艰难梭菌抗原的制作方法

专利名称：艰难梭菌抗原的制作方法
艰难梭菌抗原本发明涉及用于预防/治疗/抑制艰难梭菌(Clostridium difficile)感染(CDI)的抗原。还提供了用于产生所述抗原的方法，用于产生结合所述抗原的抗体的方法，和所述抗体用于预防/治疗/抑制CDI的应用。艰难梭菌感染(CDI)目前是世界范围内医院的主要问题。该细菌引起医院的抗生素相关疾病，这种疾病自身表现为从轻度自身限制性腹泻至可能威胁生命的严重结肠炎的几种形式。中老年患者大部分具有这些可能威胁生命的疾病的风险并且⑶I的发病率在过去10年内急剧增加。在2010年，英国有21，000多例CDI，其中2，700多例伴随着死亡。⑶I每年度花费英国国民卫生服务(NHS)超过5亿英镑。各种艰难梭菌菌株可以通过大量方法来分类。最常用的方法之一是聚合酶链式反应(PCR)核糖核酸分型(ribotyping)，其中使用PCR来扩增艰难梭菌的16S-23S rRNA基因的基因间间隔区。来自这种方法的反应产物提供了鉴定分离株细菌核糖核酸型的特征带型。毒素分型(toxinotyping)是另一分型方法，其中使用源自编码艰难梭菌毒素的DNA的限制模式来鉴定菌株的毒素型。在不同菌株的毒素基因之间观察到的限制模式的差异还表示艰难梭菌毒素家族内的序列变异。例如，毒素型O毒素B的C末端60kDa区域与毒素型III毒素B的相同区域相比具有大约13%的序列差异。艰难梭菌菌株产生多种毒力因子，其中值得注意的是几种蛋白毒素:毒素A、毒素B以及在某些菌株中的二元毒素，该二元毒素与产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens) I毒素类似。毒素A是大的蛋白细胞毒素/肠毒素，它在感染的病理中起作用并且可能影响肠定殖过程。已经报道了毒素A阴性/毒素B阳性菌株的⑶I发作，这表明毒素B也能够在疾病病理中起重要作用。编码毒素A和毒素B (分别是Mw308k和Mw269k)的基因序列是已知的-参见例如，Moncrief等人.(1997) Infect.1mmun63:1105_1108。这两种毒素具有高的序列同源性,被认为是基因复制产生的。毒素还共有共同的结构(参见

图1)，即N末端葡糖基转移酶结构域、中央疏水区、四个保守半胱氨酸、和长串的C末端重复单元(RU)。毒素A包括39个连续重复单元(RU)，其跨毒素A多肽序列的氨基酸残基
1851-2710。毒素B包括较少的RU(19与24个之间)，其跨毒素B多肽序列的氨基酸残基
1852-2366。对于毒素A和B二者，重复单元为两种不同类型:大约15-25个残基的短重复(SR)和大约30个残基的长重复(LR)。LR互相之间以3或4个SR间隔，且LR与侧翼SR —起为毒素的糖类受体提供结合位点。毒素A在其C末端结构域中具有7个LR，认为其提供7 个受体结合位点(Greco 等人.(2005) Nature Structural Biol.13:460-461)。毒素 B 具有4个LR，认为其提供4个糖类结合单元。毒素A和毒素B SR/LR簇(还称为受体结合“模块”)的实例的大小从92-141个氨基酸残基变化，通过参考表I和2来示例。毒素A和毒素B 二者都是经由包括下列的多步机制来实现它们的作用机制的:结合细胞表面的受体，内化，随后转运(translocation)并释放效应结构域进入细胞胞质溶胶以及最终的胞内作用。所述作用机制牵涉了 Rho家族的小GTP酶的灭活。在这一方面，毒素催化葡萄糖部分(来自UDP-葡萄糖)转移至Rho蛋白的氨基残基。毒素A和毒素B还含有半胱氨酸蛋白酶形式的第二种酶活性，该第二种酶活性似乎在转运后效应结构域释放到胞质溶胶中起重要作用。艰难梭菌二元毒素通过牵涉将ADP-核糖部分由NAD转移至其靶蛋白的机制而修饰细胞肌动蛋白。治疗艰难梭菌感染的目前疗法依赖于抗生素的使用，特别是甲硝唑和万古霉素。然而，这些抗生素不是在所有情况下都有效，并且20-30%的患者会遭受疾病复发。最受关注的是在英国出现了毒力更强的菌株，该菌株在2002年首次在加拿大被鉴定。这些菌株包括属于PCR核糖核酸型027和毒素型III的那些，它们会引起具有比之前观察到的高3倍的直接归因死亡率的CDI。因此现在尤其急迫地需要新的治疗，因为目前的抗生素功效似乎在降低。一种有吸引力的替代方案是使用结合并中和毒素A和毒素B的活性的抗体。这是基于以下知识:不释放这些毒素的艰难梭菌菌株，即所谓的非产毒菌株，不导致CDI。在一种方法中，可用抗原免疫患有CDI的患者或处于发展此类感染的风险中的受治疗者，这导致针对毒素A和毒素B的循环中的和粘膜的抗体增加。这定义为主动免疫。可选地，可免疫动物诸如马或绵羊，收集它们的血清并纯化抗体用于向患者施用-被动免疫。

主动免疫和被动免疫二者的关键要求是分别用于免疫患者或动物的适当抗原的可获得性。这些可包括可以从在其中培养了艰难梭菌的适当产毒菌株的培养基纯化的天然毒素。这种方法存在多种缺点。毒素A和毒素B二者在培养基中以仅少量存在，难以纯化而不引起显著的损失。如此，获得满足世界范围的需求所需的量将是昂贵和困难的。此外，天然毒素是不稳定的，而且由于其毒性，在用作免疫原之前必须被转化为其类毒素(灭活的毒素)。上述问题导致存在极少的可获得的艰难梭菌疫苗候选物。迄今，处于晚期开发的唯一 CDI疫苗是基于天然(即，天然存在的)毒素A和B的混合物，其已经由化学改性被灭活(Salnikova 等人 2008，J Pharm Sci97:3735-3752)。使用天然毒素和其类毒素的一种替代方案包括设计、开发和使用衍生自毒素A和B的重组片段。它们的优点有，此类片段能够以更大量和比天然毒素更低成本地表达和纯化。预期用于治疗/预防艰难梭菌感染的现有抗原的实例包括基于毒素A或毒素B的C末端重复单元(RU)的肽-参见例如，W000/61762。然而，此类抗原的问题是，它们的免疫原性差(即，抗原产生差的抗体滴度)，或当产生较高的抗体滴度时，抗体表现针对艰难梭菌细胞毒活性的差的中和效力(即，产生不足的中和性抗体)。因此，本领域内存在对能够特别地解决艰难梭菌感染(CDI)的新疫苗/疗法/治疗的需要。这种需要被本发明解决了，本发明解决了上述问题的一个或多个。在一个实施方案中，本发明提供能够引起针对艰难梭菌毒素A和/或B的强力的毒素中和响应的抗原。本发明还提供用于制备重组抗原的方法。在另一个实施方案中，所述抗原用作免疫原，使得能够大规模制备治疗性抗体。在一个进一步的实施方案中，所述抗体能够引起针对艰难梭菌毒素A和/或B的强力的毒素中和响应,从而具有预防和/或治疗应用。如以上提到的(参见W000/61762)，此前的研究描述基于毒素A和/或毒素B的C末端重复单元(RU)的疫苗制品。所述RU片段具有差的毒素中和效果，和/或难以大量生产。
与之相比，本发明提供基于毒素A和/或毒素B重复单元的艰难梭菌抗原，还包括另外的艰难梭菌毒素结构域，本发明的发明人认为所述另外的艰难梭菌毒素结构域为该抗原提供重要的‘支架’功能。本发明的所述抗原表现良好的毒素中和免疫应答和/或容易大规模生产。本发明的发明人惊讶地鉴定，“支架”第一氨基酸序列(如以上)的存在提供比仅包含毒素A或毒素B的重复区的对应片段增加10-100倍的保护性(毒素-中和)免疫应答。表3-10清楚地显示与仅包含艰难梭菌毒素的重复结构域的片段相比，本发明的融合蛋白弓I起毒素中和免疫应答的极佳能力。表5和6中的数据比较证实，本发明的基于毒素B的构建体比仅基于毒素B的C末端重复单元的对应构建体(称为TxB2)引起显著更强力的毒素中和免疫应答。更详细地，在18周的免疫期后，本发明的构建体提供的毒素中和免疫应答是TxB2构建体提供的毒素中和免疫应答的大约128倍高。表9和10显示本发明的基于毒素A的构建体的类似数据。所述表中的数据比较证实，本发明的基于毒素A的构建体比仅基于毒素A的C末端重复单元的对应构建体(称为TxA2)引起显著更强力的毒素中和免疫应答。更详细地，在18周的免疫期后，本发明的构建体提供的毒素中和免疫应答是TxA2构建体提供的毒素中和免疫应答的大约12倍高。出于多种原因，这些发现是令人惊讶的。以前的研究已经显示，由艰难梭菌毒素RU组成的毒素片段正确地折叠，容易结晶形成有序结构(Ho等人.(2005)PNAS，102:18373-18378)，并结合模拟天然艰难梭菌毒素受体的糖类部分(Greco等人.(2006) NatureStructure.Molecular Biology, 13:460-461)。因此，迄今为止的科学证据支持由艰难梭菌毒素RU组成的片段在抗原制剂中的应用并与其现有技术应用(例如，W000/61762) —致。然而更重要地，进一步的研究已经证实，用完整艰难梭菌产生的抗体，尽管识别由仅完整RU区组成的片段，不能识别由基于艰难梭菌的相同毒素的残基901-1750的“支架”区组成的片段(Genth等人，(2000) Infect.1mmun.,68:1094-1101)。因此，这些数据表示，“支架”残基901-1750内的结构域不构成显著的抗体结合结构决定簇。在这一方面，除了在肽键处以外，“支架”毒素结构域与C末端重复区残基之间在三级结构中不存在接触-参见Pruitt等人，(2010)PNAS1002199107的在线出版物。总之，因此，在毒素A和/或毒素B的重组免疫原中包含艰难梭菌“支架”·区具有显著增强毒素-中和免疫应答的作用是极其令人惊讶的。本发明的第一方面提供一种融合蛋白，由第一氨基酸序列和第二氨基酸序列组成或包含第一氨基酸序列和第二氨基酸序列，其中:I)所述第一氨基酸序列由与由艰难梭菌毒素A序列的残基1500-1850组成的氨基酸序列具有至少80%序列同一性的氨基酸序列提供；和2)所述第二氨基酸序列由与由位于艰难梭菌毒素A序列的氨基酸残基1851-2710中的长重复单元组成的氨基酸序列具有至少80%序列同一性的氨基酸序列提供；前提是，所述融合蛋白不是包含艰难梭菌毒素A的氨基酸残基543-2710的多肽。提及艰难梭菌毒素A序列是指天然存在的艰难梭菌毒素A的氨基酸序列(还称为艰难梭菌毒素A参考序列)。此类序列的实例是本领域技术人员容易理解的，且一些更常见的天然存在的毒素A序列在本说明书(参见例如，SEQ ID NO:1&3)以及文献中被鉴定。整个说明书中提及‘至少80%序列同一性’认为是与短语‘基于’同义的，并可以包括至少85%、至少90%、至少93%、至少95%、至少97%、至少99%和100%序列同一性的一种或多种。在评价序列同一性时，将具有指定数目的连续氨基酸残基的参考序列与来自本发明的融合蛋白的相应部分的氨基酸序列(具有相同数目的连续氨基酸残基)比对。在一个实施方案中，第一氨基酸序列是基于(即，与其具有80%序列同一'丨生)艰难梭菌毒素A的氨基酸残基544-1850。在另一个实施方案中，第一氨基酸序列是基于艰难梭菌毒素A的氨基酸残基544-1850的N末端截短，诸如艰难梭菌毒素A的氨基酸残基564-1850、氨基酸残基584-1850、氨基酸残基594-1850、氨基酸残基614-1850、氨基酸残基634-1850、氨基酸残基654-1850、氨基酸残基674-1850、氨基酸残基694-1850、氨基酸残基714-1850、氨基酸残基734-1850、氨基酸残基754-1850、氨基酸残基767-1850、氨基酸残基770-1850、氨基酸残基774-1850、氨基酸残基794-1850、氨基酸残基814-1850、氨基酸残基834-1850、氨基酸残基854-1850、氨基酸残基874-1850、氨基酸残基894-1850、氨基酸残基914-1850、氨基酸残基934-1850、氨基酸残基954-1850、氨基酸残基974-1850、氨基酸残基994-1850、氨基酸残基1014-1850、氨基酸残基1034-1850、氨基酸残基1054-1850、氨基酸残基1074-1850、氨基酸残基1094-1850、氨基酸残基1104-1850、氨基酸残基1124-1850、氨基酸残基、氨基酸残基1131-1850、氨基酸残基1144-1850、氨基酸残基1164-1850、氨基酸残基1184-1850、氨基酸残基1204-1850、氨基酸残基1224-1850、氨基酸残基1244-1850、氨基酸残基1264-1850、氨基酸残基1284-1850、氨基酸残基1304-1850、氨基酸残基1324-1850、氨基酸残基1344-1850、氨基酸残基1364-1850、氨基酸残基1384-1850、氨基酸残基1404-1850、氨基酸残基1424-1850、氨基酸残基1444-1850、氨基酸残基1464-1850、或氨基酸残基1684-1850 ;而一般前提是，所述融合蛋白不是包含艰难梭菌毒素A的氨基酸残基543-2710的多肽。仅以示例的方式，以上氨基酸位置编号可以是指标为SEQ ID N0:1和/或3的艰难梭菌毒素A序列。在一个实施方案中，第二氨基酸序列是基于(即，与其具有80%序列同一性)来自艰难梭菌毒素A序列的任何一种或多种长重复(LR)氨基酸序列。仅以示例的方式，所述一种或多种LR序列可以基于SEQ ID NO:60、62、64、66、68、70和/或72的任一种。在另一个实施方案中，第二氨基酸序列是基于艰难梭菌毒素A序列的完整模块序列，其包括LR氨基酸序列加其(侧翼)短重复(SR)序列的一种或多种。仅以示例的方式，第二氨基酸可以基于SEQ ID勵:61、63、65、67、69、71和/或73的一种或多种。在另一个实施方案中，第二氨基酸序列是基于由以下组成或包含以下的序列:来自艰难梭菌毒素A序列的完整模块I氨基酸序列(残基1851-2007)-参见例如，如表I中所示的模块I。在另一个实施方案中，第二氨基酸序列是基于由以下组成或包含以下的序列:来自艰难梭菌毒素A序列的完整模块I加模块2氨基酸序列(例如，如表I中所示的残基1851-2141)。在另一个实施方案中，第二氨基酸序列是基于由以下组成或包含以下的序列:来自艰难梭菌毒素A序列的完整模块I加模块2加模块3氨基酸序列(例如，如表I中所示的残基1851-2253)。在另一个实施方案中，第二氨基酸序列是基于由以下组成或包含以下的序列:来自艰难梭菌毒素A序列的完整模块I加模块2加模块3加模块4氨基酸序列(例如，如表I中所示的残基1851-2389)。在另一个实施方案中，第二氨基酸序列是基于由以下组成或包含以下的序列:来自艰难梭菌毒素A序列的完整模块I加模块2加模块 3加模块4加模块5氨基酸序列(例如，如表I中所示的残基1851-2502)。在另一个实施方案中，第二氨基酸序列是基于由以下组成或包含以下的序列:来自艰难梭菌毒素A序列的完整模块I加模块2加模块3加模块4加模块5加模块6氨基酸序列(例如，如表I中所示的残基1851-2594)。在另一个实施方案中，第二氨基酸序列是基于由以下组成或包含以下的序列:来自艰难梭菌毒素A序列的完整模块I加模块2加模块3加模块4加模块5加模块6加模块7氨基酸序列(例如，如表I中所示的残基1851-2710)。仅以示例的方式，以上氨基酸位置编号可以是指标为SEQ ID NO:1和/或3的艰难梭菌毒素A序列。第二氨基酸序列的实施方案的任一种可以与对第一氨基酸序列描述的实施方案的任一种组合。在一个实施方案中，提供一种融合蛋白，其包括或由以下组成:基于毒素A序列的氨基酸残基1851-2710的序列(或其部分)和基于毒素A多肽的氨基酸残基770-1850的N末端多肽(或其部分)。在另一个实施方案中，提供一种融合蛋白，其包括或由以下组成:基于毒素A序列的氨基酸残基1851-2710的序列(或其部分)和基于毒素A多肽的氨基酸残基1131-1850的N末端多肽。在另一个实施方案中，提供一种融合蛋白，其包括或由以下组成:基于毒素A多肽的氨基酸残基 770-2710 或 1131-2710 的序列(例如，SEQ ID N05、6、7、8、18、19、20、21、22、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43 或 58)。在另一个实施方案中，提供一种融合蛋白，其包括或由以下组成:基于毒素A多肽的氨基酸残基 770-2007、770-2141、770-2253、770-2389 或 1131_2007、1131_2141、1131-2253 或 1131-2389 的序列(例如，SEQ ID N059)。本发明的相关第一方面提供一种融合蛋白，由第一氨基酸序列和第二氨基酸序列组成或包含第一氨基酸序列和第二氨基酸序列，其中:
I)所述第一氨基酸序列由与由艰难梭菌毒素B序列的残基1500-1851组成的氨基酸序列具有至少80%序列同一性的氨基酸序列提供；和2)所述第二氨基酸序列由与由位于艰难梭菌毒素B序列的氨基酸残基1852-2366中的长重复单元组成的氨基酸序列具有至少80%序列同一性的氨基酸序列提供；前提是，所述融合蛋白不是包含艰难梭菌毒素B的氨基酸残基543-2366的多肽。提及艰难梭菌毒素B序列是指天然存在的艰难梭菌毒素B的氨基酸序列(还称为艰难梭菌毒素B参考序列)。此类序列的实例是本领域技术人员容易理解的，且一些更常见的天然存在的毒素B序列在本说明书(参见例如，SEQ ID NO:2&4)以及文献中被鉴定。在一个实施方案中，第一氨基酸序列是基于(即，与其具有80%序列同一丨丨生)艰难梭菌毒素B的氨基酸残基544-1851。在另一个实施方案中，第一氨基酸序列是基于艰难梭菌毒素B的氨基酸残基544-1851的N末端截短，诸如艰难梭菌毒素B的氨基酸残基564-1851、氨基酸残基584-1851、氨基酸残基594-1851、氨基酸残基614-1851、氨基酸残基634-1851、氨基酸残基654-1851、氨基酸残基674-1851、氨基酸残基694-1851、氨基酸残基714-1851、氨基酸残基734-1851、氨基酸残基754-1851、氨基酸残基767-1851、氨基酸残基770-1851、氨基酸残基774-1851、氨基酸残基794-1851、氨基酸残基814-1851、氨基酸残基834-1851、氨基酸残基854-1851、氨基酸残基874-1851、氨基酸残基894-1851、氨基酸残基914-1851、氨基酸残基934-1851、氨基酸残基954-1851、氨基酸残基974-1851、氨基酸残基994-1851、氨基酸残基1014-1851、氨基酸残基1034-1851、氨基酸残基1054-1851、氨基酸残基1074-1851、氨基酸残基1094-1851、氨基酸残基1104-1851、氨基酸残基1124-1851、氨基酸残基1131-1851、氨基酸残基1144-1851、氨基酸残基1164-1851、氨基酸残基1184-1851、氨基酸残基1204-1851、氨基酸残基1224-1851、氨基酸残基1244-1851、氨基酸残基1264-1851、氨基酸残基1284-1851、氨基酸残基1304-1851、氨基酸残基1324-1851、氨基酸残基1344-1851、氨基酸残基1364-1851、氨基酸残基1384-1851、氨基酸残基1404-1851、氨基酸残基1424-1851、氨基酸残基1444-1851、氨基酸残基1464-1851、或氨基酸残基1684-1851 ;而一般前提是，所述融合蛋白不是包含艰难梭菌毒素B的氨基酸残基543-2366的多肽。仅以示例的方式，以上氨基酸位置编号可以是指标为SEQ ID NO:2和/或4的艰难梭菌毒素B序列。在一个实施方案中，第二氨基酸序列是基于(S卩，与其具有80%序列同一性)来自艰难梭菌毒素B序列的长重复(LR)氨基酸序列的任何一种或多种。仅以示例的方式，所述一种或多种LR序列可以是基于SEQ ID NO:74、76、78和/或80的任一种。在另一个实施方案中，第二氨基酸序列是基于艰难梭菌毒素B序列的完整模块序列，其包括LR氨基酸序列加其(侧翼)短重复(SR)序列的一种或多种。仅以示例的方式，第二氨基酸序列可以基于SEQ ID N0:75、77、79和/或81的一种或多种。在另一个实施方案中，第二氨基酸是基于由以下组成或包含以下 的序列:来自艰难梭菌毒素B序列的完整模块I氨基酸序列(残基1852-2007)-参见例如，如表2中所示的模块I。在另一个实施方案中，第二氨基酸序列是基于由以下组成或包含以下的序列:来自艰难梭菌毒素B序列的完整模块I加模块2氨基酸序列(例如，如表2中所示的残基1852-2139)。在另一个实施方案中，第二氨基酸序列是基于由以下组成或包含以下的序列:来自艰难梭菌毒素B序列的完整模块I加模块2加模块3氨基酸序列(例如，如表2中所示的残基1851-2273)。在另一个实施方案中，第二氨基酸序列是基于由以下组成或包含以下的序列:来自艰难梭菌毒素B序列的完整模块I加模块2加模块3加模块4氨基酸序列(例如，如表2中所示的残基1851-2366)。仅以示例的方式，以上氨基酸位置编号可以是指标为SEQ ID NO:2和/或4的艰难梭菌毒素B序列。第二氨基酸序列的实施方案的任一种可以与对第一氨基酸序列描述的实施方案的任一种组合。在一个实施方案中，当第一和第二氨基酸序列都是基于毒素B序列时，融合蛋白可由以下组成或包括以下:基于艰难梭菌毒素B序列诸如SEQ ID NO:2和/或4的至少871或至少876或至少881或至少886或至少891或至少896或至少901个连续氨基酸残基(例如，从C末端氨基酸残基开始)的氨基酸序列)。在一个实施方案中，提供一种融合蛋白，其包括或由以下组成:基于毒素B多肽的氨基酸残基1852-2366的序列(或其部分)和基于毒素B多肽的氨基酸残基767-1851的N末端多肽(或其部分)。在另一个实施方案中，提供一种融合蛋白，其包括或由以下组成:基于毒素B多肽的氨基酸残基1852-2366的序列(或其部分)和基于毒素B多肽的氨基酸残基1145-1851的N末端多肽(或其部分)。在另一个实施方案中，提供一种融合蛋白，其包括或由以下组成:基于毒素B多肽的氨基酸残基 767-2366 或 957-2366 或 1138-2366 的序列(例如，SEQ ID N09、10、11、12、13、14、23、24、25、26、27、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56 或 57)。
本发明还提供为毒素A和B结构域的嵌合体的融合蛋白。例如，基于毒素B多肽的一个或多个长重复单元(任选地包括一个或多个短重复单元；或一个、多个或所有模块)可与毒素A多肽的“支架”区组合。类似地，基于毒素A多肽的一个或多个长重复单元(任选地包括一个或多个短重复单元；或一个、多个或所有模块)可与毒素B多肽的“支架”区组合。因此，本发明的进一步相关方面提供一种杂合/嵌合的融合蛋白，由第一氨基酸序列和第二氨基酸序列组成或包含第一氨基酸序列和第二氨基酸序列，其中:I)所述第一氨基酸序列由与由艰难梭菌毒素A序列的残基1500-1851组成的氨基酸序列具有至少80%序列同一性的氨基酸序列提供；和2)所述第二氨基酸序列由与由位于艰难梭菌毒素B序列的氨基酸残基1852-2366中的长重复单元组成的氨基酸序列具有至少80%序列同一性的氨基酸序列提供；前提是，所述融合蛋白不是包含艰难梭菌毒素A的氨基酸残基543-2710的多肽；且前提是，所述融合蛋白不是包含艰难梭菌毒素B的氨基酸残基543-2366的多肽。第一和第二氨基酸序列的实施方案如以上详述的。例如，在一个实施方案中，提供一种融合蛋白，其包括或由以下组成:基于毒素B多肽的氨基酸残基1852-2366的序列(或其部分)和基于毒素A多肽的氨基酸残基770-1849的N末端多肽(或其部分)。在另一个实施方案中，提供一种融合蛋白，其包括或由以下组成:基于毒素B多肽的氨基酸残基1852-2366的序 列(或其部分)和基于毒素A多肽的氨基酸残基1131-1849的N末端多肽(或其部分)。在另一个实施方案中，提供一种融合蛋白，其包括或由以下组成:基于毒素B多肽的氨基酸残基1852-2366的序列(或其部分)和基于毒素A多肽的氨基酸残基1500-1849的N末端多肽(或其部分)。在一个实施方案中，所述毒素A多肽组分优选地是基于比毒素A多肽的残基543-1849短的序列。具体实例包括由以下组成或包括以下的融合蛋白:基于SEQ ID NO: 16或17的任何一种或多种的氨基酸序列。类似地，本发明的进一步相关第一方面提供一种杂合/嵌合的融合蛋白，由第一氨基酸序列和第二氨基酸序列组成或包含第一氨基酸序列和第二氨基酸序列，其中:I)所述第一氨基酸序列由与由艰难梭菌毒素B序列的残基1500-1851组成的氨基酸序列具有至少80%序列同一性的氨基酸序列提供；和2)所述第二氨基酸序列由与由位于艰难梭菌毒素A序列的氨基酸残基1851-2710中的长重复单元组成的氨基酸序列具有至少80%序列同一性的氨基酸序列提供；前提是，所述融合蛋白不是包含艰难梭菌毒素A的氨基酸残基543-2710的多肽；且前提是，所述融合蛋白不是包含艰难梭菌毒素B的氨基酸残基543-2366的多肽。第一和第二氨基酸序列的实施方案如以上详述的。在一个实施方案中，提供一种融合蛋白，其包括或由以下组成:基于毒素A多肽的氨基酸残基1850-2710的序列(或其部分)和基于毒素B多肽的氨基酸残基767-1851的N末端多肽(或其部分)。在另一个实施方案中，提供一种融合蛋白，其包括或由以下组成:基于毒素A多肽的氨基酸残基1850-2710的序列(或其部分)和基于毒素B多肽的氨基酸残基1145-1851的N末端多肽(或其部分)。在另一个实施方案中，提供一种融合蛋白，其包括或由以下组成:基于毒素A多肽的氨基酸残基1850-2710的序列(或其部分)和基于毒素B多肽的1500-1851的N末端多肽。在一个实施方案中，毒素B多肽组分优选地是基于比毒素B多肽的残基543-1851短的序列。具体实例包括由以下组成或包括以下的融合蛋白:基于SEQ ID N0:15的氨基酸序列。如以上描述的，本发明涉及基于艰难梭菌毒素A和/或艰难梭菌毒素B的“支架”段加(C末端重复单元的)LR部分的融合蛋白。在这方面，基于所述艰难梭菌毒素A和/或毒素B序列的所述融合蛋白的总的部分通常合计最多1940个连续氨基酸残基(例如最多1890、或 1840、或 1790、或 1740、或 1690、或 1640、或 1590、或 1540、或 1490、1440、或 1390、或1340、或1290、或1240个连续氨基酸残基)。在一个实施方案中，融合蛋白基本上缺少半胱氨酸蛋白酶活性。在另一个(或同一)实施方案中，融合蛋白基本上缺少葡糖基转移酶活性。例如，提供所述活性的氨基酸序列的部分或全部通常在本发明的融合蛋白中不存在(例如，缺失)。这些酶活性存在于天然毒素A和/或毒素B中，并与所述毒素的N末端结构域相关(参见图1)。在另一个实施方案中，融合蛋白基本上缺少天然艰难梭菌毒素的葡糖基转移酶结构域(毒素A的氨基酸残基1-542 ;毒素B的氨基酸残基1-543)。在另一个(或同一)实施方案中，融合蛋白基本上缺少天然艰难梭菌毒素的半胱氨酸蛋白酶结构域(毒素A的氨基酸残基543-770 ;毒素B的544-767)。所述氨基酸残基编号是指任何毒素A或毒素B的毒素型，例如本说明书中提及的参考毒素A和/或毒素B毒素型SEQ ID NO的任何一种或多种。因此，所述氨基酸残基编号可以是指本说明书中提及的任何具体毒素A和/或毒素B参考SEQ ID NO，包括与其具有至少80%、至少85%、至少90%、至少93%、至少95%、至少97%、或至少99%的氨基酸序列变体。本发明的融合蛋白构建体可衍生自任何毒素A和/或B序列(包括任何毒素型序列)，诸如本说明书中阐述的那些。例如，在一个实施方案中，第一和/或第二氨基酸序列衍生自毒素型0的毒素A和/或B(分别是SEQ IDl和2)。在另一个实施方案中，第一和/或第二氨基酸序列衍生自毒素型3的毒素A和/或B (分别是SEQ ID3和4)。本发明的融合蛋白还可包括融合蛋白伴侣以帮助可溶的表达。融合蛋白伴侣可被连接在抗原构建体的N末端或C末端，但通常被连接在N末端。融合伴侣的实例是:NusA、硫氧还蛋白、麦芽糖结合蛋白、小泛素样分子(Sumo-标签)。为了帮助在纯化期间去除融合蛋白伴侣，可将独特的蛋白酶位点插入在融合蛋白伴侣与融合蛋白本身之间。此类蛋白酶位点可包括用于凝血酶、因子Xa、肠激酶、PreScission , Sumo 的那些。可选地，融合蛋白伴侣的去除可通过 在融合蛋白伴侣与融合蛋白本身之间并入内蛋白序列来实现。内蛋白是自身裂解蛋白，并且响应于刺激(例如，PH降低)能够在内蛋白与抗原构建体的交叉点自身剪接，从而消除添加特定蛋白酶的需求。内蛋白的实例包括衍生自结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis) (RecA)、和极端嗜热古菌(Pyrococcus horikoshii)(RadA)的结构域(Fong 等人.(2010) Trends Biotechnol.28:272-279)。为了帮助纯化，本发明的融合蛋白可包括一种或多种纯化标签以使得纯化方法中能够包括特定的层析步骤(例如，金属离子螯合、亲和层析)。此类纯化标签可例如包括:重复组氨酸残基(例如，6-10个组氨酸残基)、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽S-转移酶；和链霉亲和素。这些标签可被连接在本发明的抗原融合蛋白的N末端和/或C末端。为了帮助在纯化期间去除此类标签，可在融合蛋白与纯化标签之间插入蛋白酶位点和/或内蛋白(以上实例)。因此，本发明的典型融合蛋白构建体(从N末端开始)可包括:-第一纯化标签-融合蛋白伴侣(以帮助表达)-第一(优选地特定)蛋白酶序列或内蛋白序列-毒素A和/或B抗原序列-任选的第二(优选地特定)蛋白酶序列或内蛋白序列-任选的第二纯化标签。第一和第二纯化标签可以是相同或不同的。类似地，第一和第二蛋白酶/内蛋白序列可以是相同或不同的。第一和第二选项优选地不同，以使得能够选择性和可控地裂解
/纯化。

此类融合蛋白构建体的具体实例显示在SEQ ID18-27。在一个实施方案中，可引入间隔子以间隔纯化标签与融合蛋白-这可帮助增加对亲和纯化柱介质的结合效力。间隔子可被放置(紧接)在纯化标签之后，或在融合蛋白伴侣与融合蛋白本身之间。典型的间隔子序列可由10-40个氨基酸残基组成以提供线性或a -螺旋结构。因此，在一个实施方案中，本发明的融合蛋白构建体可包括(从N末端开始):-第一纯化标签-任选的第一间隔子序列-融合蛋白伴侣(以帮助表达)-任选的第二间隔子序列-(优选地特定)蛋白酶序列或内蛋白序列-毒素A和/或B衍生的抗原序列-任选的第二(优选地特定)蛋白酶序列或内蛋白序列-任选的第三间隔子序列
-任选的第二纯化标签此类蛋白融合构建体的具体实例显示在SEQ ID28-57。编码本发明的构建体的基因可由PCR从艰难梭菌基因组DNA产生，并由标准方法测序以确保完整性。可选地和优选地，可以合成基因，为表达宿主(例如，大肠杆菌(E.coli)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium))提供最佳的密码子偏倚。如此,本发明提供编码本发明的上述融合蛋白的相应的核酸序列。因此，本发明的第二方面提供用于表达一种或多种上述融合蛋白的方法，所述方法包括:I)在宿主细胞中提供编码一种或多种所述融合蛋白的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接于启动子；和2)在宿主细胞中表达所述核酸序列。本发明的融合蛋白可被配制为以多种方式用于人类或动物的疫苗。例如，配制可包括用试剂处理以引入分子内的交联。此类试剂的一个实例是甲醛，可将其与例如本发明的抗原融合蛋白一起培养1-24小时。可选地，可采用例如达2、4、6、8或10天的更长的培养时间。用此类试剂处理后，可将本发明的抗原融合体与适当的佐剂组合，适当的佐剂可取决于抗原融合蛋白预期用于人类还是动物。人类或动物疫苗制剂可包含本发明的毒素A和/或毒素B和/或相应的杂合/嵌合的抗原融合体。因此，在一个实施方案中，本发明的疫苗配制方案包括以下步骤:-在适当的缓冲体系中提供重组毒素A和/或毒素B和/或杂合/嵌合的毒素融合蛋白-任选地(优选地)用类毒化组分诸如甲醛处理所述混合物
·
-任选地转移融合蛋白到新的缓冲体系-组合融合蛋白与一种或多种适当的佐剂和任选地其他赋形剂因此，本发明的第三方面提供本发明的一种或多种上述融合蛋白，所述融合蛋白用于产生结合艰难梭菌毒素A和/或毒素B的抗体。在一个实施方案中，所述抗体结合并中和艰难梭菌毒素A和/或毒素B。对于动物的免疫，本发明的艰难梭菌重组融合蛋白抗原可以单独地或者同时或顺序地组合用作免疫原，以产生对单个艰难梭菌毒素或艰难梭菌毒素组合特异的抗体。例如，两种或更多种重组抗原可以混合在一起并用作单个免疫原。可选地，艰难梭菌毒素融合蛋白抗原(例如，毒素A衍生的)可单独地用作第一动物组的第一免疫原，并且另一艰难梭菌毒素抗原(例如，毒素B衍生的)可单独地用于第二动物组。可以组合由单独免疫产生的抗体以产生针对艰难梭菌毒素的抗体组合物。用于动物/兽医应用的合适的佐剂的非限制性实例包括弗氏佐剂(完全形式和不完全形式)、铝(磷酸铝或氢氧化铝)，皂苷及其纯化组分Quil A0本发明的第四(疫苗)方面提供本发明的一种或多种上述融合蛋白，所述融合蛋白用于预防、治疗或抑制CDI (例如，在哺乳动物诸如人类中)。换言之，本发明提供用于预防、治疗或抑制CDI (例如,在哺乳动物诸如人类中)的方法,所述方法包括向受治疗者(例如，哺乳动物诸如人类)施用治疗有效量的本发明的一种或多种上述融合蛋白。举例来说，基于毒素A的融合蛋白(任何A毒素型)可单独采用或联合基于毒素B的融合蛋白(任何B毒素型)采用。类似地，基于毒素B的融合蛋白(任何B毒素型)可单独采用或联合基于毒素A的融合蛋白(任何A毒素型)采用。所述融合蛋白可以相继(sequential)或同时方式施用。本发明的疫苗应用还可包括联合使用(例如，在先、相继或随后施用)一种或多种抗原诸如艰难梭菌抗原(例如，非毒素抗原；或艰难梭菌细菌诸如已被灭活的或减毒的)、和任选地一种或多种医院感染抗原(例如，来自导致医院感染的细菌的抗原、特别是表面抗原；和/或导致医院感染的细菌诸如已被灭活的或减毒的)。导致医院感染的细菌的实例包括以下一种或多种:大肠杆菌、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)诸如 MRSA、军团菌属(Legionella)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、肠杆菌属物种(Enterobacter spp)、朽1 樣酸杆菌属物种(Citrobacter spp)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、不动杆菌属物种(Acinetobacterspp)诸如鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderiacepacia)、和肠球菌属(Enterococcus)诸如万古霉素抗性的肠球菌属(VRE)。在一个实施方案中，所述疫苗应用可预防地采用，例如在所述患者进入医院(或类似的治疗设施)之前治疗患者以帮助预防医院获得性感染。可选地，所述疫苗应用可例行地施用于易受伤害的患者。本发明的相关疫苗方面提供结合本发明的一种或多种上述融合蛋白的一种或多种抗体(包含或由以下组成:完整IgG和/或Fab和/或F (ab' ) 2片段)，所述抗体用于预防、治疗或抑制CDI (例如，在哺乳动物诸如人类中)。换言之，本发明提供用于预防、治疗或抑制CDI (例如，在哺乳动物诸如人类中)的方法，所述方法包括向受治疗者(例如，哺乳动物诸如人类)施用治疗有效量的所述抗体。举例来说，基于抗毒素A的融合蛋白(任何A毒素型)抗体可单独采用或联合基于抗毒素B的融合蛋白(任何B毒素型)抗体采用。类似地，基于抗毒素B的融合蛋白(任何B毒素型)抗体可单独采用或联合基于抗毒素A的融合蛋白(任何A毒素型)抗体采用。所述抗体可以相继或同时方式施用。本发明的疫苗应用还可包括联合使用(例如，在先、相继或随后施用)结合抗原诸如艰难梭菌抗原(例如，非毒素抗原；或艰难梭菌细菌)的一种或多种抗体、和任选地结合一种或多种医院感染抗原(例如，来自导致医院感染的细菌的抗原、特别是表面抗原；和/或导致医院感染的细菌)的一种或多种抗体。导致医院感染的细菌的实例包括以下一种或多种:大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌诸如MRSA、军团菌属、铜绿假单胞菌、粘质沙雷氏菌、肠杆菌属物种、柠檬酸杆菌属物种、嗜麦芽寡养单胞菌、不动杆菌属物种诸如鲍曼不动杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、和肠球菌属诸如万古霉素抗性的肠球菌属(VRE)。在一个实施方案中，所述疫苗应用可预防地采用，例如在患者已经进入医院(或类似的治疗设施)后。可选地，所述疫苗应用可联合一种或多种抗生素施用于患者。在一个实施方案中，所述抗体通过用本发明的一种或多种上述融合蛋白免疫动物(例如，哺乳动物诸如人类、或非人类动物诸如山羊或绵羊)来产生。在一个实施方案中，本发明的抗体(基本上)不结合艰难梭菌毒素A和/或毒素B的效应结构域和/或半胱氨酸蛋白酶结构域。对于用于人类(或非人类动物)的疫苗的制备，可将活性免疫原性成分(无论这些是本发明的抗原性融合蛋白/和/或与其结合的本发明的相应的抗体)与载体或赋形剂混合，所述载体或赋形剂是药学上可接受的并与活性成分相容。适当的载体和赋形剂包括，例如，水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇、或类似物和其组合。此外，如果需要，疫苗可包含微量的辅助物质诸如湿润剂或乳化剂、PH缓冲剂、和/或增强疫苗效力的佐剂。疫苗还 可包括一种或多种佐剂。在本发明范围中的佐剂的一种非限制性实例是氢氧化铝。佐剂的其他非限制性实例包括但不限于:N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-去甲胞壁酰基-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP11637，称为去甲MDP)、N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(I' -2' -二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧)_乙胺(CGP19835A，称为MTP-PE)、和RIBI，其在2%角鲨烯/TweenSO乳液中包含从细菌提取的三种组分:单磷酰脂A、海藻糖二霉菌酸酯和细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。通常，疫苗制备为可注射物，以液体溶液或悬液。当然，还可制备适于在注射前在液体中成溶液或成悬液的固体形式。制品还可被乳化，或肽被包裹在脂质体或微胶囊中。疫苗施用通常是通过常规途径，例如，肌肉内、皮下、腹膜内或粘膜途径。施用可通过肠胃外注射，例如，皮下或肌肉内注射。疫苗以与剂量制剂(dosage formulation)相容的方式施用，施用的量将是预防和/或治疗有效的。将施用的量通常在每次剂量5微克至250微克抗原的范围中，取决于被治疗的受治疗者、受治疗者的免疫系统合成抗体的能力、和期望的保护程度。施用所需的活性成分的准确量可取决于医师的判断，并且对每个受治疗者是特定是。疫苗可以单剂量方案提供，或任选地以多剂量方案提供。多剂量方案是以下方案:其中主要接种过程可以是以1-6个分别的剂量，随后是以保持和/或加强免疫应答所需的随后时间间隔提供的其他剂量，例如，对于第二剂量在1-4个月，和如果需要，数月之后的随后剂量。给药方案至少部分地还由个体的需求决定，并取决于从业医师的判断。此外，包含免疫原性抗原的疫苗可联合其他免疫调节剂例如，免疫球蛋白、抗生素、白介素(例如，IL-2、IL-12)、和/或细胞因子(例如，IFNy)施用。适于用于本发明的另外的制剂包括微胶囊、栓剂，和在一些情形中，口服制剂或适于分配的制剂如气雾剂。对于栓剂，常规的粘合剂和载体可包括，例如，聚亚烷基二醇或甘油三酯；此类栓剂可从包含约0.5%至10%的范围，包括例如约1% -2%的活性成分的混合物形成。

本发明的融合蛋白还可具有作为用于亲和层析方案中的配体的用途。在此类方案中，本发明的融合蛋白可被共价固定在介质，诸如琼脂糖，例如使用溴化氰活化的琼脂糖上。然后，此类亲和柱可用于从抗血清或部分纯化的免疫球蛋白溶液纯化抗体，通过将它们通过柱，然后洗脱结合的IgG级分(例如，以低pH)。洗脱的级分中几乎所有抗体是针对本发明的融合蛋白的，且非特异性抗体和其他蛋白已被去除。这些亲和纯化的IgG级分具有作为免疫治疗剂和作为诊断用剂二者的应用。对于免疫治疗剂，亲和纯化的抗体使得能够施用较低剂量，使得不利的副作用较不可能。对于诊断，亲和纯化的剂通常提供改进的特异性和较少的假阳性结果。定义部分艰难梭菌是梭状芽孢杆菌属的革兰氏阳性菌物种。艰难梭菌感染(CDI)意指影响人和动物并且导致如下的一系列症状的细菌感染:从轻度自身限制性腹泻至威胁生命的病症，如假膜性结肠炎和细胞毒性巨结肠。在这种疾病中，艰难梭菌取代了一些正常的肠道菌群并开始产生攻击和损坏肠道上皮的细胞毒素。人⑶I的主要风险因子包括:接受广谱抗生素、超过65岁以及住院。艰难梭菌毒素A是大小为大约300kDa的蛋白细胞毒素/肠毒素家族。毒素A具有在N末端区域内的酶活性，该酶活性起作用破坏哺乳动物细胞的细胞骨架而引起细胞死亡。在艰难梭菌菌株中存在大量天然存在的毒素A变体，它们称为‘毒素型’。毒素A的各毒素型在它们的一级序列中总体具有通常小于10%的变异。合适的毒素A序列的实例包括SEQ ID No:1 和 SEQ ID No:3。艰难梭菌毒素B是大小为大约270kDa的蛋白细胞毒素家族，其与毒素A类似但具有显著更高的细胞毒性。像毒素A —样，毒素B具有在N末端区域内的酶活性，该酶活性起作用破坏哺乳动物细胞的细胞骨架而引起细胞死亡。在艰难梭菌菌株中存在大量天然存在的毒素B变体,它们称为‘毒素型’。毒素B的各毒素型在它们的一级序列中总体具有通常达到15%的变异。合适的毒素B序列的实例包括SEQ ID No:2和SEQ ID No:4。艰难梭菌重复单元是在毒素A和B的C末端中的区域，包含首次由vonEichel-Streiber 和 Sauerborn (1990 ；Gene30:107-113)鉴定的重复基序。在毒素 A 的情形中，存在31个短重复和7个长重复，每个重复由￠-发夹、随后是环组成。毒素B由类似的结构组成，但重复段较少。毒素A的重复单元被包含在残基1850-2710中，毒素B的被包含在残基1852-2366中。重复区在受体结合中起作用。受体结合区(即，界定毒素的结构结合袋)表现为围绕长重复区成簇以形成‘结合模块’参见表I和2)。认为毒素A和B的中心结构域在毒素向哺乳动物细胞的转运中起作用。毒素A的中心结构域是基于残基543-1849，毒素B的是基于残基543-1851。在毒素A和B的中心结构域区域之中，第一结构域是半胱氨酸蛋白酶，其在毒素的效应结构域(其包含葡糖基转移酶活性)的内化中起作用。毒素型通常用于分类艰难梭菌菌株。毒素分型是基于表征所获得的毒素基因的限制模式的方法。毒素A和B的毒素 型代表这些蛋白毒素的一级氨基酸序列变体。在一个实施方案中，艰难梭菌毒素选自毒素型0至XV中的一种。优选的毒素型(加上示例核糖核酸型和菌株)列在下面的表中。所列的毒素型纯粹是示例，并不旨在限制本发明。
权利要求
1.一种融合蛋白，由第一氨基酸序列和第二氨基酸序列组成或包含第一氨基酸序列和第二氨基酸序列，其中 a)所述第一氨基酸序列由与由艰难梭菌(C.difficile)毒素A序列的残基1500-1850或艰难梭菌毒素B序列的残基1500-1851组成的氨基酸序列具有至少80%序列同一性的氨基酸序列提供；和 b)所述第二氨基酸序列由与由位于艰难梭菌毒素A序列的氨基酸残基1851-2710或艰难梭菌毒素B序列的氨基酸残基1852-2366中的长重复单元组成的氨基酸序列具有至少80%序列同一性的氨基酸序列提供； 前提是，所述融合蛋白不是包含艰难梭菌毒素A的氨基酸残基543-2710的多肽； 且前提是，所述融合蛋白不是包含艰难梭菌毒素B的氨基酸残基543-2366的多肽。
2.根据权利要求I所述的融合蛋白，其中所述第一氨基酸序列由与由艰难梭菌毒素A序列的残基 780-1850 或 770-1850 或 767-1850 或 760-1850 或 750-1850 或 1110-1850 或1120-1850 或 1130-1850 或 1131-1850 或 1140-1850 或 1145-1850 或 1150-1850 组成的氨基酸序列具有至少80%序列同一性的氨基酸序列提供。
3.根据权利要求I所述的融合蛋白，其中所述第一氨基酸序列由与由艰难梭菌毒素B 序列的残基 780-1851 或 770-1851 或 767-1851 或 760-1851 或 750-1851 或 1125-1851或 1130-1851 或 1131-1851 或 1140-1851 或 1135-1851 或 1145-1851 或 1155-1851 或1165-1851组成的氨基酸序列具有至少80%序列同一性的氨基酸序列提供。
4.如前述任一项权利要求所述的融合蛋白，其中所述第二氨基酸序列由与选自艰难梭菌毒素A序列的氨基酸序列1851-2389或1851-2007或2008-2141或2142-2253或2254-2389或2390-2502或2503-2594或2595-2710的一种或多种的氨基酸序列具有至少80 %序列同一性的氨基酸序列提供。
5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其中所述第二氨基酸序列由与选自艰难梭菌毒素A 序列的氨基酸序列 1851-2007 或 1851-2141 或 1851-2253 或 1851-2389 或 1851-2502 或1851-2594或1851-2710的氨基酸序列具有至少80%序列同一性的氨基酸序列提供。
6.根据权利要求1-3任一项所述的融合蛋白，其中所述第二氨基酸序列由与选自艰难梭菌毒素B序列的氨基酸序列1852-2007或2008-2139或2140-2273或2274-2366的氨基酸序列具有至少80%序列同一性的氨基酸序列提供。
7.根据权利要求6所述的融合蛋白，其中所述第二氨基酸序列由与选自艰难梭菌毒素B序列的氨基酸序列1852-2007或1852-2139或1852-2273或1852-2366的氨基酸序列具有至少80%序列同一性的氨基酸序列提供。
8.根据权利要求1-3任一项所述的融合蛋白，其中所述第一氨基酸序列由与由艰难梭菌毒素A序列的残基767-1850或艰难梭菌毒素B序列的残基767-1851组成的氨基酸序列具有至少80%序列同一性的氨基酸序列提供；且其中所述第二氨基酸序列由与由艰难梭菌毒素A序列的残基1851-2710或艰难梭菌毒素B序列的残基1852-2366组成的氨基酸序列具有至少80 %序列同一性的氨基酸序列提供。
9.如前述任一项权利要求所述的融合蛋白，其中除了以上限定的毒素A和/或毒素B氨基酸序列以外，所述融合蛋白不包括任何另外的毒素A和/或毒素B氨基酸序列。
10.如前述任一项权利要求所述的融合蛋白，在产生结合艰难梭菌毒素A和/或艰难梭菌毒素B的抗体的方法中用作抗原； 诸如其中所述抗体包括完整IgG、Fab抗体或F(ab' )2抗体。
11.一种用于分离结合艰难梭菌毒素A和/或艰难梭菌毒素B的抗体的体外方法，所述方法包括 a)在表面上(例如柱中的介质上)固定一种或多种根据权利要求1-9任一项的艰难梭囷融合蛋白； b)将固定的融合蛋白与包含结合艰难梭菌毒素A和/或毒素B的抗体的溶液接触； c)允许所述抗体结合所述融合蛋白，从而形成抗体与融合蛋白的结合复合体； d)洗去任何未结合的抗体或蛋白；和 e)从所述表面洗脱所结合的抗体，从而提供亲和纯化的抗体。
12.—种结合艰难梭菌毒素A和/或艰难梭菌毒素B的抗体，其中所述抗体是根据权利要求10或权利要求11所述的方法可获得的，且其中所述抗体基本上不结合艰难梭菌毒素A或毒素B的效应结构域和/或半胱氨酸蛋白酶结构域； 诸如其中所述抗体包括完整IgG、Fab抗体或F(ab' )2抗体。
13.根据权利要求12所述的抗体，其中所述抗体结合由艰难梭菌毒素A的残基1500-1850和/或艰难梭菌毒素B残基1500-1851展示的表位。
14.根据权利要求1-9任一项所述的融合蛋白和/或根据权利要求12或权利要求13所述的抗体，用于预防、治疗或抑制CDI ;优选地用于在人类中预防、治疗或抑制CDI。
15.一种用于在人类中预防、治疗或抑制CDI的方法，所述方法包括向所述人类施用治疗有效量的根据权利要求1-9任一项所述的融合蛋白和/或根据权利要求12或权利要求13所述的抗体。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述融合蛋白作为与以下一起的联合疗法的部分施用选自艰难梭菌非毒素抗原、灭活的或减毒的全细胞艰难梭菌细菌、和艰难梭菌细胞提取物的一种或多种另外的抗原；和 a.任选地选自I)来自导致医院感染的细菌的抗原、和2)导致医院感染的灭活的或减毒的全细胞细菌的一种或多种抗原；和 b.任选地一种或多种抗生素，诸如对导致医院感染的细菌有效的抗生素。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述抗体作为与以下一起的联合疗法的部分施用选自结合艰难梭菌非毒素抗原的抗体、和结合全细胞艰难梭菌细菌的抗体的一种或多种另外的抗体；和 a.任选地选自I)结合来自导致医院感染的细菌的抗原的抗体、和2)结合导致医院感染的全细胞细菌的抗体的一种或多种抗体；和 b.任选地一种或多种抗生素，诸如对导致医院感染的细菌有效的抗生素。
18.根据权利要求12或权利要求13所述的抗体在证实患者样品中存在或不存在艰难梭菌感染的体外免疫检验方法中的应用，其中艰难梭菌感染的存在通过检测所述抗体与所述样品中存在的艰难梭菌毒素A和/或毒素B的结合来证实，且其中未能检测所述抗体与所述样品中存在的艰难梭菌毒素A和/或毒素B的结合证实不存在艰难梭菌感染。
19.根据权利要求1-10任一项所述的融合蛋白在证实患者样品中存在或不存在艰难梭菌感染的体外免疫检验方法中的应用，其中艰难梭菌感染的存在通过检测所述融合蛋白与所述样品中存在的抗体的结合来证实，且其中未能检测所述融合蛋白与所述样品中存在的抗体 的结合证实不存在艰难梭菌感染。
全文摘要
本发明涉及基于融合蛋白的重组艰难梭菌(Clostridium difficile)抗原，所述融合蛋白由第一氨基酸序列和第二氨基酸序列组成或包含第一氨基酸序列和第二氨基酸序列，其中a)所述第一氨基酸序列由与由艰难梭菌毒素A序列的残基500-1850或艰难梭菌毒素B序列的残基1500-1851组成的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列提供；和b)所述第二氨基酸序列由与由位于艰难梭菌毒素A序列的氨基酸残基1851-2710或艰难梭菌毒素B序列的氨基酸残基1852-2366中的长重复单元组成的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列提供；而前提是，所述融合蛋白不是包含艰难梭菌毒素A的氨基酸残基543-2710的多肽，且前提是，所述融合蛋白不是包含艰难梭菌毒素B的氨基酸残基543-2366的多肽。还提供了所述抗原用于预防/治疗/抑制艰难梭菌感染(CDI)的应用，以及用于产生所述抗原的方法，用于产生结合所述抗原的抗体的方法，和所述抗体用于预防/治疗/抑制CDI的应用。
文档编号C07K14/33GK103237807SQ201180047913
公开日2013年8月7日 申请日期2011年10月5日 优先权日2010年10月5日
发明者克利福德·肖恩, 埃普丽尔·罗伯茨, 海伦·埃亨, 迈克尔·梅纳德-史密斯, 约翰·兰登 申请人:卫生防护机构, 麦克罗弗姆有限公司