专利名称：用于检测和表征产毒性艰难梭菌菌株的方法
技术领域：
本发明属于生物和化学领域。具体地，本发明属于分子生物学领域。更具体地，本发明属于核酸的检测和实时PCR的领域。最具体地，本发明涉及产毒性艰难梭菌 (Clostridium difficile)菌株的检测和表征。
背景技术：
艰难梭菌是梭菌属的革兰阳性细菌。梭菌是厌氧芽孢杆菌。艰难梭菌是抗生素相关性腹泻(AAD)的最严重原因并且可导致假膜性结肠炎、严重结肠感染，通常因抗生素对正常肠道菌群的根除引起。天然定居在体内的艰难梭菌变得生长过度生长过度是有害的，因为细菌释放可引发胃气胀、便秘和腹痛腹泻(diarrhea with abdominal pain)的毒素，所述症状可变得严重。潜伏症状通常模拟某些流感样症状。中断病因的抗生素治疗(causative antibiotic treatment)通常是有疗效的。艰难梭菌感染的严重性可从无症状变化至严重和威胁生命，特别地是在老年人中。人最常在医院、医护疗养所或公共机构获得感染，虽然社区、门诊发生的艰难梭菌感染日益增加。艰难梭菌获得速率据估计在具有长达2周的住院期的患者中为13%，在具有4周以上的住院期的患者中为50%。艰难梭菌结肠炎的频率和严重度仍然很高并且似乎与增加的死亡率相关。早期干预和侵入性管理是恢复的关键因素。在 2005 (Dial S, Delaney J, Barkun A, Suissa S (2005). "Use of gastric acid-suppressive agents and the risk of community-acquired Clostridium difficile-associated disease". JAMA 294 (23): 2989 - 95. doi:10. 1001/ jama. 294. 23. 2989)中报导了据认为在北美引发地理上分散的暴发的抗氟喹诺酮抗生素例如盐酸环丙沙星制剂(Cipro)(环丙沙星)和左氧氟沙星制剂(Levaquin)(左氧氟沙星) 的艰难梭菌的新型高毒性菌株的出现。在2003 年 6 月 4 日，在加拿大的 Montreal, Quebec 和 Calgary, Alberta 报导了该细菌的高毒株的2次暴发。对于2003年中和2004年的前几个月内的约1，400病例，来源使死亡数处于低至36与高至89之间。艰难梭菌感染在2004年后期继续成为Quebec医疗保障体系的问题。截至2005年3月，其已传播至Toronto，Ontario区域，使10人住院。相似的暴发在2003与2005年之间于联合王国的Moke Mandeville医院发生。已有人提议加拿大和英国的暴发都与该细菌的似乎更毒的株NAP1/BI/027相关。 该菌株，也称为Quebec菌株，也牵涉在两个荷兰医院(Harderwijk和Amersfoort，两个都在2005年)暴发的流行病。解释027的增强的毒力的理论是其为毒素A和B的超级生产者(hyperproducer)以及某些抗生素可能实际上刺激细菌过量生产。当分析具有芽孢(spore)的患者的群体时，无症状的许多患者将该生物传递给免疫受损从而对不断增加的腹泻率和不良结果易感的个体。似乎值得注意的是上述群代表了对试图通过结合信息技术与临床监督来理解疾病如何传播的流行病学家的挑战。2006年10月1日，根据国家卫生局调查，艰难梭菌据认为在8个月中在Leicester, England的医院杀死至少49人。2006年10月27日，在Quebec, Canada，该细菌促成9例死亡。2007 年 2 月 27 日，在Mississauga, Ontario 的 iTrillium 医疗中心鉴定了新的暴发，其中14人被诊断为具有该细菌。该细菌与Quebec的细菌是相同的菌株。官方未能确定艰难梭菌是否是在先前的2个月中造成4个患者死亡的原因。2007 年 10 月，Maidstone and Tunbridge Wells NHS Trust 在其对 2004 年 4 月至2006年9月之间在Kent的医院发生的艰难梭菌大暴发的处理方面受到医疗保健委员会的严厉批评。在其报告中，委员会估计约90个患者"明确地或可能“死于感染(医疗保健委员会新闻禾高Healthcare watchdog finds significant failings in infection control at Maidstone and Tunbridge Wells NHS Trust, 11 October 2007 and Daily Telegraph, Health Secretary intervenes in superbug row, 11 October 2007)0因此，需要用于检测和表征样品中的产毒性艰难梭菌菌株的方法。发明概述
本发明已发现用于检测和表征样品中的产毒性艰难梭菌菌株的开拓性方法。有利方面是可在一个单一方法中解决多个诊断问题。该方法现在允许指定样品为包含高毒性艰难梭菌菌株。而且，该方法现允许将样品评定为非NAP1/BI/027菌株。同样地，可将样品评定为 NAP1/BI/027菌株。其也可被评定为核糖体型078菌株，或被评定为017菌株。因此，在单个测定中，可进行所有上述指定。本发明涉及用于检测和表征样品中的产毒性艰难梭菌菌株的方法，其中进行下列步骤，(a)提供样品，(b)在多重PCR测定中，(c)就细胞毒素tcdB基因的存在或不存在分析样品，(d)就tcdC基因的下列缺失的一个或更多个的存在或不存在分析样品(a) SEQ ID NO. 1中核苷酸330至核苷酸347的18 bp缺失，(b) SEQ ID NO. 1中核苷酸301至核苷酸336的36 bp缺失，(c) SEQ ID NO. 1中核苷酸341至核苷酸370的39 bp缺失，(d) SEQ ID NO. 1中核苷酸313至核苷酸366的M bp缺失和(e) SEQ ID NO. 1的位点117 上的单核苷酸缺失。本发明还涉及用于进行本发明的方法的试剂盒，其包括用于扩增和/或检测(i) 细胞毒素tcdB基因、(ii) tcdA基因的1.8 kb缺失、(iii)tcdC基因的SEQ ID NO. 1核苷酸330至核苷酸347的18 bp缺失、(iv)tcdC基因的SEQ ID NO. 1核苷酸341至核苷酸370的39 bp缺失、(v) SEQ ID NO. 1的位点117上的单核苷酸缺失的引物和/或探针和用于(vi)检测二元毒素cdtA/B基因的引物和/或探针。“聚合酶链式反应"或’’ PCR' ’是指用于通过DNA的互补链的同时引物延伸体外扩增特定DNA序列的反应。换句话说，PCR是用于产生侧翼连接引物结合位点的靶核酸的多个拷贝或复制物的反应，此类反应包括下列步骤的一个或更多个重复(i)使靶核酸变性，(ii)使引物与引物结合位点退火，和(iii)在核苷三磷酸存在的情况下利用核酸聚合酶延伸引物。通常，在热循环仪中经历针对各步骤最优化的不同温度使反应循环进行。具体温度、各步骤的持续时间以及步骤之间改变的速率取决于本领域技术人员公知的许多因素，如由参考资料McPherson 等人，editors, PCR: A Practical Approach 和 PCR2 A Practical Approach (分别地，IRL Press, Oxford, 1991 和 1995)所示例的因素。例如，在使用iTaq DNA聚合酶的常规PCR中，可在高于90° C的温度下使双链靶核酸变性，在50-75° C范围内的温度下使引物退火，以及在72-78° C范围内的温度下延伸引物。术语〃 PCR 〃包括反应的衍生形式，包括但不限于实时PCR、巢式PCR、定量PCR、多重 PCR 等。反应体积在数百纳升例如200 nl至数百微升的范围内。在本文中，优选体积为每反应室10-50微升，更优选约25微升。“实时PCR"是指用于随着反应进行，监测反应产物即扩增子的量的PCR。存在许多相异主要在于用于监测反应产物的检测化学的实时PCR形式，例如Gelfand等人，美国专利 5，210，015 ("taqman") ； Wittwer 等人，美国专利 6，174，670 和 6，569，627 (嵌入染料)；Tyagi等人，美国专利5，925，517 (分子信标)。实时PCR的检测化学综述于Mackay 等人，Nucleic Acids Research, 30: 1292-1305 (2002)。在实时 PCR 中，也可使用两温度阶段反应，在所述反应中聚合温度等于退火温度，即使对于常见的杂交探针如蝎型引物或Pleiades探针也如此。"多重PCR"是指其中在相同的反应混合物中同时进行多个靶序列(或单个靶序列和一个或更多个参照序列)的PCR，例如Bernard等人，Anal. Biochem. , 273: 221-228 (1999)(双色实时PCR)。通常，对于每一个待扩增的序列，使用不同组的引物。通常，多重 PCR中的靶序列的数目在2至10，或2至8或更常见地，3至6的范围内。对于本发明，优选数目为2-6。"定量PCR"是指经设计用以测量样品或样本中的一种或更多种靶序列的丰度的 PCR0定量PCR包括此类靶序列的绝对定量和相对定量。使用可以与靶序列分别或一起测定的一个或更多个参照序列进行定量测量。参照序列对于样品或样本来说可以是内源或外源的，在后一种情况下，其可包括一个或更多个竞争者模板。常见的内源参照序列包括下列基因的转录物的区段pactin、GAPDH、微球蛋白、核糖体RNA等。用于定量PCR的技术对于本领域技术人员来是公知，如下列参考文献所例示的’ Freeman等人，Biotechniques， 26: 112-126 15 (1999) ； Becker-Andre等人，NucleicAcids Research, 17: 9437-9447 (1989) ； Zimmerman等人，Biotechniques, 21: 268—279 (1996) ； Diviacco等人，Gene, 122: 3013-3020 (1992) ； BeckerAndre等人，NucleicAcidsResearch, 17: 9437-9446 (1989)；等等。“引物“是指在与多核苷酸模板形成双链体后能够用作核酸合成的起始点并且沿着模板从其3’末端延伸以便形成延长的双链体的天然或合成的寡核苷酸。通常利用核酸聚合酶例如DNA或RNA聚合酶来进行引物的延伸。延伸过程中添加的核苷酸的序列由模板多核苷酸的序列决定。通常利用DNA聚合酶延伸引物。引物通常具有在14至40个核苷酸的范围内，或在18至36个核苷酸的范围内的长度。将引物用于多种核酸扩增反应，例如使用单个引物进行的线性扩增反应或利用两个或更多个引物进行的聚合酶链式反应。选择用于特定应用的引物的长度和序列的指导对于本领域技术人员来说是公知的，如由下列参考资料所证明的Dieffenbach, editor, PCR Primer: A Laboratory Manual,第2版(Cold Spring Harbor Press, New York, 2003)。“样品“是指其中寻求靶核酸的检测或测量的来自生物、环境、医疗或患者来源的一些物质。在一个方面其意指包括样本或培养物(例如，微生物培养物)。在另一个方面，其意指包括生物和环境样品。样品可包括合成来源的样本。生物样品可以是动物包括人，液
6体、固体(例如，粪便)或组织，以及液体和固体食品和饲料产品及成分例如乳制品产品、蔬菜、肉和肉副产品和废料。生物样品可包括采自患者的材料，包括但不限于培养物、血液、唾液、脑脊髓液、胸膜液、精液、针抽吸物(needle aspirate)等。生物样品可从家畜的所有不同家族以及未驯服的动物或野生动物(包括但不限于这样的动物如有蹄类动物、熊、鱼、啮齿类动物等)获得。环境样品包括环境材料例如表面物质、土壤、水和工业样品以及获自食品和乳制品加工仪器、装置、设备、器具、一次性和非一次性产品的样品。这些实例不被解释为限定适用于本发明的样品类型。术语“样品”和“样本”可互换使用。
优选扩增产物描述于下表中
mmrn | |SHQ U) M)2tcdli wm I'D 1120 CAWAGATGAAACTATACi ACTTACTRrTACArrATC TC A AGG Απ ACXT ATA ATT ΟΓΑΑΓΤΑΤΓΛ'Ι'ΛΟΛΙ ΟΤ GTAAGITTAGGTGCAGCA ATCAAAGAGCTAAGTGAA MOAGTGACX3tedB f|f iff j-2) 140 "rrrTccrcc'AOfTA ATACA CTTGATGAAAACTTACJAA GGAG AAGCAATTGATfTT ACTGGAAAAITAATTATrG ΑΓΟΛΑΛΑΤΛΤΙΙ ΤΤΛΤΓΤ TGATCiATAATTATAGAGG Aocrcrr ACiAATCJCiAAAOA AWAGATGGTG
权利要求
1.用于检测和表征样品中的产毒性艰难梭菌菌株的方法，其中进行下列步骤，a.提供样品；b.在多重PCR测定中，i就细胞毒素tcdB基因的存在或不存在分析所述样品； 就tcdC基因中的一个或更多个下列缺失的存在或不存在分析所述样品，a)SEQ ID NO. 1中核苷酸330至核苷酸；347的18 bp缺失；b)SEQ ID NO. 1中核苷酸301至核苷酸336的36 bp缺失；c)SEQ ID NO. 1中核苷酸341至核苷酸370的39 bp缺失；d)SEQ ID NO. 1中核苷酸313至核苷酸366的M bp缺失；e)SEQ ID NO. 1中位点117上的单核苷酸缺失。
2.权利要求1的方法，其中就肠毒素tcdA基因1.81Λ缺失的存在或不存在额外地分析样品。
3.权利要求1或2的方法，其中就二元毒素cdtA和/或cdtB的存在或不存在额外地分析样品。
4.权利要求1至3的方法，其中就如下方面分析所述样品，a.所有下列缺失的存在或不存在b.SEQ ID NO. 1中核苷酸330至核苷酸347的18 bp缺失、SEQ ID NO. 1中核苷酸 341至核苷酸370的39 bp缺失，c.SEQ ID NO. 1的位点117上单个核苷酸的缺失，d.细胞毒素tcdB基因的存在或不存在，e.1.8 1Λ tcdA缺失的存在或不存在，和f.cdtA/B 二元毒素基因的存在或不存在。
5.上述权利要求的任一项的方法，其中a.如果tcdB基因序列存在，tcdA缺失不存在，SEQID NO. 1的位点117上的单核苷酸缺失不存在，所述18 bp缺失也不存在，所述39 bp缺失也不存在，那么所述样品被评定为产毒性艰难梭菌，b.如果tcdB基因序列存在，tcdA缺失不存在，SEQID NO. 1的位点117上的单核苷酸缺失存在，所述18 bp缺失存在，所述cdtA/B 二元毒素基因存在，那么样品被评定为核糖体型027艰难梭菌菌株，c.如果tcdB基因序列存在，tcdA缺失存在，SEQID NO. 1的位点117上的单核苷酸缺失不存在，所述18 bp缺失也不存在，SEQ ID NO. 1中核苷酸341至核苷酸370的39 bp 缺失也不存在，并且cdtA/B 二元毒素基因不存在，那么样品被为评定为核糖体型017艰难梭菌菌株，和d.如果tcdB基因序列存在，tcdA缺失不存在，SEQID NO. 1中核苷酸341至核苷酸 370的39 bp缺失存在，并且cdtA/B 二元毒素基因存在，那么样品被评定为核糖体型078艰难梭菌菌株。
6.上述权利要求的任一项的方法，其中在反应混合物中存在荧光指示剂的情况下在封闭系统中进行所述多重扩增反应，荧光指示剂能够在扩增反应中产生与各扩增子的存在和 /或量相关的光学信号和在扩增反应中监测荧光指示剂的光学信号。
7.权利要求6的方法，其中所述封闭系统为用户提供光学输出，指示权利要求5的评定分配。
8.权利要求1至6的方法，其中多重PCR测定中的所述扩增产物大小为60至200bp。
9.权利要求1至7的方法，其中所述多重PCR扩增是定量实时PCR。
10.权利要求1至9的方法，其中所述样品是人或动物粪便。
11.包含一个或更多个通道或小室的封闭系统扩增筒，所述通道或小室包含用于扩增和/或检测⑴细胞毒素tcdB基因、(ii) tcdA基因的1.8 kb缺失、(iii)tcdC基因的SEQ ID NO. 1核苷酸330至核苷酸；347的18 bp缺失、(iv) tcdC基因的SEQ ID NO. 1核苷酸 341至核苷酸370的39 bp缺失、(v) SEQ ID NO. 1的位点117上的单核苷酸缺失的引物和 /或探针和用于检测二元毒素cdtA/B基因的引物和/或探针。
12.用于实施上述权利要求的任一项的方法的试剂盒，其包括用于扩增和/或检测(i) 细胞毒素tcdB基因、(ii) tcdA基因的1.8 1Λ缺失、(iii)tcdC基因的SEQ ID NO. 1核苷酸330至核苷酸347的18 bp缺失、(iv)tcdC基因的SEQ ID NO. 1核苷酸341至核苷酸 370的39 bp缺失、(v) SEQ ID NO. 1的位点117上的单核苷酸缺失的引物和/或探针和用于(vi)检测二元毒素cdtA/B基因的引物和/或探针。
全文摘要
本发明涉及用于检测和表征样品中的产毒性艰难梭菌菌株的方法，其中进行下列步骤，(i)提供样品，(ii)在多重PCR测定中，(iii)就细胞毒素tcdB基因的存在或不存在分析样品，(iv)就tcdC基因中的一个或更多个下列缺失的存在或不存在分析样品:(a)SEQIDNO.1中核苷酸330至核苷酸347的18bp缺失，(b)SEQIDNO.1中核苷酸(301)至核苷酸(336)的36bp缺失，(c)SEQIDNO.1中核苷酸(341)至核苷酸(370)的39bp缺失，(d)SEQIDNO.1中核苷酸(313)至核苷酸(366)的54bp缺失和(e)SEQIDNO.1的位点117上的单核苷酸的缺失。本发明还涉及各个试剂盒以及引物和探针。
文档编号C12Q1/68GK102378817SQ201080014449
公开日2012年3月14日 申请日期2010年3月31日 优先权日2009年4月7日
发明者E. 维塞尔 A., T. C. 范登博加尔德 P. 申请人:皇家飞利浦电子股份有限公司