贪铜菌yns-85及其在土壤修复中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于环境微生物技术领域，尤其涉及一种农药杀菌剂五氯硝基苯降解菌分 离、鉴定及其土壤修复作用。
【背景技术】
[0002] 中草药的研宄与应用已有数千年的历史，其独特的治疗作用受到人们的青睐。由 于我国复杂的地貌环境和气候条件，从而孕育了极为丰富的中草药资源。目前，我国中药资 源总数已达12807种，其中植物11146种，动物类药物1581种，矿物类药物80种，是世界上 最大的药材生产国。而大部分中草药都依赖人工栽培，全国药材种植面积超过580万亩，药 材生产基地600多个，常年栽培的药材达200余种。随着中草药种植规模的扩大，中草药易 受到病虫的危害，特别是在病虫害严重的季节，存在严重的农药滥用现象，导致土壤与植物 体中农残超标。五氯硝基苯（pentachloronitrobenzene，PCNB)属有机氯保护性杀菌剂， 对多种蔬菜的苗期病害及土传病害有较好的防治效果，但其化学性质稳定，不易被降解，随 着施用量的不断增大，其造成的环境与健康问题也日益突出。为解决这一问题，国内外研 宄者也筛选出多株PCNB降解菌，如金色链霉菌（Streptomyces aureofaciens)、孢子丝菌 (S. cyanescens)、总状毛霉菌（M. racemosus)、白腐真菌（Phanerochaete-chrysosporium)、 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa)等，但主要为真菌型降解菌，细菌资源较少，且有 关能降解PCNB的贪铜菌种质资源未被发现。鉴于此，本发明从土壤中分离筛选出一株对 PCNB具有良好降解性能的贪铜菌YNS-85,研宄了该菌PCNB的降解特性，为缓解中草药种植 过程中的农药污染问题提供了科学依据和新思路，具有广泛的应用潜力。
【发明内容】
[0003] 解决的技术问题：本发明针对中药材生产实践中的实际问题和需求，提供了一株 贪铜菌YNS-85及其在土壤修复中的应用。
[0004] 技术方案：贪铜菌（Cupriavidus sp. )YNS_85,该菌株已在国家知识产权局指定的 保藏单位保藏，保藏日期为2015年04月24日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研宄所， 保藏编号：CGMCC No. 10740。
[0005] 贪铜菌YNS-85的培养基，按比例每升培养基含有：KH2PO4O. 5g，Na2HPO4 · 12H20 I. 2g，NH4NO3 0· 5g，MgSO4 · 7H20 0· 2g，FeSO4 0· 05g，酵母粉 2g，微量元素溶液 10mL，有机氮 农药为 40mg，pH 6· 8 ~7· 2。
[0006] 所述有机氮农药为五氯硝基苯。
[0007] 所述微量元素每升含有 50mg Ca(OH)2, 30mg H3BO3, IOmg ZnSO4 · 7H20, 5mg MnSO4 · H20,5mg CuSO4 · 5H20,5mg Na2MoO4 · 2H20。
[0008] 所述贪铜菌YNS-85在五氯硝基污染土壤修复中的应用。
[0009] 五氯硝基污染土壤修复剂，有效成分为贪铜菌（Cupriavidus sp. ) YNS-85。
[0010] 有益效果：贪铜菌YNS-85能降解五氯硝基苯，在溶液体系中培养7d时其降解率达 79. 4%，在土壤中30d时其降解率为56. 9%。
【附图说明】
[0011] 图1为菌株YNS-85的菌落形态特征；
[0012] 图2为菌株YNS-85的透射电镜形态特征；
[0013] 图3为菌株YNS-85的16S rDNA的系统发育树；
[0014] 图4为菌株YNS-85对溶液体系中PCNB的降解曲线；
[0015] 图5为菌株YNS-85对土壤中PCNB的降解曲线。
【具体实施方式】
[0016] 实施例1 :
[0017] 1.材料与方法
[0018] 1.1材料与试剂
[0019] 筛菌供试土壤为云南文山五氯硝基苯污染土壤。标准品PCNB购自北京百灵威化 学技术有限公司。色谱纯正己烷。无水硫酸钠（分析纯）400°C活化6h，冷却后置于玻璃干 燥器中保存待用。
[0020] 1. 2培养基组成
[0021] LB液体培养基：蛋白胨10. 00g，酵母粉5. 00g，氯化钠10. 00g，加去离子水至1L， 调节pH至7.0,固体培养基再按1.5% -2.0%的质量比例加入琼脂。
[0022] 基础盐培养基！KH2PO4 I. 00g，Na2HPO4 I. 2g，NH4NO3 0· 50g，MgSO4 · 7H20 0· 20g， FeSO4 · 7H20 (λ 005g，微量元素溶液 10mL，加超纯水至 1L。用 2mol/L 圆03和 2mol/L NaOH 溶液调整培养基pH值至7. 0。
[0023] 微量元素溶液：Ca (OH) 250mg，H3B0330mg，ZnSO4 · 7H20 10mg，MnSO4 · H2O 5mg， CuSO4 · 5H20 5mg，Na2MoO4 · 2H20 5mg 加去离子水至 IL。
[0024] PCNB液体筛选培养基：PCNB标准物质溶于丙酮，过0. 22 ym无菌滤膜，加入冷却的 无菌基础盐培养基中，静置超净台中待丙酮挥发。
[0025] 1. 3降解菌的筛选、分离与驯化
[0026] 取5g新鲜土壤加入以五氯硝基苯为唯一碳源的基础盐培养基中。30°C，120rpm避 光培养7d后，以5wt. %接种量连续富集，转接4次。取一定稀释的富集培养液150 μ L涂 布至LB培养基上，30°C培养2d。待出现单菌落后，挑取单菌落划线纯化。将纯化后菌株转 接至PCNB为20mg/L的基础盐培养基中，在30°C，120rpm避光培养7d后分析降解菌降解效 果。
[0027] 选取降解效果最好的降解菌作进一步研宄，并命名为YNS-85。将YNS-85菌株置于 20. 0-100. 0mg/L PCNB液体筛选培养基中进行逐级驯化每隔5d考察一次降解能力，待降解 能力基本稳定后停止驯化。
[0028] 1.4降解菌的鉴定
[0029] 对 YNS-85 菌株进行 PCR 扩增的引物采用 27F :5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 和 1492R :5' -TACCTTGTTACGACTT-3'。PCR 反应条件为：95 °C 5min ;95 °C 30s ;55 °C 30s ; 72°C lmin30s ;循环24次；72°C IOmin ;循环24次。得到的PCR扩增产物经过纯化后用I. 2% 琼脂糖凝胶电泳检测。16SrDNA的克隆及序列测定委托美吉（上海）生物医药科技有限公 司完成。将所得序列在GenBank对16SrRNA序列进行同源性比对分析，采用Mega 6. 0构建 系统发育树。生理生化鉴定采用购自嘉合（上海）生物科技有限公司的API 20NE试剂盒。
[0030] 1. 5降解菌YNS-85对溶液中五氯硝基苯的降解性能分析
[0031] 在IOOmL灭菌三角瓶中加入400 μ L浓度为2. 00g/L的PCNB丙酮溶液，静置于超 净台使丙酮充分挥发，再加入19mL灭菌基础盐培养液。取生长至对数期的降解菌YNS-85 菌液，调节菌体密度使得0D600吸光值为I. 0