增CWAM6。(详细方法见杨晓强，彭春秀，姜泊，邢锐，张绍荣，陈学清.乳链菌表达系统的构建及其鉴定[J].第一军医大学学报，2005，25 (10) :1232 1235.)。3. I. 5 重组质粒 pNBC2000 构建 将CWAM6 以 BamH I 及 Sal I 酶切 3h，回收后取 7 y L (约 50ng)与 I ii L (约 15ng)以BamH I、Xho I进行酶切并凝胶电泳回收的pET_22b (+)质粒用T4DNA连接酶室温下连接5h，以消除Sal I及Xho I位点。连接产物转化E. coli TOPlO感受态细胞，平铺于含75 u g/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37°C培养12h。挑取重组质粒，以LB液体培养基培养12h后，用常规的质粒提取试剂盒提取质粒，通过BamH I和Bpull021酶切鉴定筛选出含有目的片断的重组质粒，命名为PET-M6，以pET-M6为模板，以原上游引物EM5作为上游引物，TGGAGCTCTCTAGACAAAAAACCCCTCAAGA (黑体为Sac I位点，带下划线的为Xba I位点)为下游引物M6down，反应体系中其它成分及反应条件与前相同，扩增其后带有组氨酸标签及17终止子的CWAM6基因，经BamH I及Sac I双酶切后连接到经相同酶切的质粒pBS_PU，构建成pNBC2000，经Xba I酶切鉴定后，由上海博亚生物技术有限公司采用Sanger’s双脱氧末端终止法测序。3. 2乳链菌表达系统在大肠杆菌内的验证3. 2. IEGFP基因的扩增以pEGFP-Nl为模板，设计I对引物扩增EGFP基因，上游引物设计EcoRI位点，下游引物 5 ’ 加入 BamH I 位点，上游引物(EGFPI) : 5 ’ GGGAATTCTCGCCACCATGGTGAGCAA3 ’，下游引物(EGFP2) :5’GGGGATCCGTCTTGTACAGCTCGTCCA3’，以扩增增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因。3. 2. 2EGFP表达载体的构建及在大肠杆菌内的鉴定EGFP基因扩增并纯化后用EcoR I和Bam HI酶切3小时，连入以相同酶切的质粒pNBC2000及pBluescript II SK(+),并转化至E. coli ToplO,重组质粒经酶切验证后分别命名为pNBC2000-EGFP，pBS-EGFP，分别将含有pNBC2000_EGFP质粒、pNBC2000质粒的E. coli ToplO加入含有氨苄青霉素IOOii g/mL的LB培养基中，37°C培养过夜，次日各取IOu L菌液均匀涂布于载玻片上，盖上盖玻片，以中性树脂封片，锡纸包裹，进行激光聚焦显微镜观察(结果见图4)。3. 3乳链囷表达系统在乳链囷内的验证以Xba I分别将pNBC2000中的P59启动子、USP45信号肽基因、多克隆位点、M6蛋白基因及17终止子及pNBC2000-EGFP中的P59启动子、USP45信号肽基因、EGFP基因、M6蛋白基因及17终止子切下，并通过后电泳回收这些片段，分别连接至经Xba I单酶切及CIAP去磷酸化处理的E. coli及乳链菌穿梭质粒pTRKH2，转化至E. coli T0P10,提取质粒以Xba I单酶切进行鉴定，阳性质粒分别命名为PNBCL2000，pNBCL2000_EGFP。取
2u LpNBCL2000, pNBCL2000-EGFP质粒分别加入40 y L乳链菌感受态细胞内，通过电穿孔转化至乳链菌。随后均匀平铺于含I U g / mL红霉素的SR固体培养基上30°C连续培养3天。提取乳链菌的质粒DNA。用Xba I对所提取的质粒进行单酶切鉴定。采用激光共聚焦显微镜观察EGFP定位表达情况，将含有pNBCL2000-EGFP质粒、pNBCL2000质粒的乳链菌加入含有红霉素5 u g/mL的GM17液体培养基中，30°C培养16h，次日各取10 y L菌液均匀涂布于载玻片上，盖上盖玻片，以中性树脂封片，锡纸包裹，进行激光聚焦显微镜观察(结果见图5)。3. 4艰难梭菌A毒素羧基末端基因重复序列(14⑶TA)在乳链菌内的表达3. 4. I艰难梭菌A毒素羧基末端基因重复序列(14⑶TA)的扩增及TA克隆、测序 提取艰难梭菌基因组DNA，参照Genbank序列选择设计引物，上游引物TXAl :5' CCCTCGAGGCCTCAACTGGTTATACAAGTATTAA 3'(下划线示 Xho I 酶切位点)下游引物 TXA2:5'TCAAGCTTTAGGGGCTTTTACTCCATCAACAC 3'(下划线示 Hind III 酶切位点)。扩增 14CDTA，使用TA克隆试剂盒进行TA克隆，获得的阳性克隆命名为pTA-Toxin_A，由上海博亚生物技术有限公司采用Sanger’ s双脱氧末端终止法，用17正向及SP6通用引物对重组质粒进行核酸序列测定。测序通过NCBI网络时行Blast分析。3. 4.2 14⑶TA乳链菌表达载体的构建以Xho I、Hind III将14CDTA基因从测序正确的pTA_Toxin_A质粒切下，定向克隆至经相同酶切的载体PNBC1000及pNBC2000，平铺于含75 y g/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37°C培养12h。挑取重组质粒，以LB液体培养基培养12h后，用常规的质粒提取试剂盒提取质粒，以Xho I、Hind III酶切鉴定重组质粒，分别命名为pNBClOOl，pNBC2001，以Xba I将p59启动子、USP45蛋白的信号肽基因、14⑶TA基因、USP45蛋白的终止子从质粒pNBClOOl切下，将p59启动子、USP45蛋白的信号肽基因、14⑶TA基因、M6膜锚定蛋白基因、17终止子从质粒pNBC2001切下，分别与经Xba I单酶切并经CIAP去磷酸化处理的质粒PTRKH2进行连接，转化至E. coli ToplO，铺于含125 y g / ml红霉素的LB琼脂培养基，37°C培养12-16h，挑取菌落，以含红霉素150iig / ml的LB液体培养基培养ia后，用常规的质粒提取试剂盒提取质粒，以Xba I酶切鉴定重组质粒，阳性克隆子分别命名为PNBCL1001，PNBCL2001。各取 2u L pNBCL1001、pNBCL2001、pTRKH2 (约 I ii g)质粒分别加入 40 u L 乳链菌感受态细胞内，电穿孔转化至乳链菌内，提取乳链菌内的质粒进行酶切鉴定。3. 4.2 14⑶TA在乳链菌内的定位表达分别提取含有质粒pNBCLlOOl、pNBCL2001、pTRKH2的乳链菌的上清蛋白及膜蛋白，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western-blot实验，具体方法见文献(杨晓强，赵亚刚，孙大勇，姜泊，陈学清.艰难梭菌A毒素受体结合区基因在乳链菌中的表达.第四军医大学学报，2009，30(18):1676 1680.)3. 5破伤风毒素C片段(TETC)在乳链菌内的表达3. 5. ITETC基因序列的设计及获得根据TETC 的序列(GeneBank accession no. M12739, 367-1719),结合乳链菌对一些密码子的喜好，设计所用拼接的TETC基因序列，在TETC的5’端加上Sal I酶切位点，3’端加上Xho I和Hind III酶切位点。(核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，氨基酸序列如SEQID NO. 6所示。)；使用软件DNASTAR 5. 0，每40bp的寡核苷酸的长度设计I条寡核苷酸，使相邻的两条寡核苷酸有20bp相互互补，采用基因拼接的方法获得全长1383bp的序列(详细方法见杨晓强，武金宝，姜泊，赵亚刚，陈学清.体外拼接破伤风毒素C片段基因[J].南方医科大学学报，2008，28 (3) : 363 365，369 369.)。3. 5. 2TETC乳链菌表达载体的构建将TETC基因以Sal I和Hind III双酶切后连接至经相同酶切的质粒pBluescript
IISK(+)，连接产物转化E. coli TOPlO感受态细胞，提取阳性克隆的质粒，通过Sal I和Hind III双酶切鉴定筛选出含有目的片断的重组质粒，命名为pBS-TETC，由上海博亚生物技术有限公司采用Sanger’s双脱氧末端终止法,用M13正向及M13反向通用引物对重组质粒进行核酸序列测定。
以Sal I.Hind III将TETC基因从测序正确的pBS_TETC质粒上切下，定向克隆至经Xho I和Hind III酶切的载体pNBClOOO及pNBC2000 (以消除Xho I及Sal I酶切位点)，转化至E.coli ToplO，阳性克隆提取质粒，以Xba I单酶切鉴定重组质粒，分别命名为PNBC1002, pNBC2002,以Xba I将p59启动子、USP45蛋白的信号肽基因、TETC基因、USP45蛋白的终止子从质粒PNBC1002切下，将p59启动子、USP45蛋白的信号肽基因、TETC基因、M6膜锚定蛋白基因、T7终止子从质粒pNBC2002切下，分别与经Xba I单酶切并经CIAP去磷酸化处理的质粒PTRKH2进行连接，转化E. coli ToplO，以Xba I酶切鉴定重组质粒，阳性克隆子分别命名为PNBCL1002，pNBCL2002。将pNBCL1002，pNBCL2002电穿孔转化乳链菌，获得的重组乳链菌分别称为LL-pNBCL1002及LL_pNBCL2002，提取重组乳链菌质粒进行酶切鉴定后分别提取重组乳链菌的分泌蛋白及膜锚定蛋白，进行蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western-blot实验。(结果见图6,图7，详见杨晓强,赵亚刚,孙大勇，等.破伤风毒素C片段在乳链菌内的表达.广东医学，2011，32 (7) :1644 1647.)3. 6TETC 一 14⑶TA融合蛋白乳链菌表达载体的构建以Xho I、Hind III将14CDTA基因从测序正确的pTA_Toxin_A质粒切下，定向克隆至经相同酶切的载体PNBC1002及pNBC2002，转化至E. coli ToplO，提取阳性克隆质粒以Xho I、Hind III酶切鉴定重组质粒，分别命名为pNBC1003、pNBC2003,以Xbal、ApaLI 对 pNBC1003 和 pNBC2003 进行双酶切(因 pNBC1003、pNBC2003 用 Xba I 切下的片段与pBluescript II SK(+)大小相近,在琼脂糖凝胶电泳时不能分开，因而用ApaLI将pBluescript II SK(+)切成较小的片段，大片段则为要回收的目的片段)，分别回收带有P59启动子、USP45蛋白的信号肽基因、TETC基因、14⑶TA基因、USP45蛋白的终止子的片段和带有P59启动子、USP45蛋白的信号肽基因、TETC基因、14CDTA基因、M6膜锚定蛋白基因、17终止子的片段，分别与经Xba I单酶切并经CIAP去磷酸化处理的质粒pTRKH2进行连接，转化E.coli ToplO。以Xba I酶切鉴定重组质粒，阳性克隆子分别命名为pNBCL1003，PNBCL2003。通过电穿孔将pNBCL1003，pNBCL2003转化到乳链菌，提取乳链菌质粒以XbaI酶切鉴定提取的质粒。得到带有质粒PNBCL1003的乳链菌(LL 一 pNBCL1003)和带有质粒pNBCL2003的乳链菌(LL 一 pNBCL2003)。提取重组乳链菌LL 一 pNBCL1003及LL 一PNBCL2003的培养上清蛋白及膜锚定蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western-blot检测重组蛋白表达。(结果见图8，图9。)
3. 7thyA基因缺陷的重组乳链菌的获得构建的表达分泌型14⑶TA是一种基因重组蛋白，其包括了乳酸链球菌USP45基因的信号肽部分，也包括了酿脓链球菌的e_6基因中编码M6蛋白的膜锚定序列和无毒性破伤风毒素C片段，共同构成一个基因表达单位(以下称14CDTA基因表达单位)，其结构示意图见图I中A。用细菌表达蛋白常采用质粒转化的方法。也就是说将目的基因插入细菌的表达质粒载体中，进一步将质粒转化细菌，根据质粒的抗药性等标记来筛选用带有质粒的阳性细菌。由带有质粒的阳性细菌进行目的基因的翻译和表达。但是这种带有质粒的细菌作为疫苗是不安全的，对环境也可能造成生物污染。因此，需要构建不带有质粒的且能表达14⑶TA基因表达单位的乳酸链球菌，同时这种乳酸链球菌在体外自然环境中是不能生存的。为了达到这一目的，本疫苗采用将14⑶TA基因表达单位完全替代乳酸链球菌基因组中的thyA基因。由于自然环境中缺乏胸苷，而肠道中有一定浓度的胸苷，因此thyA基因缺陷型乳酸 链球菌在自然环境中不能生存，不会造成生物污染。表达14⑶TA基因表达单位的thyA基因缺陷型乳酸链球菌的技术步骤如下3. 7. IthyA基因缺陷质粒的构建用聚合酶链式反应(PCR)技术克隆乳酸链球菌thyA基因的上游(简称thyA_up)及下游(简称thyA-down)各1000_1500bp的基因片段；用基因克隆技术将构建好的表达14⑶TA基因表达单位体外插入到thyA-up和thyA_down之间，构建成thyA基因剔除单位(如图I中B所示)；具体方法如下提取乳链菌，基因DNA，设计 Up 上游引物 Upl 5' GGAAGCTTCATTCTCCCAAGATTTCTCCTGTAAAA 3丨(粗体示Hind III酶切位点)及下游(2)将上述培养物稀释接种于固体的不含任何抗性但含有胸苷的固定M17培养基因中，挑选出单个乳酸链球菌克隆。用质粒提取、红霉素抗性培养和不含胸苷培养等方法鉴定所挑选的单个乳酸链球菌克隆不带有任何质粒和抗性，且乳酸链球菌不能合成胸苷。这将表面所获得的重组乳酸链球菌中的thyA基因，通过基因剔除技术，被14CDTA基因表达单位所替代了；(3)进一步将上述所筛选出的重组乳酸链球菌用PCR和体外基因测序方法鉴定14CDTA基因表达单位替代thyA基因产生的剔除结果的可靠性；(4)将筛选出的多个且经鉴定含有目的基因(14⑶TA)重组乳酸链球菌在不含任何抗生并含胸苷的培养液中进行培养，用蛋白印迹电泳和酶联免疫法检测乳酸链球菌及培养物中14CDTA的表达量，筛选出高表达重组乳酸链球菌菌株；(5)可进一步将重组乳酸链球菌表达的14⑶TA蛋白复合物纯化，并且质谱的方法验证蛋白质表达的正确性。3.给药途径及实施方法本疫苗的给药途径为口服，表达14⑶TA的重组乳酸链球菌可以以冻干形成保存，口服后在肠道繁殖一段时间以活菌形式刺激肠道产生抗体。第二部分防治艰难梭菌毒素A阳性的艰难梭菌所致肠道感染的活菌疫苗的用途实施例2重组乳链菌活菌疫苗在金黄地鼠肠道内定植
为了观察表达14CDTA的重组乳链菌口服疫苗即采用实施例I中方法构建出来的分泌表达带有TETC作为生物佐剂的14⑶TA及膜锚定表达带有TETC作为生物佐剂的14CDTA的两种重组乳链菌，)对防治艰难梭菌感染的防治作用，采用穿梭质粒PTRKH2作为载体，在乳链菌中表达14⑶TA融合蛋白，在实验中采用乳酪链球菌(Lactococcus lactissubsp. cremoris)的启动子 59 (promoter 59,p59) (GeneBank accession No.M24806,)作为启动子，选用乳链菌分泌型蛋白45 (L. lactis secreted protein (Usp45) gene)的RBS和信号妝(75-181，GeneBank accessionNo. M60178)序列作为RBS和信号月太;选用Usp45基因的终止子作为终止子(1514-1553, GeneBank accession No. M60178);在信号肽后插A 14CDTA表达单位，表达质粒构建的示意图如图2，其中A为仅含有pTRKH2空白质粒的乳链菌为乳链菌的质粒中，包括有表达14⑶TA分泌蛋白的元件，包括TETC和14⑶TA，但不表达膜蛋白CWAM6 ；C为乳链菌的质粒中，表达带有膜蛋白CWAM6的14⑶TA融合蛋白，P 为启动子；RBS :核糖体结合点(ribosomal binding site) ;SPUsp45 :USP45蛋白的信号肽 (Signal peptide ofUsp45) ;14Q)TA :艰难梭菌毒素A之无毒性抗原序列；CWAM6 :编码细胞 膜 M6 蛋白序列(sequence encoding the cell wall M6protein) ；TETC:破伤风无毒性的C片段；TUSP45为链酸链球菌USP45基因的终止密码子。(I).接种前金黄地鼠粪便乳链菌分离培养；将大鼠粪便称重并用小量无菌PBS重悬后倍比稀释，接种于筛选LC平皿中，在鉴定后进行菌落的计数(熊德鑫，等。临床厌氧菌的检验手册。中国科学技术出版社。北京。1994年第I版)。此步骤为证实接种前金黄地鼠肠道内是否有乳链菌定植。(2).采用灌胃的方法将5 X IO9CFU重组乳链菌(分别为分泌表达带有TETC作为生物佐剂的14⑶TA的乳菌LL-PNBCL1003图2中B所示，和膜锚定表达带有TETC作为生物佐剂的14⑶TA的组乳链菌LL-PNBCL2003，图2中C所示)及非重组乳链菌(含有非重组质粒PTRKH2的乳链菌LL-pTRKH2，图2中A所示)接种金黄地鼠；(3).接种I周后从粪便中分离培养乳链菌；将大鼠粪便称重并用小量无菌PBS重悬后倍比稀释，接种于筛选LC平皿中，在鉴定后进行菌落的计数(熊德鑫，等。临床厌氧菌的检验手册。中国科学技术出版社。北京。1994年第I版)。(4).以德国Biocam公司生产的艰难梭菌A毒素抗体检测接种金黄地鼠肠液中重组14⑶TA表达情况，采用ELISA法。结果如下(5)接种前所有金黄地鼠均未能培养出乳链菌，接种I周后重组乳链菌组及非重组乳链菌组均分离培养出乳链菌，分泌表达14⑶TA的乳链菌为6. 2X107CFU、膜锚定表达14⑶TA的乳链菌为6. 5X 107CFU、非重组质粒乳链菌为5. 9 X IO7CFU,各组间比较无统计学意义；(6)ELISA法检测显示分泌表达14⑶TA的滴度为3. 2±0. 8X 102，膜锚定表达14⑶TA的滴度为6. 3±1. I X 102，而非重组乳链菌组滴度为O。实施例3重组乳链菌活菌疫苗对防治艰难梭菌性肠炎的作用分泌表达带有TETC作为生物佐剂的14CDTA的乳菌LL-PNBCL1003、膜锚定表达带有TETC作为生物佐剂的14⑶TA的组乳链菌LL-PNBCL2003及非重组乳链菌(含有非重组质粒pTRKH2的乳链菌LL-pTRKH2的构建过程同实施例2。I.实验分组及免疫方法取32只体重100-130克的雄性叙利亚金黄地鼠(以下简称金黄地鼠)，随机分为4个实验组，每组8只，第I组(8只)给予生理盐水灌胃作为空白对照组，第2组(8只)给予非重组质粒乳链菌(LL-pTRKH2)作为阳性对照(图2A)，第3组(8只)给予分泌表达14CDTA的乳链菌(LL-pNBCL1003)(图2B)，第4组(8只)给予膜锚定表达14⑶TA的乳链菌(LL-pNBCL2003)(图2C)，采用灌胃的方式进行免疫，各乳链菌组均给予5X IO9CFU乳链菌灌胃(0D600约为I. 0)，以含有5%酪蛋白水解物、0. 5%葡萄糖的0. 2M碳酸氢钠将带有不同质粒的乳链菌制成5X 109CFU/mL的细菌悬液，分别于第0、1、2、7、14，23天给不同组别的金黄地鼠灌胃，于第7、14天灌胃前分别进行肠道菌群分析一次(如图3所示)。2.第15天艰难梭菌攻击实验接种后15天起各组金黄地鼠给予盐酸克林霉素IOmg灌胃，连续给药I周，期间进行肠道菌群分析及艰难梭菌分离培养，以确定有无菌群失调及艰难梭菌感染，最后I次给药后4小时给予4X IO5CFU的艰难梭菌约进行攻击，攻击前称量金黄地鼠的体重，攻击后72小时内每4小时观察I次，并对粪便进行艰难梭菌分离培养及乳链菌分离培养，此后每日观察4次，详细观察实验动物的粪便，肛周，活动，皮毛形态、光泽、精神状况，并进行评分。3.评价指标3. I以各组死亡率、腹泻发生率、攻击前后体重变化，生存时间来评价重组乳链菌对感染动物模型的保护作用；3. 2解剖各组实验动物，肉眼观察腹腔及肠管病变情况，取盲肠及结肠组织各一部分，沿纵轴剪开，用4°C生理盐水将肠腔内容物冲洗干净后，取IOOmg肠粘膜组织立即匀浆进行艰难梭菌分离培养及乳链菌分离培养；200mg肠粘膜组织立即冻存于-70°C冰箱以便提取肠组织总RNA及肠上皮细胞总蛋白、胞浆蛋白和核蛋白； 3. 3以实体镜及解剖显微镜观察各肠段大体病理变化，随后置于10%中性甲醛内固定、包埋、切片、HE染色，行一般组织病理学观察；3. 4采用ELISA检测的血清及肠道组织及肠液中产生的抗艰难梭菌A毒素羧基未端重复片段14CDTA抗体的滴度，进行免疫学评价；3. 5通过观察血清对艰难梭菌A毒素对CHO-Kl细胞毒性的中和作用，来评价金黄地鼠口服疫苗后血清中产生的抗14CDTA抗体对艰难梭菌A毒素的细胞毒性的拮抗作用；3. 6流式细胞仪检测血清对艰难梭菌A毒素诱导肠上皮细胞调亡的抑制作用。4.结果4. I腹泻发生率腹泻发生率各组相比均有统计学意义(P = 0. 000,图4)其中空白对照组及LL - pTRKH2组最高，LL-pNBCL2003组最低；4. 2死亡率及生存时间与空白对照组相比，其它组的死亡率均明显低于空白对照组生存率及生存时间均高于空白对照组(P < 0. 001，图5和图6)，而重组乳链菌组死亡率均低于LL - pTRKH2组(P = 0. 000,图7)，生存时间及攻击后生存时间均高于LL 一 pTRKH2组，但无统计学意义(P=0. 881，图8);4. 3攻击前后体重变化各乳链菌组均高于空白对照组(P<0. 001，图8)，而重组乳链菌组均高于LL - pTRKH2组(P = 0. 000,图8)，两种重组乳链菌之间无统计学意义(P =0.365，图8)。其中a为与空白对照组比较，p=0. 001 ；b,与LL_pTRKH2组比较，p=0. 000 ；c,与LL-pNBCL1003组比较，p=0. 365 ；d,各组间相互比较，p=0. 843。4. 4大体病理观察空白对照组金黄地鼠于攻击后第2天呈现肛周、脚爪、下腹部潮湿，蜷缩，不活动，平衡感消失，皮毛耸动绉乱，对刺激反应减弱等濒死表现，处死后可见盲肠扩张，肠腔出血(图9)，沿肠管纵轴剖开，可见肠腔内广泛出血病灶(图10)，部分病灶有粘膜缺损，病变以盲肠及结肠上段最重，小肠轻度扩张，较结肠略增粗，直肠病变轻微，结肠内无成形粪便。LL-PTRKH2组于攻击后第2天有I只出现濒死状态，处死后可见盲肠轻度扩张，肠粘膜充血(图11)，剖开肠腔，肠粘膜内有少量出血病灶，粘膜充血水肿明显，肉眼可见散在糜烂(图12)。结肠内无成形粪便，于实验结束时处死的LL-pTRKH2组金黄地鼠盲肠无扩张，肠粘膜无充血，仍有腹泻的金黄地鼠的肠粘膜轻度水肿，结肠内无成形粪便，已停止腹泻的金黄地鼠的肠粘膜无水肿，结肠及直肠内可见成形的粪便。LL-pNBCL1003组与LL_pNBCL2003组(图13)于实验结束时处死的金黄地鼠肠管无扩张，肠粘膜无充血、水肿(图14，15)，结肠及 直肠内均有成形粪便。4. 5组织病理学改变空白对照组粘膜缺损，腺体破坏，广泛出血，粘膜下层水肿，有中等至大量的中性粒细胞浸润。(见图16)，LL-pTRKH2组粘膜缺损较空白对照组轻，粘膜下有少量出血及大量中性粒细胞浸润，脓肿形成(见图，17)。LL-pNBCL1003组粘膜上皮轻度受损完整，粘膜下层有大量中性粒细胞浸润，隐窝变浅(见图18)，LL-pNBCL2003组粘膜缺损较轻，仅有少量中性粒细胞浸润(见图19)。空白对照组、LL-pTRKH2组、LL-pNBCL1003组和LL_pNBCL2003组各组大体及组织病理图评分比较见图20，其中与空白对照组相比，P < 0. 05 ;与非重组质粒乳链菌组相比，P < 0. 000，与 LL-PNBCL1003 相比，P = 0. 116。4. 6艰难梭菌及乳链菌的分离培养攻击前，各组实验动物的粪便中均未分离培养出艰难梭菌，空白对照组金黄地鼠的腹泻粪便及肠组织匀浆培养出艰难梭菌，LL - PTRKH2组有3只金黄地鼠的腹泻粪便分离培养出艰难梭菌，其中有I只金黄地鼠的肠组织匀浆培养出艰难梭菌。LL-pNBCL1003组发生腹泻的2只金黄地鼠的粪便中分离培养出艰难梭菌，但肠组织匀浆未分离出艰难梭菌。LL-pNBCL2003组中有I只金黄地鼠的粪便中亦分离出艰难梭菌，肠组织匀浆未分离培养艰难梭菌。连续给予盐酸克林霉素IOmg灌胃I周后各组动物均未分离出乳酸菌(包括乳链菌、乳杆菌及乳球菌)及双歧杆菌，并出现了真菌，呈现出III度菌群失调，攻击后第2天(即第23天)再次给予乳链菌加强免疫后，攻击后第3天LL-pTRKH2组存活的金黄地鼠及LL-pNBCL1003组、LL_pNBCL2003组金黄地鼠的粪便中均分离培养出乳链菌，但攻击后第14天较第7天分离培养的乳链菌减少，LL-pTRKH2组存活的金黄地鼠及LL_pNBCL1003组、LL-PNBCL2003组肠粘膜匀浆均培养出乳链菌，但LL_pTRKH2组肠粘膜尚分离培养出艰难梭菌。4. 7血清及肠液抗艰难梭菌A毒素抗体水平将试剂盒所能检测的最小浓度定为I个滴度，各样本最大稀释度即为该样本的滴度。结果各组血清及肠液均产生了抗艰难梭菌A毒素的IgG、IgA抗体，LL-pNBCL2003组血清产生I. 5X IO4滴度的抗艰难梭菌A毒素IgG抗体，6. 7X IO2滴度的IgA抗体，肠液产生I.45 X IO4滴度的抗艰难梭菌A毒素IgG抗体，I X IO2滴度的IgA抗体；LL_pNBCL1003组血清产生9. 5 X IO3滴度的抗艰难梭菌A毒素IgG抗体，5. 6 X IO2滴度的Ig A抗体，肠液产生
9.5 X IO3滴度的IgG抗体，7. 5 X IO1滴度的IgA抗体；LL — pTRKH2组血清产生2. 4 X IO3滴度的抗艰难梭菌A毒素IgG抗体，3. 6 X IO2滴度的IgA抗体，肠液产生3. 5 X IO3滴度的IgG抗体，7. 5 X IO1滴度的IgA抗体，空白对照组金黄地鼠血清产生6 X IO2滴度的IgG抗体，2 X IO2滴度的IgA抗体，肠液产生7. 3 X IO2滴度的IgG抗体，6. 3 X IO1滴度的IgA抗体。重组乳链菌组血清及肠液IgG滴度均明显高于空白对照组及空质粒对照组(P < 0. 000),血清IgA高于空白对照组(P < 0. 05)，肠液IgA虽高于空白对照组，但无统计学意义(见图21)。4. 7毒素中和实验光镜下观察，正常对照组细胞大小均匀一致，呈梭形，增殖期细胞呈圆形，但细胞核正常，经过艰难梭菌A毒素处理后，细胞由梭形变为圆形，大小不等，核固缩、碎裂、溶解， 血清预孵组细胞略变圆，但仍可看出梭形形态，血清处理组细胞部分细胞变圆、缩小，核固缩，部分细胞仍略呈梭形。4. 8流式细胞术检测抗14CDTA血清对艰难梭菌A毒素诱导的肠上皮细胞调亡的抑制作用流式细胞术结果显示，艰难梭菌A毒素处理组细胞大量死亡，占细胞总数的41. 59%，调亡细胞占18. 34%，血清预孵组死亡细胞占7. 39%，调亡细胞占6. 47%，血清处理组死亡细胞占12%，调亡细胞占8. 78%，正常对照组死亡细胞占3. 9%，调亡细胞占3. 87% (见图22)。4. 9RT-PCR 检测 ICAM-1、MCP-1、IL_6、Gro-I 等致炎细胞因子 mRNA 的表达LL-pNBCL2003组各种致炎因子的mRNA的表达显著低于其它各组比较(P
<0. 05) ；LL-pNBCL1003组各种致炎因子的mRNA的表达低于空白对照组及LL_pTRKH2组(P
<0. 05) ；LL-pTRKH2 组 ICAM-1、MCP-I 的表达低于空白对照组，LL_pTRKH2 组 IL-6、Gro-I的表达高于空白对照组，但没有统计学意义(P > 0. 05)。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。
权利要求
1.一种防治艰难梭菌毒素A阳性的艰难梭菌所致肠道感染的活菌疫苗，其特征是所述疫苗含有胸苷酸合成酶ThyA基因缺陷型重组乳酸链球菌。
2.根据权利要求I所述的防治艰难梭菌毒素A阳性的艰难梭菌所致肠道感染的活菌疫苗，其特征是所述的胸苷酸合成酶ThyA基因缺陷型重组乳酸链球菌通过如下方式获得采用表达分泌型的抗艰难梭菌毒素A的融合蛋白取代乳酸链球菌的胸苷酸合成酶ThyA基因序列。
3.根据权利要求2所述的防治艰难梭菌毒素A阳性的艰难梭菌所致肠道感染的活菌疫苗，其特征是所述的表达分泌型的抗艰难梭菌毒素A的融合蛋白通过以下方式获得将乳酸链球菌分泌型蛋白45基因的信号肽序列SPUsp45、艰难梭菌A毒素C末端重复序列14⑶TA和无毒性破伤风毒素C片段序列TETC，按正确的阅读框用基因工程的方法连接形成表达分泌型的抗艰难梭菌毒素A的融合蛋白。
4.根据权利要求2所述的防治艰难梭菌毒素A阳性的艰难梭菌所致肠道感染的活菌疫苗，其特征是所述的表达分泌型的抗艰难梭菌毒素A的融合蛋白通过以下方式获得将乳酸链球菌分泌型蛋白45基因的信号肽序列SPUsp45、艰难梭菌A毒素C末端重复序列14CDTA、无毒性破伤风毒素C片段序列TETC和酿脓链球菌M6蛋白的膜锚定序列CWAM6，按正确的阅读框用基因工程的方法连接形成表达分泌型的抗艰难梭菌毒素A的融合蛋白。
5.根据权利要求3或4所述的防治艰难梭菌毒素A阳性的艰难梭菌所致的肠道感染的活菌疫苗，其特征是所述乳酸链球菌为食品级工业菌。
6.权利要求1-4任一项所述的防治艰难梭菌毒素A阳性的艰难梭菌所致肠道感染的活菌疫苗的制备方法，其特征是将上述胸苷酸合成酶ThyA基因缺陷型重组乳酸链球菌在含有胸苷的培养基中培养后，获得防治艰难梭菌毒素A阳性的艰难梭菌所致的肠道感染的活菌疫苗。
7.根据权利要求6所述的防治艰难梭菌毒素A阳性的艰难梭菌所致肠道感染的活菌疫苗的制备方法，其特征是所述胸苷的浓度为l(T30iiM。
8.根据权利要求6所述的防治艰难梭菌毒素A阳性的艰难梭菌所致肠道感染的活菌疫苗，其特征是所述活菌疫苗的剂型为口服剂。
9.权利要求1-4任一项所述的防治艰难梭菌毒素A阳性的艰难梭菌所致肠道感染的活菌疫苗在制备具有防治艰难梭菌毒素A阳性的艰难梭菌所致的肠道感染作用的药物中的用途。
全文摘要
本发明公开了一种防治艰难梭菌毒素A阳性的艰难梭菌所致肠道感染的活菌疫苗，所述疫苗含有胸苷酸合成酶ThyA基因缺陷型重组乳酸链球菌；该疫苗经试验验证安全有效。还公开了上述活菌疫苗的制备方法及其在制备具有防治艰难梭菌毒素A阳性的艰难梭菌所致的肠道感染药物中的用途。
文档编号A61K39/07GK102743746SQ20121019491
公开日2012年10月24日 申请日期2012年6月13日 优先权日2012年6月13日
发明者杨晓强, 陈学清 申请人:广州医学院第一附属医院, 杨晓强