专利名称：一种多环芳烃污染土壤修复菌剂的制备和使用方法
技术领域：
本发明涉及微生物领域，具体的说是一种多环芳烃污染土壤修复菌剂的制备和使
用方法。
背景技术：
多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocarbons,简称PAHs)是环境中普遍存在 的一类有机污染物，它通常是指一类含有两个或两个以上苯环，以线状、角状或簇状排列的 稠环型化合物，具有熔点和沸点较高、疏水性强、蒸汽压小、正辛醇_水分配系数高等特性。 PAHs是重要的全球性污染物，是美国环保局制定的129种优先污染物中的一类(MCVEETY BD et al，1988)。 环境中PAHs绝大多数积累于土壤中(Wild SR et al， 1995)，在适宜的情况下它 们可能迁移到其他环境介质中，扩大污染范围并改变暴露途径。农田中的PAHs多由污灌所 致，它可以通过农作物以生物链的形式传递，将其积累于人体内，造成人体的损伤。所以多 环芳烃农田污染土壤修复，尤其是强化长期污染土壤的修复显得十分重要和迫切。
多环芳烃污染土壤生物治理的相关研究有较多报道(丁克强等，(2001. 土壤，4 期169-178页)2001 ;Hwangs et al， 2002 ;Chang BV et al， 2002) ， 土壤微生物的降解是 去除PAHs的主要途径。通过表面和亚表面土壤微生物的生物降解是土壤多相系统中去除 PAHs的主要过程，经过适应诱导，土壤中有多种微生物可以利用PAHs作为碳源和能源或利 用其它的物质作为共代谢底物进行多环芳烃的降解、矿化(巩宗强等，(2000.生态学杂志， 19(6) :40-45.))。 多环芳烃污染土壤修复技术在环境治理方面已得到广泛的研究，其中对微生物菌 剂降解效果影响因素的研究相对较少，大部分集中在微生物菌剂技术本身的研究，然而微 生物菌剂所采用的菌种对多环芳烃降解效果的影响也是至关重要的，所以筛选出好的菌种 能够为多环芳烃污染土壤修复技术提供良好的条件，是微生物菌剂制备的基础。以往的微 生物菌种多以土著菌为主(宋志文等，(微生物学杂志20(4) :30-31,41. )2000 ;MeriemB et al， 1994)，引进菌的利用少见报道。
发明内容
本发明目的在于提供一种多环芳烃污染土壤修复菌剂的制备和使用方法。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为 多环芳烃污染土壤修复菌剂菌剂为按重量份数比为l-4 : l-4 : l-4 : l-4
的毛霉、小克银汉、镰刀菌和产黄青霉，余量为含有浓度为50-200mg/L的PAHs的真菌培 养液。所述真菌培养液按重量百分比计为蔗糖0. 05-0. 2%、酵母膏0. 03-0. 06%、 NaCl 0. 01-0. 02%、琴03 0 . 08-0. 15%、KH2P04 0 . 05-0 . 2% 、 MgS04 7H20 0. 01-0. 04% ，余量为 水分；pH5. 5 6. 0。
多环芳烃污染土壤修复菌剂的制备方法1)混合真菌菌悬液的制备将按重量份数为1-4 : 1-4 : 1-4 : 1-4的毛霉、小克银汉、镰刀菌和产黄青霉培养在培养液中，取重
量百分比为2-10%的混合真菌菌悬液接种于盛有培养液的器皿中封口，在25-2『C恒温振 荡培养3-6天；而后取出部分培养液，再补加相同量的培养液继续于恒温培养3-6天，待用；
2) 培养载体将5-10Kg的农作物副产物搅拌均匀于7-10L的Ca(0H)2中，放置过夜，待用；
3) 菌剂的配制将步骤1)所得5-10%的混合真菌菌悬液加入到步骤2)的培养载体中，调 节使其含水量为60% _70%，室温培养7-10天，即为菌剂。 所述真菌培养液按重量百分比计为蔗糖0. 05-0. 2 %、酵母膏0. 03-0. 06 %、 NaCl 0. 01-0. 02%、 NH4N03 0 . 08-0. 15%、 KH2P04 0 . 05-0 . 2%、 MgS04 7H20 0. 01-0. 04%， 余量为水分、pH5. 5 6. 0。所述培养液为含有浓度为50-200mg/L的PAHs的真菌培养液。 所述农作物副产物按重量百分比计为玉米芯80. 0-60. 0%、稻糠10. 0-20. 0%、豆饼粉 3.0-4.0%、石膏(CaS04)0 . 05-1. 00%、 (NH4)2HP04 0 . 05-0. 10%、生石灰(Ca0)0. 8-1. 5%、 MgS04 *7H20 0. 05-0. 10X，余量为水分，pH5. 5 6. 0。所述玉米芯、稻糠和豆饼粉为经粉碎 成O. 2-0. 6cm直径颗粒。所述取出的培养液的量可为培养液体积的1/5-1/3，振荡培养的频 率为110-140r/min。 使用方法将所述菌剂按耕层土壤重的0. 1 % -0. 2 % ，投加到PAHs污染土壤中，处 理42-70天。
本发明具有如下优点 1.经济环保，现有修复PAHs化合物污染土壤的技术，通常采用物理化学技术其投
资将巨大，同时可能导致二次污染，危害生态系统。而本发明采用生物修复技术其耗资小，
不会造成二次污染并且具有持续净化作用，具有良好的社会、经济和生态效益。 2.本发明的菌剂是通过相对高浓度的PAHs类化合物和无机盐营养进行驯化、筛
选而来，其生长、繁殖能力及适应性较强，并能保证在环境中有较高的生物量。 3.本发明的菌剂是由引进菌组成，对环境条件要求不苛刻。对温度、氧气量上也没
有特别严格的要求，同时使用方法简单，易于操作。 4.降解率高，采用本发明的菌剂降解PAHs类污染土壤的降解率达到 65. 35% -66. 00%。
具体实施例方式
下面通过实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1 菌剂为毛霉(Mucor sp.)、小克银汉(Cunninghamella sp.)、镰刀菌(Fusarium sp.)和产黄青霉(Penicilli咖chrysogenum)(菌种购自沈阳应用生态研究所微生物菌种 库)组成，其重量份数为l :1:2: 2，余量为含有浓度为100mg/L的PAHs的真菌培养 液。 所述，真菌培养液按重量百分比计为蔗糖O. 1%、酵母膏0.05%、 NaCl 0.01%、 NH4N03 0. 1%、KH2P04 0. 1 %、 MgS04 7H20 0. 02%、余量为99. 62%为水分，p朋.0。
所述真菌培养液灭菌在0. IMpa湿热灭菌30分钟，待冷却后加入浓度为100mg/L 的PAHs (其购自国药集团化学试剂沈阳有限公司)。
菌剂制备
i)混合真菌菌悬液的制备将按重量份数为i :1:2: 2的毛霉、小克银汉、 镰刀菌和产黄青霉培养在培养液中，取重量百分比为10%的混合真菌菌悬液接种于盛有 250ml盛有100ml培养液的三角瓶中封口 ， 25。C恒温箱振荡培养5天，振荡培养的频率为 130r/min ; 而后取出部分培养液，再补加相同量的培养液继续于25t:恒温箱中培养5天，待 用；所述取出的培养液的量可为培养液体积的1/3。 2)培养载体将5kg的农作物副产物搅拌均匀于9L的Ca (OH) 2中，放置过夜，将过 夜后的培养载体装入耐高压聚乙烯袋中，每袋lkg，O. lMPa间歇灭菌二次，每次60min，冷却 后待用；其中9L的Ca(0H)2为77g CaO溶于9L水中。 3)菌剂的配制将步骤1)所得10%的混合真菌菌悬液加入到步骤2)的培养载体 中，调节使其含水量为60% _70%，室温25t:培养7天，即为菌剂。 所述真菌培养液按重量百分比计为蔗糖O. lX、酵母膏0.05X、NaC10.01X、 NH4N03 0. 1%、KH2P04 0. 1 %、 MgS04 7H20 0. 02%、余量为99. 62%为水分，p朋.0。
所述农作物副产物按重量百分比计为玉米芯60.0%、稻糠15.0%、豆饼粉 3.0%、石膏(CaS04)0. 06%、 (NH4)2HP04 0 . 05%、生石灰(CaO) 1. 0%、 MgS04 7H20 0.08%、 余量为10. 81%为水分，p朋.0。所述玉米芯、稻糠和豆饼粉为经粉碎成0. 2cm直径颗粒。
菌剂的使用方法按耕层土壤重的0.2%，投加菌剂到人工配制含有浓度为 84. 23mg/L的PAHs 土壤中，处理时间为42天。PAHs浓度下降28. 64mg/L，降解率即可达到 66. 00%。人工配制含PAHs 土壤为IOL。
实施例2 菌剂为毛霉(Mucor sp.)、小克银汉(Cunninghamella sp.)、镰刀菌(Fusarium sp.)禾口产黄青霉(Penicilli咖chrysoge誦)组成，其重量份数为2 :2:1: l，余量为 含有浓度为50mg/L的PAHs的真菌培养液。 所述，真菌培养液按重量百分比计为蔗糖O. 15X、酵母膏0.03X、NaCl 0.02%、 NH4N03 0. 15%、KH2P04 0. 2%、MgS04 7H20 0. 03%、99. 42%为水分，pH5. 5。
菌剂制备 i)混合真菌菌悬液的制备将按重量份数为2 :2:i: i的毛霉、小克银汉、
镰刀菌和产黄青霉培养在培养液中，取重量百分比为2%的混合真菌菌悬液接种于盛有 250ml盛有100ml培养液的三角瓶中封口 ， 27。C恒温箱振荡培养3天，振荡培养的频率为 110r/min;而后取出部分培养液，再补加相同量的培养液继续于27t:恒温箱中培养3天，待 用；所述取出的培养液的量可为培养液体积的1/5。 2)培养载体将5kg的农作物副产物搅拌均匀于9L的Ca (OH) 2中，放置过夜，将过 夜后的培养载体装入耐高压聚乙烯袋中，每袋lkg，O. lMPa间歇灭菌二次，每次60min，冷却 后待用；其中9L的Ca(0H)2为77g CaO溶于9L水中。 3)菌剂的配制将步骤1)所得8%的混合真菌菌悬液加入到步骤2)的培养载体 中，调节使其含水量为60% _70%，室温251:培养IO天，即为菌剂。 所述真真菌培养液按重量百分比计为蔗糖O. 15%、酵母膏0.03%、 NaCl 0.02%、NH4N03 0. 15%、KH2P04 0. 2%、MgS04 7H20 0. 03%、余量99. 42%为水分，pH5. 5。
所述农作物副产物按重量百分比计为玉米芯75.0%、稻糠10.0%、豆饼粉4.0%、石膏(CaS04)0. 1 %、 (NH4)2HP04 0. 10%、生石灰(Ca0) 1. 0%、MgS04 7H20 0.05%、余 量为9. 75%为水分，p朋.5。所述玉米芯、稻糠和豆饼粉为经粉碎成0. 6cm直径颗粒。
菌剂的使用方法菌剂的使用方法按耕层土壤重的O. 15%，投加菌剂到人工配 制含有浓度为83. 72mg/L的PAHs 土壤中，处理时间为42天。PAHs浓度下降至29. 01mg/L， 降解率即可达到65. 35%。
实施例3与实施例1不同之处在于 制备方法i)混合真菌菌悬液的制备将按重量份数为3 :3:4: 4的毛霉、小
克银汉、镰刀菌和产黄青霉培养在培养液中，取重量百分比为6%的混合真菌菌悬液接种于 盛有培养液的器皿中封口 ，在28t:恒温振荡培养6天；而后取出部分培养液，再补加相同量 的培养液继续于恒温培养6天，待用；振荡培养的频率为140r/min。 2)培养载体将10kg的农作物副产物搅拌均匀于10L的Ca (OH) 2中，放置过夜，待 用； 3)菌剂的配制将步骤1)所得5%的混合真菌菌悬液加入到步骤2)的培养载体 中，调节使其含水量为60 % -70 % ，室温培养10天，即为菌剂。 所述真菌培养液按重量百分比计为蔗糖0. 05%、酵母膏0. 06%、 NaClO. 015%、 NH4N03 0 . 08%、 KH2P04 0 . 05%、 MgS04 7H20 0. 01%，余量为水分、pH5. 5 6. 0。所述培养 液为含有浓度为200mg/L的PAHs的真菌培养液。所述农作物副产物按重量百分比计为玉 米芯80. 0%、稻糠20. 0%、豆饼粉3. 5%、石膏(CaS04) 1.00%、 (NH4)2HP04 0 . 08%、生石灰 (CaO) 1. 5%、MgS04 7H200. 08%，余量为水分，pH5. 5 6. 0。
权利要求
一种多环芳烃污染土壤修复菌剂，其特征在于菌剂为按重量份数比为1-4∶1-4∶1-4∶1-4的毛霉、小克银汉、镰刀菌和产黄青霉，余量为含有浓度为50-200mg/L的PAHs的真菌培养液。
2. 按权利要求1所述的多环芳烃污染土壤修复菌剂，其特征在于所述真菌培养液按重量百分比计为蔗糖0. 05-0. 2%、酵母膏0. 03-0. 06%、 NaCl 0. 01-0. 02%、 NH4N030. 08-0. 15%、KH2P04 0 . 05-0 . 2%、MgS04 7H200. 01-0. 04%，余量为水分；pH5. 5 6. 0。
3. —种按权利要求1所述的多环芳烃污染土壤修复菌剂的制备方法，其特征在于1)混合真菌菌悬液的制备将按重量份数为l-4 : l-4 : l-4 : l-4的毛霉、小克银汉、镰刀菌和产黄青霉培养在培养液中，取重量百分比为2-10%的混合真菌菌悬液接种于盛有培养液的器皿中封口，在25-28°。恒温振荡培养3-6天；而后取出部分培养液，再补加相同量的培养液继续于恒温培养3-6天，待用；2) 培养载体将农作物副产物加入到Ca(0H)2中搅拌均匀，放置过夜，待用；3) 菌剂的配制将步骤1)所得5-10%的混合真菌菌悬液加入到步骤2)的培养载体中，调节使其含水量为60 % -70 % ，室温培养7-10天，即为菌剂。
4. 按权利要求3所述的多环芳烃污染土壤修复菌剂的制备方法，其特征在于所述真菌培养液按重量百分比计为蔗糖0. 05-0. 2%、酵母膏0. 03-0. 06%、 NaCl 0. 01-0. 02%、NH4N03 0 . 08-0. 15%、KH2P04 0 . 05-0 . 2%、MgS04 7H20 0. 01-0. 04%，余量为水分、pH5. 5 6. 0。
5. 按权利要求3所述的多环芳烃污染土壤修复菌剂的制备方法，其特征在于所述培养液为含有浓度为50-200mg/L的PAHs的真菌培养液。
6. 按权利要求3所述的多环芳烃污染土壤修复菌剂的制备方法，其特征在于所述农作物副产物按重量百分比计为玉米芯80. 0-60. 0 % 、稻糠10. 0-20. 0 % 、豆饼粉3. 0-4. 0%、石膏(CaS04)0. 05-1. 00%、 (NH4)2HP040. 05-0. 10%、生石灰(Ca0)0. 8-1. 5 %、MgS04 7H20 0. 05-0. 10%，余量为水分，pH5. 5 6. 0。
7. 按权利要求6所述的多环芳烃污染土壤修复菌剂的制备方法，其特征在于所述玉米芯、稻糠和豆饼粉为经粉碎成0. 2-0. 6cm直径颗粒。
8. 按权利要求3所述的多环芳烃污染土壤修复菌剂的制备方法，其特征在于所述取出的培养液的量可为培养液体积的1/5-1/3，振荡培养的频率为110-140r/min。
9. 一种按权利要求4所述的多环芳烃污染土壤修复菌剂的使用方法，其特征在于将所述菌剂按耕层土壤重的0. 1% -0. 2%，投加到PAHs污染土壤中，处理42-70天。
全文摘要
本发明涉及微生物领域，具体的说是一种多环芳烃污染土壤修复菌剂的制备和使用方法。菌剂为按重量份数比为1-4∶1-4∶1-4∶1-4的毛霉、小克银汉、镰刀菌和产黄青霉，余量为含有浓度为PAHs的真菌培养液。制备将上述菌种在含有浓度为50-200mg/L的PAHs的真菌培养液中培养，而后将其接种在培养载体上培养，即得。本发明的菌剂是由引进菌组成，对环境条件要求不苛刻。对温度、氧气量上也没有特别严格的要求，同时使用方法简单，易于操作。采用本发明的菌剂降解PAHs类污染土壤的降解率达到65.35％-66.00％。
文档编号C12R1/645GK101724566SQ20081022837
公开日2010年6月9日 申请日期2008年10月29日 优先权日2008年10月29日
发明者付莎莎, 冯倩, 刘宛, 台培东, 姚德明, 许华夏, 鞠京丽 申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所