专利名称：用于检测硫酸盐还原菌的引物和荧光探针的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于检测微生物的引物和探针。
背景技术：
硫酸盐还原菌(sulfate reducing bacteria，SRB)是一类与硫酸盐还原反应相关的细菌的总称。由革兰氏阴性菌(如脱硫弧菌属Desulfovibrio，脱硫杆菌属Desulfobacterium)、革兰氏阳性菌(脱硫肠状菌属Desulfotomaculum)、嗜热细菌(热脱硫菌属Thermodesulfobacterium)和嗜热古细菌(古生球菌属Archaeoglobus)等多种微生物构成。
SRB菌通过一系列复杂的生物化学反应将硫酸盐还原成H2S和大量的硫化物，硫化物和H2S不仅腐蚀油田生产设备；而且其腐蚀产物(金属硫化物)不溶于水，导致污水发黑、悬浮固体含量增加，使处理后水中悬浮固体含量超标，严重的危害了油田的正常生产。因此，快速定量检测硫酸盐还原菌对于油田水质检测和地面系统杀菌剂浓度的合理调节具有重要的生产指导意义。但是，目前SRB菌的定量检测方法(如绝迹稀释法等)存在检测时间长、非特异性高、检测结果偏低的缺陷。
发明内容
本发明的目的是为了解决目前SRB菌的定量检测方法存在检测时间长、非特异性高、检测结果偏低的缺陷，而提供的用于检测硫酸盐还原菌的引物和荧光探针。
用于检测硫酸盐还原菌的上游引物基因序列为5’-CGCTGAAATGACCATGATGG-3’；下游引物基因序列为5’-CGCGCATTTCACGAAGC-3’。
用于检测硫酸盐还原菌的荧光探针由报告荧光基团、淬灭荧光基团和探针基因序列组成；探针基因序列为5’-CTGAAGCCTTACGAAGATCG-3’，探针基因序列5’端标记的报告荧光基团是FAM，探针基因序列3’端标记的淬灭荧光基团是TAMRA。
SO42-/SO32-的氧化还原电位太低，致使硫酸根(或亚硫酸根)不能直接接受电子，因此硫酸根(或亚硫酸根)离子的还原首先需要硫酸根(或亚硫酸根)离子活化。在硫酸腺苷转移酶的作用下硫酸盐还原菌以ATP为代价将硫酸根离子激活，经过复杂的生物化学反应生成H2S。所以，腺苷酰硫酸还原酶(adenosine-5′-phosphosulfate reductase，APS)是硫酸盐还原菌还原硫酸盐生成H2S的关键酶。腺苷酰硫酸还原酶是一种寡聚铁硫黄素蛋白，含有一分子黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和12个原子的铁和不稳定硫；APS基因在硫酸盐还原菌中具有保守性结构框架，APS蛋白结构中包含有典型的硫酸盐-亚硝酸盐还原酶的保守框架CP-Xn-C-X2-C-X2-C框架，能与[4Fe4S]结合，是SRB菌共有的一个稳定靶位点；所以，本发明根据腺苷酰硫酸还原酶基因序列的保守区域设计了具有特异性的引物和荧光探针。本发明引物和荧光探针特异性高，在引物和荧光探针的双重作用下假阳性大幅降低。使用本发明的引物和荧光探针进行荧光定量PCR检测硫酸盐还原菌，检测时间短、从样本的模板DNA提取到荧光定量PCR检测全过程仅需6h。
图1是具体实施方式
四中以pGEM-T-DSR为底物的PCR扩增曲线图，图1中曲线①模板浓度为5.65×107copies/μL的PCR扩增曲线，②模板浓度为5.65×106copies/μL的PCR扩增曲线，③模板浓度为5.65×105copies/μL的PCR扩增曲线，④模板浓度为5.65×104copies/μL的PCR扩增曲线，⑤模板浓度为5.65×103copies/μL的PCR扩增曲线，⑥模板浓度为0 copies/μL的PCR扩增曲线；图2是具体实施方式
四中硫酸盐还原菌荧光定量检测标准曲线图。
具体实施例方式
具体实施方式
一本实施方式用于检测硫酸盐还原菌的上游引物基因序列(FP)为5’-CGCTGAAATGACCATGATGG-3’；下游引物基因序列(RP)为5’-CGCGCATTTCACGAAGC-3’。
本实施方式检测引物根据APS基因在硫酸盐还原菌中具有的保守性结构框架而特异性设计、合成。
具体实施方式
二本实施方式用于检测硫酸盐还原菌的荧光探针由报告荧光基团、淬灭荧光基团和探针基因序列组成；探针基因序列为5’-CTGAAGCCTTACGAAGATCG-3’，探针基因序列5’端标记的报告荧光基团是FAM，探针基因序列3’端标记的淬灭荧光基团是TAMRA。
本实施方式荧光探针的基因序列根据APS基因在硫酸盐还原菌中具有的保守性结构框架而特异性设计、合成。
具体实施方式
三本实施方式采用荧光定量PCR法检测硫酸盐还原菌1、设计、合成检测引物和荧光探针根据APS基因在硫酸盐还原菌中具有的保守性结构框架设计、合成特异性引物和荧光探针。上游引物基因序列(FP)为5’-CGCTGAAATGACCATGATGG-3’；下游引物基因序列(RP)为5’-CGCGCATTTCACGAAGC-3’；探针基因序列为5’-CTGAAGCCTTACGAAGATCG-3’，探针基因序列5’端标记的报告荧光基团是FAM，探针基因序列3’端标记的淬灭荧光基团是TAMRA。引物和荧光探针的合成由生物工程公司完成。
2、引物和荧光探针检验(1)制备标准品(硫酸盐还原菌)基因片段。标准品基因片段PCR反应体系(20μL)为硫酸盐还原菌模板基因20ng，TagDNA聚合酶终浓度为0.3U，4种dNTP各0.3mmol/L，标准品上游引物(基因序列为5’-GGGYCTKTCCGCYATCAAYAC-3’)0.1μmol/L，标准品下游引物(基因序列为5’-GCACATGTCGAGGAAGTCTTC-3’)0.1μmol/L和余量的去离子水。标准品PCR反应程序为94℃预热5min，94℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸90s，循环30次，最后72℃延伸10min。
TagDNA聚合酶购自于宝生物工程(大连)有限公司。
(2)连接、转化。将上一步(步骤2(1))得到的PCR产物(标准品基因片段)用明胶回收试剂盒(宝泰克)切胶回收，然后与pGEM-T载体连接，再转化到大肠杆菌TOP10感受态细胞中。
pGEM-T购自于美国Promega公司，大肠杆菌TOP10感受态细胞购自于北京天为时代科技有限公司。
(3)蓝白斑筛选。在加入氨苄青霉素Amp(5μg/mL)和X-gal的LB固体培养基上进行筛选。
(4)检测阳性质粒基因序列。提取白色质粒基因，再用pGEM-T载体引物T7和SP6扩增，并测序。质粒基因提取使用上海华舜生物有限公司出品的DNA小量细菌提取试剂盒，基因测序工作由生物工程公司完成，质粒中插入序列为921bp，如SEQ ID NO4所示。
3、硫酸盐还原菌荧光定量检测灵敏度检测和绘制标准曲线图(1)检测pGEM-T-DSR的浓度。
(2)换算为拷贝数。拷贝数换算公式为
拷贝数换算公式中C为pGEM-T-DSR的浓度，单位μg/μL；载体和目的片段的单位bp。
(3)质粒溶液(10×)梯度稀释。以稀释后的质粒溶液为模板，以水为对照组，以FP、RP为引物，进行实时荧光定量RT-PCR检测。在实时荧光定量RT-PCR的40个循环结束后，利用分析软件Opticon Monitor2.02，根据输入的模板量和产生的荧光信号，计算出硫酸盐还原菌荧光定量检测标准曲线。
4、硫酸盐还原菌实时检测(1)实时PCR反应体系(25μL)，如表1所示。
表1
并在孔板上设阴性对照，以水为对照样。
(2)实时PCR反应程序95℃预变性5min，94℃变性5s，60℃退火温度30s，72℃延伸45s，40个循环，72℃延伸2min；温度转换率为20℃/s。在每个循环的60℃(退火)时进行荧光信号检测。
(3)检测结果判定阳性对照中CT值(域值循环数)小于28，阳性样品中扩增曲线明显；阴性对照CT值大于35，阴性对照中无扩增曲线。
本实施方式步骤4中油田污泥或污水污泥样品按以下步骤获得(一)1mL污泥震荡5min，然后在3000r/min的条件下离心3～5min，留上清液；(二)加入上清液2倍体积的10×PBS进行洗涤，震荡5min，然后在12000r/min的条件下离心5min，去掉上清液；(三)加入10×PBS缓冲液100μL，然后超声波40s；(四)用上海华舜生物有限公司出品的DNA小量细菌提取试剂盒进行后续的DNA提取。
本实施方式阳性质粒中插入的基因序列中589bp～608bp与本实施方式用于检测硫酸盐还原菌的上游引物基因序列一致；阳性质粒中插入的基因序列中805bp～821bp与本实施方式用于检测硫酸盐还原菌的下游引物基因序列一致；阳性质粒中插入的基因序列中734bp～753bp与本实施方式用于检测硫酸盐还原菌的荧光探针的基因序列一致。
本实施方式采用美国MJ公司生产的MJResearch Opticon TM2实时荧光系统进行荧光定量PCR。
根据荧光定量PCR仪测出的数据和硫酸盐还原菌荧光定量检测标准曲线可以定量的计算出样品中硫酸盐还原菌的数量。本实施方式检测记数更加准确，假阳性大幅降低。本实施方式检测结果仅需要6个小时，大大节省了检测时间，在油田实际生产中更具有实际指导意义。
具体实施方式
四本实施方式采用荧光定量PCR法检测硫酸盐还原菌，与具体实施方式
三的不同点是步骤3(1)中经检测pGEM-T-DSR的浓度为5.65×107copies/μL。
步骤3(3)质粒溶液(10×)梯度稀释。以稀释后的质粒溶液为模板，以水为对照组，以FP、RP为引物，进行荧光定量RT-PCR检测，并由计算机绘制出以pGEM-T-DSR为底物的PCR扩增曲线图(如图1所示)。图1中从左至右6条曲线依次是模板浓度为5.65×107copies/μL、5.65×106copies/μL、5.65×105copies/μL、5.65×104copies/μL、5.65×103copies/μL和0 copies/μL(对照组)的PCR扩增曲线。在实时荧光定量RT-PCR的40个循环结束后，利用分析软件Opticon Monitor2.02，根据输入的模板量和产生的荧光信号，计算出硫酸盐还原菌荧光定量检测标准曲线(如图2所示)。其它步骤及参数与实施方式三相同。
本实施方式硫酸盐还原菌荧光定量检测标准曲线公式Y＝-0.30X+11.21；相关系数为r2＝0.999。结果表明，样品拷贝数与其相应的CT值具有良好的相关性，可用于硫酸盐还原菌的定量检测。
本实施方式与常规检测方法绝迹稀释法(most probable number，MPN)-Griess法检测结果进行比较，两种检测方法的检测结果如表2所示。
表2
检测结果说明本实施方式检测方法的检测精度比常规方法(绝迹稀释法)提高两个数量级。
序列表<110>哈尔滨工业大学<120>用于检测硫酸盐还原菌的引物和荧光探针<160>6<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于检测硫酸盐还原菌的上游引物，根据APS基因在硫酸盐还原菌中的保守性结构框架而设计。
<400>1cgctgaaatg accatgatgg 20<210>2<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于检测硫酸盐还原菌的下游引物，根据APS基因在硫酸盐还原菌中的保守性结构框架而设计。
<400>2cgcgcatttc acgaagc 17<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>检测硫酸盐还原菌的探针基因序列，根据APS基因在硫酸盐还原菌中的保守性结构框架而设计。
<400>3ctgaagcctt acgaagatcg 20<210>4<211>921<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>阳性质粒中插入的基因序列。
<400>4gggtctgtcc gccatcaaca cctacctggg tgaaaacgac gccgacgact acgtccgcat 60ggtccgcacc gaccttatgg gcctggttcg cgaagacctt atcttcgacg taggccgtca 120cgttgacgac tccgtgcatc tatttgaaga ttggggcctt ccctgctgga tcaagggcga 180agacggccac aacctgaacg gcgctgccgc caaggctgct ggcaagagcc tgcgcaaggg 240cgatgcccct gtgcgttccg gccgctggca gatcatgatc aacggtgaat cctacaagtg 300catcgtggcc gaagctgcca agaatgccct gggtgaagac cgcatcatgg aacgtatctt 360catcgtgaag ctgcttctcg ataagaacac ccccaaccgc atcgccggcg ccgtgggctt 420caacctgcgc gccaacgaag tgcacatctt caaagccaac accatcatgg tggccgctgg 480cggtgccgtt aacgtgtacc gtccccgctc caccggtgaa ggcatgggcc gtgcatggta 540tcctgtgtgg aacgctggtt ctacctacac catgtgcgct caggttggcg ctgaaatgac 600catgatggaa aaccgcttcg tgcccgcccg cttcaaggac ggttacggcc ccgtgggtgc 660gtggttcctc ctgttcaagg ccaaagccac taactccaag ggtgaagatt attgcgccac 720caaccgcgcc atgctgaagc cttacgaaga tcgcggctac gccaagggcc atgtcattcc 780gacctgcctg cgtaaccaca tgatgcttcg tgaaatgcgc gaaggccgcg gccccatcta 840catggacacc aagagcgccc tgcagaacac cttcgcgacc ctgaacgaag aacagcagaa 900ggatcttgaa tccgaagctt g 921<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>硫酸盐还原菌标准品的上游引物。
<220>
<221>misc_feature<222>(4，7，13，19)<223>k＝g或t/u；y＝t/u或c<400>5gggyctktcc gcyatcaaya c 21<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>硫酸盐还原菌标准品的下游引物。
<400>6gcacatgtcg aggaagtctt c 2权利要求
1.用于检测硫酸盐还原菌的引物，其特征在于用于检测硫酸盐还原菌的上游引物基因序列为5’-CGCTGAAATGACCATGATGG-3’；下游引物基因序列为5’-CGCGCATTTCACGAAGC-3’。
2.用于检测硫酸盐还原菌的荧光探针，其特征在于用于检测硫酸盐还原菌的荧光探针由报告荧光基团、淬灭荧光基团和探针基因序列组成；探针基因序列为5’-CTGAAGCCTTACGAAGATCG-3’，探针基因序列5’端标记的报告荧光基团是FAM，探针基因序列3’端标记的淬灭荧光基团是TAMRA。
全文摘要
用于检测硫酸盐还原菌的引物和荧光探针，它涉及用于检测微生物的引物和探针。它解决了目前SRB菌的定量检测方法存在检测时间长、非特异性高、检测结果偏低的缺陷。上游引物5’－CGCTGAAATGACCATGATGG－3’；下游引物5’－CGCGCATTTCACGAAGC－3’。荧光探针由报告荧光基团、淬灭荧光基团和探针基因序列组成；探针基因序列为5’－CTGAAGCCTTACGAAGATCG－3’，探针基因序列5’端标记的报告荧光基团是FAM，探针基因序列3’端标记的淬灭荧光基团是TAMRA。本发明引物和荧光探针特异性高，使用本发明的引物和荧光探针进行荧光定量PCR检测硫酸盐还原菌，检测时间短、从样本的模板DNA提取到荧光定量PCR检测全过程仅需6h。
文档编号G01N33/52GK101089195SQ20071007233
公开日2007年12月19日 申请日期2007年6月8日 优先权日2007年6月8日
发明者魏利, 马放, 李维国 申请人:哈尔滨工业大学