专利名称：一种雪莲紫丁香甙的制备方法
技术领域：
本发明属于植物细胞工程领域，具体地说涉及一种雪莲紫丁香甙的制备方法。
背景技术：
雪莲花又名雪莲，是我国三类珍稀植物，早在《西北域记》和《相园小识》中，就有关于雪莲的记载，并把二者合而为一，统称雪莲花。作为雪莲花，原生植物名称随产地而别，如西藏等地用三指雪兔子S.tridactylaSch.Bip.；四川、云南等地用绵头雪兔子S.lanicps Hand.-Mazz.；甘肃、青海等地用水母雪莲S.medusa Maxim；青海也用雪兔子S.gossypiphora D.Don.；新疆用天山雪莲(雪荷花)S.involucrata Kar.et Kir，等，但均属于菊科风毛菊属Saussurea雪兔子亚属Subgen Eriocorye植物，且一般分布于海拔4,000米以上的高山流石滩上。
雪莲花是生长在海拔4000米以上的高山雪线附近的民间常用的一类名贵药用植物，属多年生草本植物。雪莲花性温，味微苦，入肝、脾、肾三经。具有散寒除湿，活血通经、强筋助阳、抗炎、镇痛、收缩子宫等功能，民间用于治疗风湿性关节炎，延缓衰老、动脉硬化、终止妊娠，妇女小腹冷痛、闭经、胎衣不下、麻疹不透、肺寒咳嗽、阳萎等症。雪莲花原生植物种类较多，虽然据中药文献记载均可同等入药，但其品质有优劣之分。据有关报道，在以上几种雪莲中销售量最大的是新疆天山雪莲(雪荷花)S.involucrata Kar.et Kir.和水母雪莲S.medusa Maxim。而水母雪莲(Saussurea medusa Maxim.)是藏药“雪莲”药材的原植物，分布在我国青海、甘肃、西藏等地。水母雪莲是藏药中的名贵药材，具有散寒除湿、活血通络、抗癌、抗炎及抗疲劳等功效，可治疗风湿性关节炎、妇女月经不调、痈疮肿毒和高山不适应等多种疾病。
雪莲为多年生草本植物，自然生长缓慢，采集野生雪莲入药对野生资源具有严重的破坏而且还会造成对资源生态环境的破坏。为此，我国早已将雪莲列为国家三级保护植物。紫丁香甙(Syringin)为野生雪莲中有效成分之一，属于苯丙素类化合物。药理研究表明，紫丁香甙有抗疲劳、促性腺、抗辐射及止血作用。但在野生水母雪莲中只占干重的0.02％左右。在其他天然药用植物中不超过1.0％(其中紫丁香甙含量较高的刺五加原植物中约为0.5％)。为此，迫切需要解决药用雪莲资源问题。现代生物技术的运用使大规模细胞培养技术生产植物次生代谢物成为可能。可是目前尚未见到有关用雪莲细胞培养高产紫丁香甙这方面的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种雪莲紫丁香甙的制备方法，以达到产业化生产雪莲紫丁香甙化合物的目的。
为实现上述目的，本发明的主要制备步骤是1.雪莲愈伤组织诱导及细胞系的建立采集雪莲外植体，如叶、花、茎或用种子萌发幼苗，在含有浓度为0.01-3.0mg/L激素的1/2MS培养基上诱导愈伤组织；愈伤组织在含上述激素的MS培养基上继代培养；获得雪莲紫丁香甙的细胞系。
本发明采用的激素包括NAAα-奈乙酸；IAA吲哚乙酸；BA6-苄基嘌呤；KT激动素；2，4-D2，4-二氯苯氧乙酸。上述激素优选0.05-0.1mg/L的BA与0.5-1mg/L的NAA组合。
每次细胞继代用目测法挑选颜色最鲜艳的细胞接种。
2.雪莲紫丁香甙细胞系的细胞固体或悬浮液体培养生产紫丁香甙化合物固体培养雪莲细胞接种于含有浓度为0.01-3.0mg/L激素(NAA、IAA、2，4-D、KT或/和BA)的MS培养基中，加入0.6-0.8重量％的琼脂，pH值在5.8(灭菌前)，接种量为50(±1)g·FW/L；接种后放入光培养室(光强60μmolm-2s-1)中培养10-11天，温度为25(±2)℃进行培养。
悬浮培养于不加琼脂的MS培养基中，接种量为50(±1)g·FW/L，其他条件同固体培养，摇床转速80-110r/min。
3.雪莲紫丁香甙化合物的分离提取及高效液相色谱(HPLC)测定
收集步骤2得到的雪莲细胞培养物，置于干燥器中，室温至40℃温和烘干至恒重后，用粉碎机粉碎成16-24目的粉状，用乙醇或正丁醇(较佳的是70％乙醇)浸泡16-24小时，离心、沉淀，上清液过滤，得到含紫丁香甙的提取液。
高效液相色谱(HPLC)测定紫丁香甙含量以反相C18为分离柱子，磷酸(pH2)缓冲液和甲醇(分析醇)为分离相。分离梯度甲醇比例3min(0％)，5min(10％)，15min(20％)，25min(20％)。流速为1mL/min，光电二极管阵列检测器(DVD)检测紫丁香甙在270nm处有强吸收，且其他物质的吸收干扰极小。
本发明提供的细胞系和培养基，其细胞生长速率可达15-22g·DW/L，紫丁香甙含量达到水母雪莲细胞干重的3-4％，400-900mg/L。比野生水母雪莲高150-200倍。
本发明较已有技术相比具有如下优点及积极效果1)雪莲为国家保护植物，利用植物细胞大量培养生产雪莲紫丁香甙，走工业化生产的途径，可有限地保护野生资源，保护生态环境。
2)应用细胞大量培养生产紫丁香甙，与栽培和野生的植物相比，可获得稳定的质量和产量，不受自然条件的限制的影响。
3)不占用耕地面积，只需要占用有限的厂房和培养室。
4)通过人工调节与控制细胞的生长和次生产物的合成；可极大地提高紫丁香甙化合物的产量5)该项技术，细胞培养周期短，生长迅速，紫丁香甙产率高。
图1为本发明培养的细胞与野生水母雪莲紫丁香甙含量比较。
图2为本发明培养的水母雪莲紫丁香甙悬浮细胞系。
图3为本发明培养的水母雪莲紫丁香甙固体细胞系。
图4为紫丁香甙标准品HPLC图谱(0.0625mg/mL)。
图5为本发明培养的细胞系紫丁香甙HPLC图谱。
具体实施例方式
为了更好理解本发明，通过如下实施例予以进一步说明，但并非是对本发明的限定。
本实施例是优选水母雪莲(Saussurea medusa)为例对本发明予以说明，同时，本实施例的技术方案也适用于其他雪莲的细胞培养。
雪莲愈伤组织诱导及细胞系的建立采集雪莲外植体，如叶、花、茎或用种子萌发幼苗诱导愈伤组织。外植体先用自来水冲洗数1hr，然后用杀菌剂浸泡杀菌，用无菌水洗5-6次，每次2-3分钟，消毒后接种于如表1所示的含激素的MS培养基上，置于25(±2)℃光照培养。经两周培养后，即可在外植体的切口部位形成愈伤组织。愈伤组织在于如表1所示的含激素的MS培养基上继代培养，培养温度为25(±2)℃，在有光照条件下可以获得雪莲高产紫丁香甙细胞系。继代培养为11天转代一次，继代培养用目测法选择颜色最鲜艳的细胞接种；选取红色愈伤组织细胞系为高产雪莲紫丁香甙的细胞系，结果如表2。
雪莲高产紫丁香甙细胞系的细胞固体或悬浮液体培养物紫丁香甙化合物的分离、提取、制备工艺雪莲细胞接种于如表1所示的含有激素的MS培养基中，pH值在5.8(灭菌前)，固体培养时，培养基中加入0.6-0.8％琼脂。培养基高压消毒后，接种，接种量为50(±1)g·FW/L；接种后放入光培养室中培养11天，温度为25±2℃；进行培养。图2和图3所示分别为本发明水母雪莲紫丁香甙悬浮细胞系和固体细胞系。
收集雪莲细胞培养物，置于干燥器中，40℃温和烘干至恒重后，用粉碎机粉碎成20目粉状。用70％乙醇混匀浸泡提取24个小时后，12000G，10min高速离心，上清液过滤后即为含紫丁香甙提取液。
用HPLC测定紫丁香甙含量以反相C18为分离柱子，磷酸(pH2)缓冲液和甲醇(分析醇)为分离相。分离梯度甲醇比例3min(0％)，5min(10％)，15min(20％)，25min(20％)。流速1mL/min。光电二极管阵列检测器(DVD)检测270nm有强吸收。330nm无吸收，此峰即为紫丁香甙。检测所用的标准图谱和样品图谱如4和图5所示本发明使用的MS培养基，蔗糖浓度为10～40g/L(最佳30g/L)，调pH值为5.2-6(最佳5.8)，琼脂浓度为0.6-0.8％(最佳0.7％)。用100ml三角瓶，每瓶装培养液30ml。高压消毒，压力为1.0kg/CM2，20min。接入高产紫丁香甙细胞系，接种量为50(±1)g·FW/L，放入光照培养室培养，温度为25±20℃。培养11天后每瓶鲜重可达12g(悬浮培养11天，每瓶鲜重可达10g)。细胞培养物中的紫丁香甙经分离提取后，并与天然植株中提取的紫丁香甙化合物进行对照结果如图1。
表1.MS培养基成分组成
本发明用来诱导愈伤组织的1/2MS培养基上添加的激素浓度没有特别严格的限定，可以在0.01-3.0mg/L范围内以不同浓度分别组合，实验证明0.05-0.1mg/L的BA与0.5-1mg/L的NAA的组合为最佳。
本发明用来固体培养愈伤组织的MS培养基上添加的琼脂粉为0.7重量％；激素的浓度没有特别严格的限定，可以在0.01-3.0mg/L范围内以不同浓度分别组合，实验证明0.5mg/L的BA与2mg/L的NAA的组合为最佳。
本发明用来悬浮培养细胞的MS培养基上添加的激素，其浓度没有严格限定，可以在0.01-3.0mg/L范围内以不同浓度分别组合，实验证明0.5mg/L的BA与2mg/L的NAA的组合为最佳。
表2 水母雪莲细胞黄色系与红色系含量及特征性的比较
权利要求
1.一种雪莲紫丁香甙的细胞培养生产方法，主要步骤是a)采用雪莲外植体或用种子萌发幼苗，在含有浓度为0.01-3.0mg/L激素的1/2MS培养基上诱导愈伤组织；b)愈伤组织在含上述浓度激素的MS培养基上继代培养，获得雪莲紫丁香甙细胞系；c)雪莲紫丁香甙细胞接种于含有浓度为0.01-3.0mg/L激素的MS培养基中，加入0.6-0.8重量％的琼脂，灭菌前pH值为5.8，接种量为50±1g·FW/L；接种后放入光培养室中，温度为25±2℃进行固体培养；或雪莲细胞接种于含有浓度为0.01-3.0mg/L激素的MS培养基中，灭菌前pH值为5.8，接种量为50±1g·FW/L，接种后放入光培养室中，温度为25±2℃，摇床转速80-110r/min进行悬浮液体培养；d)收集步骤c得到的雪莲细胞培养物，置于干燥器中，室温至40℃烘干至恒重，粉碎成16-24目的粉状，用乙醇或正丁醇浸泡16-24小时，沉淀取上清液，得到含紫丁香甙的提取液；所述的激素为α-奈乙酸、吲哚乙酸、6-苄基嘌呤、激动素或/和2，4-二氯苯氧乙酸。
2.权利要求1的方法，其特征在于，步骤a的雪莲外植体为雪莲的叶、花或/和茎。
3.权利要求1的方法，其特征在于，步骤a的激素和浓度为0.05-0.1mg/L的6-苄基嘌呤与0.5-1mg/L的α-奈乙酸的组合。
4.权利要求1的方法，其特征在于，步骤b的激素和浓度为0.5mg/L的6-苄基嘌呤与2mg/L的α-奈乙酸的组合。
5.权利要求1的方法，其特征在于，步骤b的继代培养用目测法选择颜色最鲜艳的细胞接种。
6.权利要求1的方法，其特征在于，步骤c的光培养室培养周期悬浮培养为10-12天，固体培养为13-15天。
7.权利要求1的方法，其特征在于，步骤d的浸泡是用70％乙醇。
8.权利要求1的方法，其特征在于，步骤d的沉淀是用离心沉淀。
9.权利要求1的方法，其特征在于，步骤d的上清液再进一步过滤。
全文摘要
一种雪莲紫丁香甙的细胞培养生产方法，该方法步骤涉及采用雪莲外植体或用种子萌发幼苗在1/2MS培养基上诱导愈伤组织，该愈伤组织细胞用于生产雪莲紫丁香甙；产雪莲紫丁香甙细胞的固体或悬浮培养使用的培养基是MS培养基；用70％乙醇或正丁醇进行雪莲细胞培养物紫丁香甙的分离、提取和制备；用HPLC测定紫丁香甙含量。本方法的细胞培养物中总紫丁香甙化合物的含量为细胞干重的3－4％，紫丁香甙生产率为400－900mg/L。
文档编号C12N5/04GK1814748SQ20051001129
公开日2006年8月9日 申请日期2005年2月3日 优先权日2005年2月3日
发明者赵德修, 虞珍珍, 付春祥 申请人:中国科学院植物研究所