一种油田污水中硫酸盐还原菌的分离纯化方法
【专利摘要】本发明公开了一种油田污水中硫酸盐还原菌的分离纯化方法，具体包括以下步骤：(1)SRB富集培养基的制备；(2)SRB分离培养基的制备；(3)SRB的富集培养；(4)SRB的分离培养；(5)SRB的纯化培养，本发明具有分离纯化的速度快，从SRB富集和分离培养基的制备到纯化培养物只需要3d～5d，分离纯化的成功率高，一次分离纯化既可得到纯化培养物，操作简单、对操作人员要求较低，针对性强，本方法只适合进行SRB菌种分离纯化，因此，可广泛地应用于油田污水中硫酸盐还原菌的分离纯化中。
【专利说明】—种油田污水中硫酸盐还原菌的分离纯化方法
一、【技术领域】
[0001]本发明属于石油微生物【技术领域】，特别涉及一种油田污水中硫酸盐还原菌的分离纯化方法。
二、【背景技术】
[0002]硫酸盐还原菌(SRB)是利用油田产出液中的硫酸盐或者其它氧化态硫化物作为电子受体来异化有机物质的微生物，它将S042_还原成H2S,进而改变油田水质的pH值和金属的腐蚀状态，是金属腐蚀速率显著增加的重要因素，对油田管网带来腐蚀、堵塞等诸多有害作用。
[0003]分离和纯化SRB获得纯种的SRB单菌株，可以为油田环境的菌落结构分析以及腐蚀现状和水质情况的评价提供重要的理论依据。
[0004]现有的SRB分离纯化方法有以下三种:稀释摇管法、叠皿夹层法和Hungate滚管法，但目前的方法存在着以下问题:(1)稀释摇管法观察和挑取菌落比较困难，费时、费力效率低；(2)叠皿夹层法适用范围小，分离纯化的成功率低，往往需要3次?6次重复的分离纯化才能得到相对纯化培养物；(3)Hungate滚管对设备操作人员要求较高，操作复杂，分离纯化效果低；(4)三种方法分离方法时间均需要1d以上。
三、
【发明内容】
[0005]本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种油田污水中硫酸盐还原菌的分离纯化方法。该方法具有工艺简单、操作方便、材料易得、针对性强，对操作人员及设备要求较低、经济实用、分离纯化速度快和成功率高的优点。
[0006]一种油田污水中硫酸盐还原菌的分离纯化方法，其特征在于，具体包括以下步骤:
[0007]1、SRB富集培养基的制备
[0008]将富集培养基溶于蒸馏水中，厌氧分装到容积为25ml的厌氧管中，每管分装9ml，121°C高压蒸汽灭菌30min。
[0009]其中，富集培养基配方为乳酸钠质量浓度0.4%?0.6%、硫酸亚铁铵质量浓度0.05%?0.2%、酵母浸粉质量浓度0.05%?0.1 %、氯化钠质量浓度0.5%?2.0 %、氯化镁质量浓度0.01%?0.03%。
[0010]2、SRB分离培养基的制备
[0011]将分离培养基溶于蒸馏水中，加热至充分溶解，然后厌氧分装到容积为25ml的厌氧管中，每管15ml，121°C高压蒸汽灭菌30min，灭菌完后自然降温至50°C?55°C备用。
[0012]其中，分离培养基配方为蛋白胨质量浓度0.8%?1.2%、肉浸粉质量浓度0.9 %?1.1 %、乳酸钠质量浓度0.4%?0.6 %、硫酸亚铁铵质量浓度0.05 %?0.2 %、酵母浸粉质量浓度0.05%?0.1 %、氯化钠质量浓度0.5%?2.0 %、氯化镁质量浓度0.01%?0.03%、琼脂粉质量浓度0.8%?1.5%。
[0013]3、SRB的富集培养
[0014]取油田污水Iml注入上述制备好的富集培养基中，30°C?60°C恒温培养至培养液变黑为止，得到富集培养物。
[0015]4、SRB的分离培养
[0016]取Iml上述富集培养物用制备好的富集培养基按照10倍系列稀释法稀释至10_4，将10_3和10_4梯度的稀释液用Iml无菌注射器取0.1ml，分别缓慢注入至上述50°C?55°C备用的分离培养基中，混合均匀，垂直静置放置0.5h?Ih得到透明的半固体培养基，然后置于恒温培养箱中培养，培养温度为30°C?60°C，培养至培养基中出现黑点为止，得到分离培养物。
[0017]5、SRB的纯化培养
[0018]取I管上述富集培养基，用Iml无菌注射器抽取0.2ml富集培养基，接着用该注射器吸入分离培养物中轮廓清晰的黑点，然后注入该管富集培养基中，放置在恒温培养箱中培养，培养温度30°C?60°C，培养Id?3d直到培养液变黑，得到纯化培养物。
[0019]其中，所述步骤2中的灭菌完后自然降温，为确保降温均匀，降温过程中缓慢滚动厌氧管。
[0020]所述步骤3中的油田污水，其现场采集后进行密封处理在4°C下保藏不超过7d。
[0021]本发明与现有技术相比具有如下优点:
[0022](I)操作简单、对操作人员要求较低；
[0023](2)针对性强，本方法只适合进行SRB菌种分离纯化；
[0024](3)分离纯化的速度快，从SRB富集和分离培养基的制备到纯化培养物只需要3d ?5d ;
[0025](4)分离纯化的成功率高，一次分离纯化既可得到纯化培养物。
[0026]四、说明书附图
[0027]附图1为区块A硫酸盐还原菌的分离培养物；
[0028]附图2为区块A硫酸盐纯化培养物显微照片；
[0029]附图3为区块B硫酸盐还原菌的分离培养物；
[0030]附图4为区块B硫酸盐纯化培养物显微照片；
[0031]附图5为区块C硫酸盐纯化培养物显微照片。
五、【具体实施方式】
:
[0032]下面结合【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
[0033]实施例1
[0034]利用本发明的方法对胜利油田某区块A产出水中的SRB进行分离纯化，区块A产出水的温度为30°C，具体步骤如下:
[0035]1、SRB富集培养基的制备
[0036]将富集培养基溶于蒸馏水中，厌氧分装到容积为25ml的厌氧管中，每管分装9ml，121°C高压蒸汽灭菌30min。
[0037]其中，富集培养基配方为乳酸钠质量浓度0.4%、硫酸亚铁铵质量浓度0.05%、酵母浸粉质量浓度0.07 %、氯化钠质量浓度1.0 %、氯化镁质量浓度0.03%。
[0038]2、SRB分离培养基的制备
[0039]将分离培养基溶于蒸馏水中，加热至充分溶解，然后厌氧分装到容积为25ml的厌氧管中，每管15ml，121°C高压蒸汽灭菌20min，灭菌完后自然降温至50°C备用，为确保降温均匀，降温过程中缓慢滚动厌氧管。
[0040]其中，分离培养基配方为蛋白胨质量浓度0.8%、肉浸粉质量浓度0.9%、乳酸钠质量浓度0.5%、硫酸亚铁铵质量浓度0.1 %、酵母浸粉质量浓度0.1 %、氯化钠质量浓度2.0%,氯化镁质量浓度0.02%、琼脂粉质量浓度1.2%。
[0041]3、SRB的富集培养
[0042]现场采集区块A油田污水样品后进行密封处理，并在4°C下保藏2d，取油田污水Iml注入上述制备好的富集培养基中，30°C恒温培养至培养液变黑为止，得到富集培养物。
[0043]4、SRB的分离培养
[0044]取Iml上述富集培养物用制备好的富集培养基按照10倍系列稀释法稀释至10_4，将10_3和10_4梯度的稀释液用Iml无菌注射器取0.1ml，分别缓慢注入至上述50°C备用的分离培养基中，混合均匀，垂直静置放置0.5h得到透明的半固体培养基，然后置于恒温培养箱中培养，培养温度为30°C，培养至培养基中出现黑点为止，得到分离培养物，见附图1。
[0045]5、SRB的纯化培养
[0046]取I管上述富集培养基，用Iml无菌注射器抽取0.2ml富集培养基，接着用该注射器吸入分离培养物中轮廓清晰的黑点，然后注入该管富集培养基中，放置在恒温培养箱中培养，培养温度30°C，培养Id直到培养液变黑，得到纯化培养物，纯化培养物的显微照片见附图2。
[0047]实施例2
[0048]利用本发明的方法对胜利油田某区块B产出水中的SRB进行分离纯化，区块B产出水的温度为48°C，具体步骤如下:
[0049]1、SRB富集培养基的制备
[0050]将富集培养基溶于蒸馏水中，厌氧分装到容积为25ml的厌氧管中，每管分装9ml，121°C高压蒸汽灭菌20min。
[0051]其中，富集培养基配方为乳酸钠质量浓度0.5%、硫酸亚铁铵质量浓度0.2%、酵母浸粉质量浓度0.1 %、氯化钠质量浓度0.5%、氯化镁质量浓度0.01 %。
[0052]2、SRB分离培养基的制备
[0053]将分离培养基溶于蒸馏水中，加热至充分溶解，然后厌氧分装到容积为25ml的厌氧管中，每管15ml，121°C高压蒸汽灭菌25min，灭菌完后自然降温至52°C备用，为确保降温均匀，降温过程中缓慢滚动厌氧管。
[0054]其中，分离培养基配方为蛋白胨质量浓度1.0%、肉浸粉质量浓度1.0%、乳酸钠质量浓度0.4%、硫酸亚铁铵质量浓度0.2%、酵母浸粉质量浓度0.05%、氯化钠质量浓度
1.0%、氯化镁质量浓度0.03%、琼脂粉质量浓度0.8%。
[0055]3、SRB的富集培养
[0056]现场采集区块B油田污水后进行密封处理，并在4°C下保藏5d，取油田污水Iml注入上述制备好的富集培养基中，48°C恒温培养至培养液变黑为止，得到富集培养物。
[0057]4、SRB的分离培养
[0058]取Iml上述富集培养物用制备好的富集培养基按照10倍系列稀释法稀释至10_4，将10_3和10_4梯度的稀释液用Iml无菌注射器取0.1ml，分别缓慢注入至上述52°C备用的分离培养基中，混合均匀，垂直静置放置0.7h得到透明的半固体培养基，然后置于恒温培养箱中培养，培养温度为48°C，培养至培养基中出现黑点为止，得到分离培养物，见附图3。
[0059]5、SRB的纯化培养
[0060]取I管上述富集培养基，用Iml无菌注射器抽取0.2ml富集培养基，接着用该注射器吸入分离培养物中轮廓清晰的黑点，然后注入该管富集培养基中，放置在恒温培养箱中培养，培养温度48°C，培养2d直到培养液变黑，得到纯化培养物，纯化培养物的显微照片见附图4。
[0061]实施例3
[0062]利用本发明的方法对胜利油田某区块C产出水中的SRB进行分离纯化，区块C产出水的温度为60°C,具体步骤如下:
[0063]1、SRB富集培养基的制备
[0064]将富集培养基溶于蒸馏水中，厌氧分装到容积为25ml的厌氧管中，每管分装9ml，121°C高压蒸汽灭菌25min。
[0065]其中，富集培养基配方为乳酸钠质量浓度0.6%、硫酸亚铁铵质量浓度0.1 %、酵母浸粉质量浓度0.05%、氯化钠质量浓度0.08%、氯化镁质量浓度0.02%。
[0066]2、SRB分离培养基的制备
[0067]将分离培养基溶于蒸馏水中，加热至充分溶解，然后厌氧分装到容积为25ml的厌氧管中，每管15ml，121°C高压蒸汽灭菌30min，灭菌完后自然降温至55°C备用，为确保降温均匀，降温过程中缓慢滚动厌氧管。
[0068]其中，分离培养基配方为蛋白胨质量浓度1.2%、肉浸粉质量浓度1.1%、乳酸钠质量浓度0.6%、硫酸亚铁铵质量浓度0.05%、酵母浸粉质量浓度0.08%、氯化钠质量浓度0.5%,氯化镁质量浓度0.01%、琼脂粉质量浓度1.5%。
[0069]3、SRB的富集培养
[0070]现场采集区块区块C油田污水样品后进行密封处理，在4°C下保藏ld，取油田污水Iml注入上述制备好的富集培养基中，60°C恒温培养至培养液变黑为止，得到富集培养物。
[0071]4、SRB的分离培养
[0072]取Iml上述富集培养物用制备好的富集培养基按照10倍系列稀释法稀释至10_4，将10_3和10_4梯度的稀释液用Iml无菌注射器取0.1ml，分别缓慢注入至上述55°C备用的分离培养基中，混合均匀，垂直静置放置Ih得到透明的半固体培养基，然后置于恒温培养箱中培养，培养温度为60°C，培养至培养基中出现黑点为止，得到分离培养物。
[0073]5、SRB的纯化培养
[0074]取I管上述富集培养基，用Iml无菌注射器抽取0.2ml富集培养基，接着用该注射器吸入分离培养物中轮廓清晰的黑点，然后注入该管富集培养基中，放置在恒温培养箱中培养，培养温度60°C，培养3d直到培养液变黑，得到纯化培养物，纯化培养物的显微照片见附图5。
【权利要求】
1.一种油田污水中硫酸盐还原菌的分离纯化方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤: (1)SRB富集培养基的制备 将富集培养基溶于蒸懼水中，厌氧分装到容积为7.8ml的厌氧瓶中，每瓶分装7ml,121 °C高压蒸汽灭菌，其中，富集培养基配方为乳酸钠质量浓度0.4%?0.6%、硫酸亚铁铵质量浓度0.05 %?0.2 %、酵母浸粉质量浓度0.05 %?0.1 %、氯化钠质量浓度0.5 %?2.0 %、氯化镁质量浓度0.01%?0.03% ; (2)SRB分离培养基的制备 将分离培养基溶于蒸馏水中，加热至充分溶解，然后厌氧分装到容积为7.8ml的厌氧瓶中，每管7ml，121°C高压蒸汽灭菌，灭菌完后自然降温至50°C?55°C备用，其中，分离培养基配方为蛋白胨质量浓度0.8%?1.2%、肉浸粉质量浓度0.9%?1.1%、乳酸钠质量浓度0.4%?0.6 %、硫酸亚铁铵质量浓度0.05 %?0.2 %、酵母浸粉质量浓度0.05 %?0.1%、氯化钠质量浓度0.5 %?2.0 %、氯化镁质量浓度0.0I %?0.03 %、琼脂粉质量浓度0.8%?1.5% ； (3)SRB的富集培养 取油田污水0.2ml注入上述制备好的富集培养基中，恒温培养至培养液变黑为止，得到富集培养物； (4)SRB的分离培养 取0.77ml上述富集培养物用制备好的富集培养基按照10倍系列稀释法稀释至10_4，将10_3和10_4梯度的稀释液用Iml无菌注射器取0.1ml，分别缓慢注入至上述50°C?55°C备用的分离培养基中，混合均匀，垂直静置放置0.5h?Ih得到透明的半固体培养基，然后置于恒温培养箱中培养，培养至培养基中出现黑点为止，得到分离培养物； (5)SRB的纯化培养 取I管上述富集培养基，用Iml无菌注射器抽取0.2ml富集培养基，接着用该注射器吸入分离培养物中轮廓清晰的黑点，然后注入该管富集培养基中，放置在恒温培养箱中培养，直到培养液变黑，得到纯化培养物。
2.根据权利要求1所述的油田污水中硫酸盐还原菌的分离纯化方法，其特征在于，所述的121°C高压蒸汽灭菌，灭菌时间为20min?30min。
3.根据权利要求1或2所述的油田污水中硫酸盐还原菌的分离纯化方法，其特征在于，所述的灭菌完后自然降温，为确保降温均匀，降温过程中缓慢滚动厌氧管。
4.根据权利要求1或2所述的油田污水中硫酸盐还原菌的分离纯化方法，其特征在于，所述取油田污水现场采集后进行密封处理在4°C下保藏不超过7d。
5.根据权利要求1所述的油田污水中硫酸盐还原菌的分离纯化方法，其特征在于，所述的恒温培养至培养液变黑为止，得到富集培养物，恒温培养温度为30°C?60V。
6.根据权利要求1或5所述的油田污水中硫酸盐还原菌的分离纯化方法，其特征在于，所述的置于恒温培养箱中培养，培养至培养基中出现黑点为止，得到分离培养物，恒温培养温度为30°C?60°C。
7.根据权利要求1或5所述的油田污水中硫酸盐还原菌的分离纯化方法，其特征在于，所述的放置在恒温培养箱中培养，直到培养液变黑，得到纯化培养物，恒温培养温度为30。。?60。。。
8.根据权利要求7所述的油田污水中硫酸盐还原菌的分离纯化方法，其特征在于，所述的放置在恒温培养箱中培养，直到培养液变黑，得到纯化培养物，培养时间为Id?3d。
【文档编号】C12N1/20GK104312962SQ201410584993
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年10月27日 优先权日:2014年10月27日
【发明者】潘永强, 徐鹏, 袁长忠, 王刚, 徐闯, 李彩风, 杜春安, 王静, 宋欣, 张守献, 曹嫣镔 申请人:中国石油化工股份有限公司, 中国石油化工股份有限公司胜利油田分公司采油工艺研究院