一种重度铬污染土壤的真菌修复方法
【专利摘要】本发明公开了一种重度铬污染土壤的真菌修复方法。该方法以Penicillium oxalicum SL2的孢子为修复菌株种源，按比例将重度铬污染土壤与土豆培养基混合做成适合菌株孢子萌发及生长的泥浆，并加入一定量的草酸以加速土壤铬污染的修复效率。将接种了Penicillium oxalicum SL2孢子的泥浆于30℃环境中培养，10天后土壤浸提液中Cr(Ⅵ)浓度从231.8mg/L降到0.7mg/L，去除率达到99.7%，修复后的土壤中生物有效态Cr(Ⅵ)浓度降到44.3mg/kg，比常用的清水浸提法处理土壤减少了98.1%。本发明的方法操作简单，环境友好，可为重度铬污染土壤的微生物修复提供技术支撑。
【专利说明】
一种重度铬污染土壤的真菌修复方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种重度铬污染土壤的真菌修复方法，属于微生物应用技术领域。
【背景技术】
[0002]我国是生产铬盐最多的国家，生产工艺的粗放及除铬工艺的未及时施行导致了大量铬污染场地的产生。据统计，我国超过100处的地方受到铬污染，影响面积超过50000平方公里，一些污染点位的污染水平超标100倍，严重威胁我国生态安全和人群健康，因此，铬污染土壤的快速有效修复已迫在眉睫。
[0003]铬进入土壤后主要以Cr(m)和Cr(VI)两种稳定形态存在。其中Cr(VI)具有致畸性、致癌性和致突变性，且易溶于水，在自然环境中迀移能力极强。而cr(m)水溶性低迀移能力弱，易与有机物结合形成复合物沉淀，且是葡萄糖、脂质和氨基酸代谢的必要微量元素，毒性相对较低。因此，土壤铬污染治理的基本思路是将高毒性的Cr(VI)还原为Cr(m)，降低其健康和生态危害性。
[0004]传统的铬污染土壤修复技术如化学沉淀法、物理隔离法、离子交换法等的施行往往需要消耗大量的化学试剂，昂贵的机件设备费用和运行费用严重阻碍了其大范围推广应用。与此同时，污染物去除不彻底、易产生二次污染等缺陷也是其制约因素。而微生物修复技术由于成本较低以及环境友好等特点，越来越受青睐。自上世纪70年代首次发现卩.(16(3111'01]^1:；^3118能还原0(￥1)以来，研究者分离纯化了大量络还原微生物，如无色杆菌Achromobacter sp.Ch-Ι、微杆菌 Microbacterium sp.MP30、嗜酸硫杆菌Acidith1bacillus th10xidans等。但大多停留在实验室研究阶段，很难进行实际应用。究其原因，主要是铬污染场地中的土壤常具有高盐度、铬含量高的特点，严重抑制了微生物的生长代谢及还原能力，因此，如何利用微生物技术修复重度铬污染土壤成为了目前研究应用的难题。
[0005]本研究组曾公开了一种还原六价铬的草酸青霉及其筛选方法(CN104560738A)，本申请是在此基础上的进一步的应用和拓展。
【发明内容】
[0006]为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种重度铬污染土壤的真菌修复方法。
[0007]本发明的目的通过以下技术方案实现:
一种重度铬污染土壤的真菌修复方法，包括以下步骤:
1)制作Penicilliumoxalicum SL2抱子悬浮液:将Penicillium oxalicum SL2在]3DA培养基平板中培养7-15天，用水冲洗平板表面的孢子，震荡分散后可获得Penicilliumoxalicum SL2的孢子悬浮液；
2)采集铬污染土壤；
3)配制土豆培养基，其配方为:取新鲜马铃薯，去皮，挖掉芽眼，洗净，切片，称200g，切小块，加1000ml水煮沸30min，双层纱布过滤，滤液补足水分到1000ml，在滤液中加入1g葡萄糖，溶解后冷却；
4)根据土壤中毒性Cr(VI)的浓度，按1%-25%(w/v)的比例将铬污染土壤与土豆培养基混合做成泥浆；
5)向步骤4)的泥楽中加入草酸，终浓度50mmol/L;
6)将泥浆的初始pH值调节到4-8;
7)按13?16个/L向步骤6)的泥楽中添加步骤IHjI^WaPenicilliumoxalicum SL2孢子悬浮液，于30 V下曝气培养；
8)修复培养7-15d后，污染土壤修复完成。
[0008]所述的步骤2)中的铬污染土壤风干磨碎后过20目筛。
[0009]本发明的有益效果:
本发明提供了一种重度络污染土壤的真菌修复方法。该方法以Penici 11 ium oxalicumSL2的孢子为修复菌株种源，按比例将重度铬污染土壤与土豆培养基混合做成适合菌株孢子萌发及生长的泥浆，并加入一定量的草酸等小分子有机酸以加速土壤铬污染的修复效率。将接种了Penicillium oxalicum SL2孢子的泥楽于30°C环境中培养，10天后土壤浸提液中Cr (VI)浓度从231.8mg/L降到0.7mg/L，去除率达到99.7%，修复后的土壤中生物有效态Cr(VI)浓度降到44.3mg/kg，比常用的清水浸提法处理土壤减少了 98.1%。本发明的方法操作简单，环境友好，可为重度铬污染土壤的微生物修复提供技术支撑。
【附图说明】
[0010]图1.是Penicillium oxalicum SL2在重污染土壤泥楽中的照片；
图2.是Penicillium oxalicum SL2与重污染土壤颗粒的扫描电镜图；
图3.是Penicillium oxalicum SL2处理土壤浸出液中Cr(VI)的变化图；
图4.是pH对Penicillium oxalicum SL2去除Cr(VI)的影响图；
图5.是接种量对Penicillium oxalicum SL2去除Cr(VI)的影响图；
图6.是Cr(VI)起始浓度对Penicillium oxalicum SL2去除Cr(VI)的影响图；
图7.是盐度对Penicillium oxalicum SL2去除Cr(VI)的影响图。
【具体实施方式】
[0011 ]实施例1: 一种重度铬污染土壤的真菌修复方法
(I)制作Penicillium oxalicum SL2抱子悬浮液。将Penicillium oxalicum SL2在PDA培养基平板中培养10天，用水冲洗平板表面的孢子，震荡分散后获得Penici 11 iumoxalicum SL2的孢子悬浮液。Penicillium oxalicum SL2为本研究组筛选得到，属于现有技术，保存于中国典型培养物菌种保藏管理中心，保藏号为CCTCC N0:M2014505, 2014年10月22日。
[0012] (2)重度铬污染土壤采自杭州某退役化工厂厂区内，该土壤属于碱性土壤(pH为10.2)，土壤有机质含量较低(5.16g/kg)，土壤阳离子交换量为61.97cmol/kg，土壤中总络为7069.6mg/kg，六价格为4385.7mg/kg，此外，土壤中还有Pb、Cd和Cu等重金属污染物，浓度分别为584.3mg/kg, 10.4mg/kg、52.7mg/kg。将污染土壤风干磨碎后过20目筛，按5g/份分装于250ml的锥形瓶中，121°C灭菌60min，完全冷却I天后，于121°C灭菌60min，重复3次。
[0013](3)配置土豆培养基，其配方为:取新鲜马铃薯，去皮，挖掉芽眼，洗净，切片。称200g，切小块，加100ml水煮沸30min，双层纱布过滤，滤液补足水分到100ml。在滤液中加入1g葡萄糖，溶解后于115°C灭菌20min。
[0014](4)按如下方法分组处理污染土壤:A.水+灭菌土壤；B.土豆培养基+灭菌土壤；C.50mmol/L草酸+灭菌土壤;D.50mmol/L草酸+土豆培养基+灭菌土壤;E.孢子悬浮液+土豆培养基+灭菌土壤;F.50mmol/L草酸+孢子悬浮液+土豆培养基+灭菌土壤。按上述处理获得5%(w/v)泥楽，调节pH到6左右，放入磁石，其中的Penici 11 ium oxalicum SL2孢子悬浮液按16个/L添加。每个处理5个重复，于30 0C的环境中培养。
[0015](5)在培养过程中Penicillium oxalicum SL2孢子萌发形成菌丝体小球，如图1。用扫描电镜观察菌丝体的微观结构，如图2所示，菌丝分布于大土壤颗粒的表面，而一些小的土壤颗粒粘附于菌丝体之上。
[0016](6)在培养的过程中检测浸提液中Cr(VI)的浓度，结果表明如图3所示，微生物加草酸的处理组效果最好，其中Cr(VI)浓度从第二天开始显著降低，10天后土壤浸提液中的Cr(VI)浓度从231.8mg/L降到0.7mg/L，去除率达到99.7%。
[0017]将修复培养12d后的土壤烘干至恒重，用DTPA提取的方法检测其中生物有效态Cr(VI)的变化情况，结果表明水浸提法处理组中污染土壤生物有效态Cr (VI)浓度为2315.3mg/kg，而微生物加草酸的处理组土壤中生物有效态Cr(VI)浓度则降低为44.3mg/kg，比常用的水浸提法降低了 98.1%。
[0018]实施例2:pH对Penicilliumoxalicum SL2去除Cr(VI)的影响
配制5g/L的Cr(VI)溶液:称取7.5g重铬酸钾110°C烘2h，然后称取7.073g溶解在500mL水中制成5g/L的Cr (VI)溶液。用0.22um的无菌滤头过滤5g/L的Cr (VI)溶液，用于调节培养基中的Cr(VI)浓度。
[0019]配制土豆培养基:取新鲜马铃薯，去皮，挖掉芽眼，洗净，切片。称200g，切小块，加100ml水煮沸30min，双层纱布过滤，滤液补足水分到1000ml。在滤液中加入1g葡萄糖，溶解后冷却，按50ml/个分装于250ml的三角瓶中，115°C灭菌20min。
[0020]用无菌Cr(VI)溶液调节培养基中的Cr (VI)浓度，使体系中的Cr (VI)约为160mg/L，用浓盐酸调口11到3、4、5、6、7、8、9、11，在不同的时间检测其中(>(￥1)浓度的变化。结果如图4所示，初始pH为4-8时，Penicillium oxalicum SL2都能有效去除Cr(VI);当pH=6时，Penicillium oxalicum SL2去除Cr(VI)的速率相对较快，在培养的第6天Cr(VI)去除率为88.7%，第7天达到96.0%。结果表明Penici 11 ium oxalicum SL2能在pH4?8的环境中处理Cr(VI)污染。
[0021 ] 实施例3:接种量对Penicillium oxalicum SL2去除Cr(VI)的影响
配制浓度为18个/L的孢子悬浮液，再用梯度稀释的方法得到浓度为17个/L、106个/L、15个/L的孢子悬浮液。在盛有土豆培养基的三角瓶中加入无菌Cr(VI)溶液，使得体系中Cr(VI)起始浓度约为160mg L—、按1:100(V/V)接种配好的孢子悬浮液，以无菌水处理为对照，在30°C，200 rpm条件下振荡培养，于第不同时间取样测定培养液中Cr (VI)浓度。结果如图5所示:在培养的第3天，接种的孢子浓度越高，体系中Cr(VI)的浓度越低，但第5天所有处理组中的Cr (VI)都能被还原。表明Penici 11 ium oxalicum SL2孢子接种量为13?16个/L时，能有效处理Cr (VI)污染。
[0022]实施例4:Cr(VI)初始浓度对Penicilliumoxalicum SL2去除Cr(VI)的影响分别往盛有50ml土豆培养基的250ml三角瓶中加入Oml、0.625ml、I.25ml、3.75ml、
7.5m1、12.5ml的经过滤灭菌Cr (VI)母液和12.5m1、11.875ml、11.25ml、8.75ml、5ml、0ml无菌水，使培养中Cr (VI)的终浓度为O、50、100、300、600、1000mg/L。按15个/L接种Penicillium oxalicum SL2孢子，于30°C，200 rpm条件下振荡培养，在不同时间取样测定培养液中Cr (VI)浓度。9天后终止反应。结果如图6所示，300mg/L以下的体系中Cr (VI)能够被还原99%以上，而600mg/L的体系中Cr(VI)还原率为61.7%，1000mg/L的处理体系中Cr(VI)还原率为40.4%，表明Penici 11 ium oxalicum SL2去除Cr (VI)有一定的浓度范围限制，用其修复Cr(VI)污染土壤时需要调节泥浆的配比。
[0023]实施例5:盐度对Penicilliumoxalicum SL2去除Cr(VI)的影响
不同盐度培养基配制:在400ml的烧杯中加入160ml调好pH的培养基，分别加入O、0.16、0.32、0.8、1.6、3.2、8、16 g NaCl，制成含NaCl浓度为O、1、2、5、10、20、50、100 g L-1 的土豆培养基。将培养基分装在250ml的三角瓶中，每个50ml，透气膜封口，115°C灭菌20min。
[0024]在配制好的土豆培养基中加入无菌Cr(VI)母液，使得体系中Cr(VI)起始浓度约为200mg L—S按16个/L接种孢子，在30°C，200 rpm条件下振荡培养，于不同时间检测体系中Cr (VI)浓度。结果如图7所示，所有处理组中Cr ( VI)都能被还原，表明Penici 11 iumoxalicum SL2能应用于高盐的Cr(VI)污染环境。
【主权项】
1.一种重度铬污染土壤的真菌修复方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)制作Penicilliumoxalicum SL2抱子悬浮液:将Penicillium oxalicum SL2在]3DA培养基平板中培养7-15天，用水冲洗平板表面的孢子，震荡分散后可获得Penicilliumoxalicum SL2的孢子悬浮液； 2)采集铬污染土壤； 3)配制土豆培养基，其配方为:取新鲜马铃薯，去皮，挖掉芽眼，洗净，切片，称200g，切小块，加100ml水煮沸30min，双层纱布过滤，滤液补足水分到1000ml，在滤液中加入1g葡萄糖，溶解后冷却； 4)根据土壤中毒性Cr(VI)的浓度，按1%-25%(w/v)的比例将铬污染土壤与土豆培养基混合做成泥浆； 5 )向步骤4 )的泥楽中加入草酸，终浓度50mmo 1/L; 6)将泥浆的初始pH值调节到4-8; 7)按13?16个/L向步骤6)的泥楽中添加步骤I)得到的PeniciIIiumoxalicum子悬浮液，于30 V下曝气培养； 8 )修复培养7-15d后，污染土壤修复完成。2.根据权利要求1所述的真菌修复方法，其特征在于，所述的步骤2)中的铬污染土壤风干磨碎后过20目筛。
【文档编号】B09C1/10GK105855290SQ201610219557
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月11日
【发明人】施积炎, 龙碧波, 叶斌晖, 张舒, 叶基恩, 邹丽娜, 刘青林
【申请人】浙江大学