一种蔗渣固定化组合菌及其在土壤多环芳烃菲污染修复中的应用
【专利说明】
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种蔗渣固定化组合菌及其在土壤多环芳烃菲污染修复中的应用，属于环境污染物生物处理技术领域。
【【背景技术】】
[0002]多环芳烃(PAHs)是一类含有2个以上苯环的持久性有机污染物。环境中多环芳烃的污染主要来源于煤、石油、天然气等燃料的燃烧，以及石油的冶炼和交通污染等。我国是PAHs的排放大国，1980年我国排放的美国环保局优先控制的16种PAHs污染物的量为18000吨，到2003年己超过25300吨，而2004年高达114000吨，占世界总量的20%。土壤PAHs污染主要来自大气干湿沉降、污水灌溉、化肥农药施用及秸杆燃烧等。而污水灌溉是我国土壤PAHs污染的最主要方式。由于PAHs具有半挥发性、低溶解性和难生物降解性，常被吸附于土壤颗粒上，在土壤中长期存在且大量积累，因此，土壤承载了环境中90%的PAHs。目前中国经济正处于高速发展期，对煤和石油的需求量还会进一步增加，由此可知，在今后一定时期内土壤中PAHs污染还会进一步加重。
[0003]我国很多地区土壤有多环芳烃检出，并且部分地区土壤多环芳烃污染相当严重。2012年，曹云者等基于文献报道结果，对我国14个省、3个直辖市、2个自治区以及香港特别行政区的表层土壤中16种PAHs及SPAHs的含量分布特征进行了分析，结果土壤SPAHs的平均值为3654.97 μ g/Kg，含量最高区域达到151.6mg/Kg。
[0004]PAHs具有慢性毒性和致癌、致畸、致突变的“三致”作用，土壤中长期大量积累的PAHs可通过食物链的传递，对人类健康构成极大威胁。因此，清除土壤多环芳烃污染对生态环境和人体健康造成的危害已成为目前迫切需要解决的问题之一。
[0005]鉴于土壤多环芳烃(PAHs)污染的严重性和危害性，土壤多环芳烃污染修复技术近年来也受到了广泛关注。微生物修复技术具有安全、有效、廉价和无二次污染的特点，因此，采用微生物降解PAHs被认为是去除环境中PAHs污染物的最有效有段之一。近年来，国内外已经报道了许多高效降解PAHs的微生物，但是这些高效降解菌在实际应用中存在单一菌株竞争不过土著微生物及处理场地的环境不适于高效降解菌的生长等问题，因此，需要通过真菌-细菌联合降解的方式降解难降解的PAHs。
[0006]固定化微生物技术主要是指通过物理或化学的方法将分散游离的微生物固定在限定的空间区域，以提高微生物细胞的浓度，使其保持较高的生物活性并反复利用的方法。固定化微生物由于具有微生物密度大、反应速度快和耐环境冲击特点，因此，该技术有望克服投加到修复现场中的游离高效降解微生物与土著菌的恶性竞争或难以适应环境的问题，实现高效降解菌有效修复污染土壤。为此固定化微生物修复有机污染土壤正受到越来越多的关注。
[0007]目前用作微生物固定化的载体多为成本较高的有机载体，如戊二醛、海藻酸钙、海藻酸钠、聚乙烯醇和聚丙烯酰胺凝胶等，难以适应工业化生产的要求。
[0008]另外，在固定化微生物修复PAHs污染土壤中，联合菌种降解能力高于单个菌种，采用蔗渣固定化真菌-细菌复合菌修复土壤多环芳烃污染有着巨大的应用潜力。
[0009]而菲(phenanthrene)是环境中最常见的多环芳径类污染物，也是烟油和汽车尾气排放多环芳烃的标志物。在污染土壤中菲的检出浓度一般较高。
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【发明内容】
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[0010]本发明的目的在于克服现有固定化微生物降解多环芳烃菲存在的固定化载体成本较高的难题，提供一种能高效、安全且价格低廉的降解土壤多环芳烃菲污染的蔗渣固定化组合菌。
[0011]本发明的另一个目的是提供上述蔗渣固定化组合菌在土壤多环芳烃菲污染修复中的应用。
[0012]本发明为了实现上述目的，采用以下技术方案:
[0013]一种蔗渣固定化组合菌，其特征在于采用蔗渣为载体固定化真菌和细菌的组合，其中所述的真菌为哈茨木霉菌属，所述的细菌为克雷伯氏菌属。
[0014]蔗渣为生物质材料，生物质材料蔗渣固定化微生物体系的蔗渣载体不仅可以屏蔽土著微生物的竞争和不利土壤条件的侵害进而保证其负载的微生生长，还可吸附富集土壤中的多环芳烃污染物，从而增加多环芳烃的生物可利用性，提高固定在其表面上的微生物降解多环芳烃的效率。生物质材料蔗渣是农业废弃物，含有丰富的C、N等营养元素；可向土壤释放天然有机质，改善土壤理化性质，促进土壤微生物活性和数量，增强PAHs去除；对微生物有很强的亲和性；在土壤中可自然降解，用后的处理简单环保，不会造成二次污染；且价格低廉。
[0015]因此，生物质材料蔗渣固定化真菌-细菌修复土壤多环芳烃污染的技术，对消除土壤中多环芳烃污染，避免多环芳烃污染通过食物链的传递对人类健康构成的威胁有着十分重要的意义。
[0016]本发明中的哈茨木霉菌属(Trichoderma harzianum)真菌菌株(以下简称ZGl)与克雷伯氏菌属(Klebsiella sp)细菌(以下简称ZG2)由石油化工厂附近的土壤经选择性富集培养、分离纯化得到。ZG1+ZG2是能以菲为唯一碳源进行生长的菲降解菌。
[0017]本发明中的真菌和细菌在接种于蔗渣载体时预先分别经过培养制备成真菌菌悬液和细菌菌悬液，具体通过以下步骤培养制备而得:
[0018]将纯化后的真菌菌株ZGl和细菌菌株ZG2分别接种于50mL液体培养基中，并将pH调至7.0，于30°C，150r/min的摇床上振荡培养至微生物的生物量最大，一般需要48h，分别取4mL的菌液于离心管内，于4000r/min下离心lOmin，然后将离心管内上清液倒出，补充磷酸缓冲液继续离心lOmin，如此重复3次，制成菌悬液置于4°C冰箱备用。
[0019]本发明中，将真菌菌悬液和细菌菌悬液分别接种于无机盐液体培养液处理过的蔗澄载体上于30°C，转速150rpm的摇床内振荡培养至生物量最大而制得鹿澄固定化组合菌ZG1+ZG2。
[0020]本发明中的真菌菌悬液和细菌菌悬液与处理过的蔗渣的用量比为1:1:2?6(ml/ml/g)，优选真菌菌悬液和细菌菌悬液与处理过的蔗渣的用量比为1:1:3(ml/ml/g)，使得菲降解效率最高。
[0021]本发明中用真菌菌悬液和细菌菌悬液制得蔗渣固定化组合菌的步骤为:
[0022]称取的蔗渣载体，洗净烘干剪碎后加入锥形瓶中，灭菌处理后加入无菌的无机盐液体培养液，再分别加入真菌菌悬液和细菌菌悬液，混匀密封后于30°C，摇床转速为150rpm摇床内振荡培养至蔗渣载体上微生物量达到最大即得蔗渣固定化组合菌ZG1+ZG2，其中所述的无机盐液体培养液与蔗渣载体的用量比为10:3(mL/g)。
[0023]一种上述的蔗渣固定化组合菌ZG1+ZG2在土壤多环芳烃菲污染修复中的应用。
[0024]1、对于菲初始浓度为84.35mg/kg的土壤，蔗渣固定化组合菌ZG1+ZG2和游离组合菌ZG1+ZG2处理25d后，菲的降解率分别为52.89%和94.02%，表明蔗渣固定化组合菌G1+ZG2对菲的降解效果大大优于游离菌。
[0025]2、蔗渣固定化组合菌ZG1+ZG2处理25d后，非灭菌土中菲的降解率达到94.99%,而灭菌土中菲的降解率为90.81%，不管土壤是否灭菌，土壤中菲的降解率都可达到90%以上，因此，土壤微生物对蔗渣固定化组合菌降解土壤中菲的影响较小。
[0026]3、制备蔗渣固定化组合菌时，最佳菌悬液加入量为每15g 土加入ImL组合菌ZG1+ZG2(其中ZGl和ZG2各0.5mL)。采用最佳菌悬液加入量制备的蔗渣固定化组合菌处理初始浓度为84.65mg/kg的菲污染土壤，菲降解率达到94.55%。
[0027]4、土壤中的重金属离子Cd2+和Pb2+对蔗渣固定化组合菌ZG1+ZG2处理土壤中菲均有一定影响，但即便土壤中存在重金属离子Cd2+和Pb2+，蔗渣固定化组合菌对土壤中菲的降解率仍可达到80%以上。这些说明蔗渣固定化不仅有较强的降解土壤中菲的能