专利名称：一种用于多环芳烃污染土壤修复的固定化颗粒制备方法
技术领域：
本发明涉及细胞固定化技术，具体的说是一种用于多环芳烃污染土壤修复的固定化颗粒制备方法，其是以玉米芯为主要载体的吸附固定化微生物工艺。
背景技术：
多环芳烃(PAHs)是指2个或2个以上的苯环稠合在一起的一类化合物，它们在环境中普遍存在。人类活动特别是化石燃料的燃烧是环境中PAHs的主要来源。由于该类化合物的辛醇-水分配系数高，水溶性差，常被吸附于土壤颗粒上。因此，土壤就成为PAHs的主要载体。PAHs在土壤中比较稳定而且难于分解，即便采用处理土壤中易挥发、易降解有机污染物较成功的方法也很难去除土壤中的PAHs。多环芳烃在自然界中的积累会对人类以及整个自然界造成极大的危害，一些多环芳烃进入人体和动物体内后，会产生致癌、致畸、致突变的后果。因此，有关PAHs污染土壤的修复技术倍受关注。尽快开发出安全、高效、实用性强的多环芳烃污染土壤修复技术，是科研工作者面临的艰巨而紧迫的任务。
近年来，发展起来的微生物修复技术为PAHs的降解提供了较好的途径，但也存在一些缺陷，如单位体积内有效降解菌浓度低、反应启动慢、与土著菌竞争处于劣势、抗毒性侵害能力差、对环境条件敏感，加入到修复现场环境中的微生物可能由于竞争或难以适应环境而导致作用结果与实验结果有较大出入，使得不能很好的应用于原位污染土壤修复。因此，亟需开发更高效更适合于原位多环芳烃污染土壤修复的新型生物技术，而微生物固定化技术可以克服这些弊端。
所谓固定化技术，是利用化学或物理的手段，将游离的细胞(微生物)或酶定位于限定的空间区域使其保持活性并能反复使用的一种基本技术。其优点是可以大幅度提高参加反应的微生物浓度，固定化后的微生物耐环境冲击性增强，根据需要可选择适宜的微生物，可降低二次污染等优点，因而被广泛用于修复受污染的流体介质(如废水)和半流体介质(如泥浆)环境中。但将固定化微生物用于降解非流体介质(土壤)中有机污染物的研究，国内外尚未见报道。本发明提出了一种用于修复多环芳烃污染土壤的固定化颗粒制备方法。
微生物固定化技术的关键是筛选适宜的载体材料和确定优化的固定化工艺条件。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种用于修复多环芳烃污染土壤的固定化颗粒制备方法。本发明通过系统的正交试验，以玉米芯为主要载体材料，添加不同浓度的促进剂、改良剂，使固定化条件更加简化和温和，提高了固定化微生物的多种技术指标，使其性能更加优良。将制得的固定化颗粒应用于多环芳烃污染土壤的修复，结果表明按照该配方制得的固定化生物产品对高分子量多环芳烃污染土壤具有良好的修复效果，是一种可信赖的新型环保生物产品。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案(固定化颗粒制备方法)为一种用于多环芳烃污染土壤修复的固定化颗粒制备方法，其特征在于以玉米芯为主要载体材料，将新鲜、干燥、经粉碎或辗碎至1.5～2cm玉米芯，与辅料棉仁饼、麸皮、豆饼粉、稻糠和/或麦麸混合，按重量百分比计，其中玉米芯70～85％，辅料15～30％；调节水分重量为含水量40～55％(以“手握成团，落地就散”无游离水渗出为适度)，调pH为6.3～6.5，高压灭菌，接入长满真菌孢子的原种，增殖培养，便制得所需固定化颗粒。
其中玉米芯和辅料的混合物中还添加有它们总重量0.5～1.5％的石膏、1～2％的生石灰，以及1.5～2.5％的(NH4)2HPO4、0.5～1.5％的白糖、0.1～0.3％的MgSO4·7H2O或0.5～1.5％的尿素、2～4％的过磷酸钙。
载体配方可为1.玉米芯2kg，棉仁饼0.2kg，麸皮0.16kg，石膏0.02kg，尿素0.016kg，过磷酸钙0.04kg，石灰0.06kg；2.玉米芯2kg，麸皮0.06kg，豆饼粉0.02kg，尿素0.02kg，过磷酸钙0.06kg，石膏0.02kg，石灰0.06kg；3.玉米芯2kg，棉仁饼0.15kg，尿素0.02kg，过磷酸钙0.05kg，石膏0.02kg，生石灰0.06kg；4.玉米芯80％，稻糠20％，石膏1％，(NH4)2HPO42％，白糖1％，MgSO4·7H2O 0.1％，生石灰1％；5.玉米芯80％，麦麸20％，石膏1％，(NH4)2HPO42％，白糖1％，MgSO4·7H2O 0.1％，生石灰1-2％；其中第4和5两配方较佳。
所述玉米芯在与辅料混合前应先进行软化处理，具体操作方法为采用玉米芯重量0.5～1.5％生石灰溶于水中后，浇入料中，浸透拌匀，盖上薄膜闷24～48h，用水冲洗后即可；所述原种为毛霉、木霉、产黄青霉、黑曲霉和/或曲霉菌种，增殖培养为的避光培养，培养温度为25～32℃；原种的培养基重量组成最好为玉米粒98～99％，石膏1～2％，pH6.3～6.5；其中还可添加培养基总重量0.1～0.3％的KH2PO4，0.05～0.2％的MgSO4·7H2O，0.5～1％的尿素；较佳的原种培养基配方为玉米粒99％，石膏1％，KH2PO40.1％，MgSO4·7H2O 0.05％，尿素0.8％。
本发明具有如下优点1.本发明通过优化载体配方各组分的含量，采用软化等技术，制备的固定化颗粒为微生物提供了更适合的微环境，与土著菌的竞争力增强，对环境中毒物的抗性增加，可以在不良环境中仍然发挥高效降解菌对多环芳烃的降解作用；载体表面具有许多化学活性基团，这些基团经该固定化方法活化后可以与微生物偶联，使微生物细胞吸附到玉米芯载体表面，或者以共价方式与玉米芯结合，提高了固定化效率；该固定化方法简单易行，适宜原位土壤大规模修复。
2.本发明通过向载体中添加麦麸、稻糠等辅助材料，使得C、N比更适合微生物生长，菌丝体密集且粗壮，穿透性、传质性增强，从而极大地缩短了固定化微生物的制备周期，提高了对多环芳烃的降解能力；高分子量多环芳烃一般以共代谢的方式被降解，玉米芯除作为微生物载体外，还可为微生物提供初级共代谢底物，诱导微生物产生降解多环芳烃所必需的酶类，从而实现对高分子量多环芳烃的共代谢降解；固定化颗粒对受芘(PYR或苯并[a]芘(BaP)等高分子量多环芳烃污染土壤的修复中具有明显的修复效果，在投粒比10％、修复时间56d的条件下，土壤中PYR去除率为81.2％，最高可达90％，而对BaP的去除率为62％，较游离菌提高20％。
3.本发明亦可用于产黄青霉属、青霉属、毛霉属、木酶属等多种菌种的固定化，是一种普适的固定化方法。载体材料价格便宜，成本低，来源广泛，通气性良好，无毒，不会造成土壤的二次污染，亦可增加土壤肥力。
具体实施方案下面通过实例对本发明作进一步详细说明。
实施例1(1)固定化菌斜面培养在装有无机盐培养基(蔗糖4.0％，(NH4)2HPO40.4％，KH2PO40.1％，MgSO4·7H2O 0.05％，维生素B10.005％，pH6.5)的试管中接种毛霉，置于28～30℃培养箱中培养3d。
(2)原种制备选取新鲜无霉变玉米粒，煮30min，装入培养瓶中，用聚乙烯薄膜塑料密封，于121℃条件下高压灭菌90min，置于无菌室中待温度降至20℃，用接种环在斜面培养基上接入真菌孢子，密封，放入30℃恒温培养箱中，待玉米粒上长满灰白色菌丝时取出，备用。
(3)固定化载体预处理将新鲜、干燥、经粉碎或辗碎至1.5～2cm大小的玉米芯，1％生石灰溶于水中后，浇入料中，浸透拌匀，盖上薄膜闷24h，用自来水冲洗2次，然后与其他辅料混合均匀(玉米芯80％，稻糠20％，石膏1％，(NH4)2HPO42％，白糖1％，MgSO4·7H2O 0.1％，生石灰1％)，含水量50％，调pH6.5，分装瓶中，压实，打孔后用聚乙烯薄膜塑料密封，高温蒸汽灭菌90min，置于无菌室中待温度降到20℃，备用。
(4)固定化颗粒制备取8粒长满真菌孢子的玉米粒原种，接入装有载体的培养瓶，密封后放入28℃恒温培养箱中避光培养，待菌丝体穿透玉米芯载体，布满培养瓶，便制得以玉米芯为载体的固定化颗粒。
经上述步骤制得的固定化颗粒周期短，只需24d，孢子数1×106个/g。
(5)对受多环芳烃污染土壤修复效果将制备好的固定化颗粒按10％投粒比，投入受多环芳烃污染的土壤中，56d后，土壤中PYR的去除率为75％；土壤中BaP的去除率为48％。在整个降解过程中，固定化颗粒的降解速度快，90d后固定化颗粒仍然具有90％以上的活性。
实施例2与实施例1不同处之一在于原种制备时配方为玉米粒99％，石膏1％，KH2PO40.1％，MgSO4·7H2O 0.05％，尿素0.8％，高温蒸汽灭菌后，接入孢子悬着液，1×104孢子/ml，于28℃恒温培养10d后即可制得原种；不同处之二在于在载体的预处理过程中，辅料成分由稻糠改为麦麸，即玉米芯80％，麦麸20％，石膏1％，(NH4)2HPO42％，白糖1％，MgSO4·7H2O0.1％，生石灰1-2％，高压蒸汽分两次灭菌，第1次，121℃，60min，第2次，121℃，30min，冷却后接入原种，密封，室温下培养，白天温度25-28℃，夜间温度15-20℃，待菌丝体穿透玉米芯载体，布满培养瓶，便制得了以玉米芯为载体的固定化颗粒。
经上述步骤制得的固定化颗粒周期只需10d，孢子数5×106个/g。
固定化颗粒按照10％投粒比修复受多环芳烃污染的土壤，修复56d，PYR的去除率为85％，BaP的去除率为54％。
实施例3与实施例1不同之处在于没有原种制备过程，而是直接采用母种进行固定化。在载体的制备过程中，玉米芯未经软化处理，直接与辅料混合制得载体。结果表明，按照该法制备的固定化颗粒，虽然因没有原种的培养阶段而缩短了5d时间，但固定化颗粒培养增殖时间却延长了11d，35d才长满瓶，而且固定化颗粒孢子数少，1×104个/g。
经该法制得的固定化颗粒按照10％投粒比修复受多环芳烃污染的土壤，56d后，PYR的去除率为70％，BaP的去除率仅为30％。
实施例4与实施例2不同之处在于在修复受多环芳烃污染土壤的过程中，采用的是两种真菌共固定的方式投加。按照实施例3制得5种不同菌株的固定化颗粒，分别为固定化毛霉、木霉、产黄青霉、黑曲霉和曲霉，两两组合，按1∶1比例投加到土壤中，不同时间测定土壤中芘和BaP的残留量。结果表明不同固定化颗粒间对多环芳烃降解作用存在相加、协同或抑制效应，其中固定化产黄青霉颗粒与固定化毛霉颗粒组合对多环芳烃的降解效果最好，56d后，PYR的降解率90％，BaP的降解率58％。
实施例5与实施例2不同之处在于在修复受多环芳烃污染土壤的过程中，采用三种不同固定化颗粒的联合修复方式，按照实施例3的方法分别制备固定化产黄青霉、固定化毛霉和固定化黑曲霉，按照1∶1∶1投粒比，接种于不同湿度污染土壤中，56d后，PYR的降解率90％，BaP的降解率62％，而且降解效果不受土壤湿度条件的限制。
实施例6(1)固定化菌斜面培养在装有无机盐培养基(葡萄糖2％，土豆20％，KH2PO40.1％，MgSO4·7H2O 0.05％，酵母膏0.3％，pH6.5)的试管中接种毛霉，置于28-30℃培养箱中培养3d。
(2)原种制备选取新鲜无霉变玉米粒，煮30min，与辅料(载体总重量1％的石膏，0.1％的KH2PO4，0.05％的MgSO4·7H2O，0.8％的尿素)混均后一起装入培养瓶中，用聚乙烯薄膜塑料密封，于121℃条件下高压灭菌120min，置于无菌室中待温度降至25℃，用接种环在斜面培养基上接入真菌孢子，密封，放入30℃恒温培养箱中，待玉米粒上长满灰白色菌丝时取出，备用。
(3)固定化载体预处理将新鲜、干燥、经粉碎或辗碎至1.5～2cm大小的玉米芯，1％生石灰溶于水中后，浇入料中，浸透拌匀，盖上薄膜闷48h，用自来水冲洗3次，然后与其他辅料混合均匀(玉米芯80％，稻糠20％，石膏1％，(NH4)2HPO42％，白糖1％，MgSO4·7H2O 0.1％，生石灰1％)，含水量45％，调pH6.3，分装瓶中，压实，打孔后用聚乙烯薄膜塑料密封，1个压高温蒸汽灭菌90min，置于无菌室中待温度降到25℃，备用。
(4)固定化颗粒制备取10粒长满真菌孢子的玉米粒原种，按10％接种量将原种接入装有载体的培养瓶，密封后放入25℃恒温培养箱中避光培养30天，待菌丝体穿透玉米芯载体，布满培养瓶，除去表面老的菌丝体，便制得以玉米芯为载体的固定化颗粒。
权利要求
1.一种用于多环芳烃污染土壤修复的固定化颗粒制备方法，其特征在于以玉米芯为主要载体材料，将新鲜、干燥、经粉碎或辗碎至1.5～2cm玉米芯，与辅料棉仁饼、麸皮、豆饼粉、稻糠和/或麦麸混合，按重量百分比计，其中玉米芯70～85％，辅料15～30％；调节水分重量为含水量40～55％，调pH为6.3～6.5，高压灭菌，接入长满真菌孢子的原种，增殖培养，便制得所需固定化颗粒。
2.按照权利要求1所述用于多环芳烃污染土壤修复的固定化颗粒制备方法，其特征在于其中玉米芯和辅料的混合物中还添加有它们总重量0.5～1.5％的石膏、1～2％的生石灰，以及1.5～2.5％的(NH4)2HPO4、0.5～1.5％的白糖、0.1～0.3％的MgSO4·7H2O或0.5～1.5％的尿素、2～4％的过磷酸钙。
3.按照权利要求1所述用于多环芳烃污染土壤修复的固定化颗粒制备方法，其特征在于所述玉米芯在与辅料混合前应先进行软化处理，具体操作方法为采用玉米芯重量0.5～1.5％生石灰溶于水中后，浇入料中，浸透拌匀，盖上薄膜闷24～48h，用水冲洗后即可。
4.按照权利要求1所述用于多环芳烃污染土壤修复的固定化颗粒制备方法，其特征在于所述原种为毛霉、木霉、产黄青霉、黑曲霉和/或曲霉菌种，增殖培养为避光培养，培养温度为25～32℃。
5.按照权利要求1或4所述用于多环芳烃污染土壤修复的固定化颗粒制备方法，其特征在于所述原种的培养基重量组成为玉米粒98～99％，石膏1～2％，pH6.3～6.5。
6.按照权利要求5所述用于多环芳烃污染土壤修复的固定化颗粒制备方法，其特征在于原种的培养基中还添加有培养基总重量0.1～0.3％的KH2PO4，0.05～0.2％的MgSO4·7H2O，0.5～1％的尿素。
全文摘要
本发明涉及细胞固定化技术，具体的说是一种用于多环芳烃污染土壤修复的固定化颗粒制备方法，以玉米芯为主要载体材料，将新鲜、干燥、经粉碎或辗碎至1.5～2cm玉米芯，与辅料棉仁饼、麸皮、豆饼粉、稻糠和/或麦麸混合，按重量百分比计，其中玉米芯70～85％，铺料15～30％；调节水分重量为含水量40～55％，调pH为6.3～6.5，高压灭菌，接入长满真菌孢子的原种，增殖培养，便制得所需固定化颗粒。本发明的优点为成本低，固定化效率高，方法简单易行，适宜原位土壤大规模修复。
文档编号B09C1/10GK1952124SQ20051004747
公开日2007年4月25日 申请日期2005年10月21日 优先权日2005年10月21日
发明者苏丹, 李培军, 鞠京丽 申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所